CC BY
129
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 616.127-005.8-002.1:577.23
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА АПОПТОЗА ПРИ ОСТРОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА
В.В. Новиков, С.С. Белоусов, А.Н. Кузнецов, Б.Е. Шахов, Н.В. Ерошевская,
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»,
ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Белоусов Сергей Сергеевич - e-mail: [email protected]
С целью изучения экспрессии генов апоптоза при остром инфаркте миокарда проведено исследование уровня экспрессии генов Fas у 19 больных крупноочаговым инфарктом в раннем периоде инфаркта и 18 здоровых людей (группа контроля). 14 больных составили группу, в которой
больным проведен 10-дневный курс лечения препаратом левокарнитин («Элькар») и у которых наблюдалась динамика экспрессии генов под влиянием проведенного лечения. Экспрессия генов Fas определялась с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПШР-РВ) и программы REST путём межгруппового сравнения содержания в крови мРНК генов Fas. Установлено значительное повышение экспрессии гена sFas, восьмикратно превышающее показатель нормы с первых дней развившегося инфаркта. Также повышенной была экспрессия гена mFas - на 37%. В ходе лечения Элькаром у больных происходила нормализация уровня экспрессии генов, хотя в полной мере нормализации за этот срок не произошло. Обсуждены вопросы использованного метода и препарата «Элькар» в практической медицине.
Ключевые слова: инфаркт миокарда, гены апоптоза mFas и sFas.
The expression of genes mFas and sFas was investigated de patients with acute Q-myocardial infarction. To evaluate the expression the PCR-RT method and statistical program REST was performed. The comparison between groops of healthies (group of control) and patients shows the difference of expression of gene mFas and sFas: the level of sFas is much higher in group of patients with acute myocardial infarction as in group of healthiers. The adduction of Levocarnitine to usual treatment lead to decrease of expression of Fas genes.
Key words: myocardial infarction, apoptosis, fas-genes.
Апоптоз миокарда при инфаркте миокарда играет ключевую роль в развитии структурных и функциональных нарушений сердечной деятельности (сократимости миокарда, сердечной недостаточности, аритмогенезу, тромбогенезу, ремоделированию левого желудочка в раннем и постинфарктном периодах, инвалидизации больных на поздних стадиях).
Ингибиция апоптоза, который может продолжаться на протяжении недель и месяцев, как показывают исследования последних лет, ведёт к сокращению зоны инфаркта, предупреждает многие осложнения инфаркта, снижает летальные исходы и поэтому является целевой задачей лечения.
Возникновение и течение апоптоза связано с нарушениями в генной регуляции биологических процессов в клетке, молекулярно-иммунологическим воспалением в миокарде и сосудистой системе (эндотелии, интиме, проводящей системе, миоцитах). Ингибиция апоптоза предупре-
ждает реперфузионный синдром, улучшает локальную сократимость (асинергию) желудочка, повышает коронарный кровоток, что продемонстрировано в экспериментальных условий и при длительных приёмах анти-апоптотических препаратов - в клинических условиях у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) [1-4]. Несомненно, перспективы внедрения новых методов терапии при ИБС и инфаркте миокарда, основанных на ингибиции апоптоза, являются привлекательными для практического использования, в клинической практике.
Современные методы лечения при инфарктах миокарда не позволяют всегда добиваться оптимального эффекта: смертность при острых инфарктах и его осложнениях продолжает оставаться значительной. Особое положение сохраняется в нашей стране, занимающей одно из первых мест в рейтинге ВОЗ по уровню смертности при инфаркте миокарда. Большой проблемой являются также вопросы профилактики ИБС и инфаркта, реабилитации больных.
Отдельные успехи, в области хирургии при ИБС и инфаркте не решают глобальных вопросов профилактики и лечения этих заболеваний. Совершенствование диагностики, поиски новых мер и способов лечения и в настоящее время являются актуальной задачей кардиологии и медицины в целом.
Следует отметить, что среди других видов лечения инфарктов и его последствий набирает силу генная терапия, генная инженерия, которые могут решать вопросы репарации поражений сердечной мышцы путём использования стволовых клеток или введения генов в сердечную мышцу или коронарные артерии. Основные работы по изучению активности (экспрессии) генов, связанных с развитием апоптоза миокарда, до настоящего времени изучались на экспериментальных моделях или патологоанатомических тканевых материалах. Клинических исследований немного, т. к. отсутствовали методы диагностики, пригодные для использования в клинических условиях. Апробация новых методов генетических исследований и их проверка в клинике является важной задачей кардиологии, имеющей большое значение для развития медицины будущего.
Задача настоящей работы состояла в изучении экспрессии гена основного пути развития апоптоза - Fas-зависимого пути - с помощью метода ПЦР-РТ, открытого Карри Маллисом (Нобелевская премия 1993 г.), который дал возможность количественно оценивать экспрессию генов, в том числе гена mFas в крови и его растворимой формы sFas, от которых зависят сигналы, отправляющие клетки в апоптоз. Кроме этого, появилась возможность фармакологического контроля активности генов под влиянием лечения, что и стало задачей исследования на примере лечения больных препаратом «Элькар».
Основанием для начала работы послужили исследования растворимых дифференцировочных антигенов в крови больных инфарктом миокарда в острую фазу болезни, которые ассоциированы с апоптозом (sFas, sICAM, sCD38 и др.), уровни которых были повышены в крови больных этой категории, что свидетельствует о процессах апоптоза, текущих в миокарде и сохраняющихся на протяжении от нескольких недель до нескольких месяцев [5].
Данная работа проведена в рамках межвузовского кооперативного исследования на основе договора между Нижегородской государственной медицинской академией и Нижегородским государственным университетом им. Н.И. Лобачевского.
Все анализы экспрессии генов проведены в лаборатории НИИ молекулярной иммунологии и региональной экологии (директор - проф. В.В. Новиков).
Материалы и методы
Для оценки процессов, связанных с индукцией гена апоптоза, мы анализировали экспрессию генов Fas-зависимого пути (гена mFas) в крови больных инфарктом миокарда по уровню мРНК этого гена, который зависит от количества гена в клетках и его растворимой формы - sFas. Мы считали важным выбор именно этого гена, т. к. в условиях острой сердечной патологии вектор генной экспрессии может существенно изменяться во времени, а знание её динамики важно для оптимизации лечебной тактики.
Определение экспрессии гена Fas апоптоза проводилось с помощью аппарата АНК 32 и компьютерной программы
REST (Relative Expression Software Tool) - программы для расчёта относительной (межгрупповой) экспрессии генов, разработанной группой программистов из Англии и Германии (M. Pfaffl, G. Horgan, L. Dempfle, 2009), имеющейся в открытом доступе [6, 7].
С помощью этой методики было обследовано 19 больных острым Q-инфарктом миокарда и 18 здоровых (доноров). Обследованные лица были разбиты на три группы: 1-я группа (Г1) была составлена из 18 здоровых лиц возрастного интервала 17-54 лет (мужчин - 8, женщин - 10 человек), которая служила группой сравнения.
Вторая группа (Г-2) состояла из больных острым инфарктом миокарда давностью не более 1-3 дней после начала болевого приступа, поступивших в кардиологический центр больницы № 5 (19 человек больных Q-инфарктом), которым после подтверждения диагноза и проведения повторных ЭКГ, Эхо КГ, лабораторного подтверждёния некроза (тропонин I, КФК-MB) проводился забор крови на анализ экспрессии генов. Среди больных этой группы мужчин было 11 человек, женщин - 8. Возраст больных составил (М)=56±6 лет.
Лечение больных в стационаре проводилось в соответствии с принятыми в настоящее время стандартами лечения инфаркта миокарда. Ряду больных (7 чел.) перед началом стационарного лечения провeдена тромболитическая терапия (метализе).
В третью группу были включены 15 больных, получавших 10-дневный курс лечения стандартной терапии инфаркта, дополненной курсовым применением L-карнитина (Элькара) в дозе 6 грамм в сутки в виде в/в введения препарата по 3,0 г дважды в день, а с 4-го дня переводившихся на пероральное лечение в суточной дозе 6 г. По окончании курса производился повторный забор крови для анализа экспрессии генов и оценки влияния лечения на экспрессию генов.
Результаты исследования
Вычисленная по программе REST среднегрупповая относительная экспрессия гена sFas у больных инфарктом по сравнению с аналогичным показателем группы контроля (здоровых) оказалась повышенной в 8,12 раз (p=0,012), в 95% доверительного интервала (0,371-3100), что соответствует данным об уровне sFas, полученным на основании исследования уровня дифференцировочных антигенов методом ELISA, проведённым ранее. Что касается экспрессии гена mFas, то она также была повышена относительно экспрессии этого гена в группе здоровых на 35,7% (р=0,579). Эти данные получены при соотношении показателей генной экспрессии с принятым за 1,0 уровнем референтного гена (уровнем убиквитинового гена), принимавшегося за эталон (рис. 1).
Как отмечалось выше, одной из задач работы была возможность контроля генной экспрессии путём фармакологической терапии. С этой целью у 15 больных острым инфарктом миокарда оценивался уровень экспрессии до и после 10-дневного курса терапии больных препаратом L-карнитин (Элькар), обладающего способностью ингибировать апоптоз [8, 9].У обследованных больных была отмечена динамика экспрессии генов по сравнению с исходными показателями: уровень относительной экспрессии mFas в конце лечения составлял 54% от исходно-
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
го уровня (т. е. снизился на 46%). Уровень БРаБ также понизился по сравнению с исходным уровнем с 8,125 до 3,32 (т. е. на 60%) (рис. 2).
Следует отметить, что Элькар хорошо переносился в применённых дозах, побочных и нежелательных его проявлений зарегистрировано не было. Летальный исход - 1, больная скончалась на второй день пребывания в стационаре.
Обсуждение и заключение
Проведённые исследования показали, что развитие некроза миокарда (инфаркта) сопровождается молекулярно-иммунологическими и генетическими реакциями. Нами показано значительное повышение экспрессии гена апоптоза БРаБ и, в меньшей степени, экспрессии гена тРаБ. С этим, возможно, связана продолжительность апоптоза миокарда, наблюдаемая в постинфарктном периоде, по некоторым данным до одного-двух месяцев, о
чём свидетельствуют морфологические данные Baldi et al., Оливетти et al., Byondi-Zoccai и ряда др. [5] и в том числе наши данные по апоптоз-ассоциированным изменениям дифференцировочных антигенов (sFas,CD 54, CD 38 и др.).
В связи с тем, что ингибиция апоптоза миокарда при инфаркте миокарда способна оказывать кардиопротек-тивное действие, тормозить или предупреждать ремоделирование левого желудочка в постинфарктном периоде, возможно оценивать этот эффект с помощью эхокардиографического метода, дающего информацию о ходе ремоделирования. Наиболее крупное исследование проведено итальянскими кардиологами в ходе лечения больных инфарктом миокарда препаратом L-карнитин (исследование CEDIM 1 и 2). S. Iliceto et al. и G. Та^п^т et al. показали, что лечение L-карнитином препятствует ремоделированию левого желудочка и развитию сердечной недостаточности по сравнению с больными, не получавшими этого лечения. Эти данные косвенным путём подтверждают способность Элькара тормозить развитие и течение апоптоза миокарда в постинфарктном периоде [4].
Наши данные, изложенные в настоящей статье, показали, что включение в лечение острого инфаркта препарата «Элькар», обладающего способностью тормозить развитие апоптоза, действует в числе прочего и на генетическом уровне, нормализуя экспрессию генов апоптоза mFas и sFas. Изложенные в статье факты, надеемся, будут полезны для разработки и обоснования новых подходов к терапии острого инфаркта миокарда, профилактики осложнений инфаркта в острую и постинфарктную фазы болезни и прогнозирования исходов.
Ранняя фибринолитическая терапия инфаркта с использованием современных тромболитиков типа метализе удобна, относительно безопасна и применяется в настоящее время на догоспитальном этапе лечения инфаркта и является высокоэффективной, но только в первые 8-12 часов.
Однако, данные статистики показывают, что обращение больных за медицинской помощью во всех регионах страны в значительном числе случаев происходит поздно, когда не приходится рассчитывать на хороший эффект. Кроме этого, не всегда в наличии имеются лучшие и эффективные препараты или специалисты, которые проводят эти процедуры (например, в отдалённых районах). Раннее применение ингибиции апоптоза с целью сохранения сократительного миокарда и улучшения общих результатов лечения может быть альтернативой тромболитикам, Элькар пополняет список фармакологических препаратов, ингибирующих апоптоз, предупреждающих ремоделирование желудочка и сердечную недостаточность. Дальнейшие исследования в этом направлении должны быть продолжены, учитывая важность проблемы для кардиологии и медицины и открывающиеся новые перспективы в лечении инфаркта миокарда.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Белушкина Н.Н. Роль апоптоза в патогенезе заболеваний. URL: http://:www .science-faculty.net.ru/lec/apoptosis.htm
2. Rabkin S.W. Apoptosis in acute myocardial infarction Scolarly research exchange. V. 2009. art D 978318 .
РИС. 1.
Относительная экспрессия генов mFas и sFas в группах больных инфарктом миокарда по сравнению с группой здоровых (REST). Примечание: пунктирные линии внутри квадратов на схеме 1 и 2 маркируют уровень средней величины медии (средней).
РИС. 2.
Экспрессия генов апоптоза mFasR и sFasL в группе больных инфарктом миокарда по программе REST после лечении.
3. Benett М. Apoptosis in cardiovascular system. Heart. 2002. № 87 (5). Р. 48.
4. Илисето С., Скрутинио Д., Друзи П. и др. Эффект приёма L-карнитина при восстановлении левого желудочка после острого инфаркта миокарда. Medi.ru Пик-Фарма Элькар. Doc/a030716.htm.
5. Лишневская В.Ю., Коберник Н.Н. Корвазан в лечении пациентов пожилого возроста с сердечной недостаточностью, перенесших инфаркт миокарда. Новости медицины и фармации. 2008. № 10. 245 с.
6. Anversa P., Kaj stu ra J. Myosyte cell death in diseased heart. Circul. Res. 1998. № 82. P. 1231-132.
7. Pfaffl M., Korgan G., Dempfle L. Relative Expession Software Tool (REST) for group-wise comparison and statistical analyses of relative expression ults in reeal time PCR. Nuclear acids research. 2002. V. 30. P. 36.
8. REST. 2009. User guide.
9. Ferrari R. (ed.) L-carnitine and its role in medicine from functitt to therapy. 1992.
