CC BY
32DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-31-93-101 УДК 577.218; 577.215.3; 579.258
А. И. Левданская, А. С. Светлова, Н. П. Максимова, Е. Г. Веремеенко
ЭКСПРЕССИЯ ФЕНАЗИНОВОГО ОПЕРОНА У ШТАММОВ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SUBSP. AURANTIACA B-162, СПОСОБНЫХ К СВЕРХСИНТЕЗУ ФЕНАЗИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Белорусский государственный университет Республика Беларусь, 220030, г. Минск, пр-т. Независимости, 4 e-mail: tassigo@gmail.com
Для бактерии Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca B-162 (дикий тип) и двух мутантных штаммов B-162/255 и B-162/17, способных к сверхпродукции феназинов, была проведена количественная оценка экспрессии генов phz-оперона при культивировании бактерий на полноценной (ПСА) и минимальной (М9) питательных средах в разные фазы роста культуры. Было показано, что для P. chlororaphis subsp. aurantiaca наиболее оптимальными референсными генами являются гены, кодирующие пирролин-5-карбоксилат редуктазу (p5cr) и субъединицу А ДНК-гиразы (gyrA). Для штаммов В-162/255 и В-162/17 зарегистрирована обратная связь между уровнями экспрессии геновphzA иphzB. Паттерн экспрессии геновphzC иphzD штамма B-162/17, выращенного на среде М9, заметно отличается от такового у остальных исследуемых штаммов на обеих питательных средах. Для всех исследованных штаммов установлена четкая взаимосвязь между профилем экспрессии phzE-генов и питательной средой. ПЦР-продукты генов phzF и phzG у штамма B-162/255 зафиксированы с 12 до 18 ч культивирования, у штамма B-162/17 — только на 4-6 сут, хотя для штамма B-162 экспрессия данных генов в исследуемых временных точках не обнаружена.
Ключевые слова: феназиновый оперон, экспрессия генов, Pseudomonas, феназины.
Введение
Бактерии рода Pseudomonas синтезируют широкий спектр биологически активных метаболитов. Одним из наиболее интересных вторичных метаболитов Pseudomonas являются феназины — большая группа азотсодержащих гетероциклических соединений, различающихся по химическим и физическим свойствам [1]. Разнообразие характеристик и свойств данных соединений способствует их применению в промышленности, сельском хозяйстве и медицине [2, 3]. Образование фена-зинов происходит в ходе реакций шикиматного метаболического пути. Кроме феназиновых соединений в процессе реакций синтеза ши-кимовой кислоты образуются ароматические аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин и триптофан, а так же сидерофоры (желе-зо-транспортирующие белки) и хиноны [1, 4].
Детальная расшифровка биосинтетическо-
го пути синтеза феназинов стала возможна, когда были секвенированы гены, кодирующие белки, участвующие в этом процессе у бактерий штаммов Pseudomonas aureofaciens и Pseudomonas fluorescens [4]. Это позволило обнаружить оперон с семью генами, phzABCDEFG, ответственный за образование основного феназинового соединения — феназин-1-карбоксилата (рис. 1). Последующие модификации феназин-1-карбоксилата дают все разнообразие известных на сегодняшний день феназиновых соединений. У обоих микроорганизмов phz-оперон присутствовал в двух копиях, каждая из которых была активна. Более поздние эксперименты продемонстрировали присутствие phz-оперонов и у многих других бактерий рода Pseudomonas, а также Brevibacterium, Erwinia, Burkholderia и др [1].
Установлено, что для синтеза феназин-1-
fi-in phzC 2pltzDl phzE
i.T&fe—
Рис. 1. Схема организации феназинового (phz-) оперона
карбоксилата требуются продукты шести генов — phzA/В, phzD, phzE, phzF, и phzG. Причем гены phzA иphzB представляют собой результат дупликации (сходство последовательностей на 80%) и последующей конвергенции, благодаря появлению двух мутаций в участке гена, кодирующем активный центр фермента. Ген phzC кодирует один из ключевых ферментов шикиматного пути — 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфат-синтазу (ДАГФ-синтазу), которая катализирует первую реакцию этого пути: взаимодействие фосфоенолпирувата и эритрозо-4-фосфата [5]. В состав феназинового оперона также входят
дополнительные гены, вовлеченные в его регуляцию на уровне транскрипции (phzI и phzR). Ген, ответственный за модификацию феназин-1-карбоксильной кислоты (phzH), как правило, располагается за пределами оперона, но составляет с ним общий регулон [6].
В геноме бактерии Р. chlororaphis subsp. аигапйаса В-162 была обнаружена только одна копия phz-оперона [7]. На основе данного штамма путем химического мутагенеза на кафедре генетики БГУ были получены мутант-ные штаммы (рис. 2), способные к сверхсинтезу феназинов [8, 9].
Уровень продукции феназинов у штамма
химический мутагенез селекция на устойчивость к m -фторфшн л ал ан ин у
/* chlororaphis subsp.
aurantiacu В-162 ■
(ли км м nui)
Уровень продукции феначинон 75±. IS иг/л
!
Р, chlororaphis subsp. au fan tin ca В-16 2/2 55 (мутант)
Уровень продукции феназинов 420-30 мг/л
химический мутагенез селекция на способность к синтезу феназинов иа минимальной среде
И. chlororaphis subsp. - a liraп tiaса В-162/17
П1П J
I
(мута ht)
Уровень продукции феназинов 210±25 мг/л
Рис. 2. Схема мутагенеза для получения исследуемых штаммов
В-162/255 на продукционной среде для антибиотиков (ПСА) составлял около 420 ± 30 мг/л, в то время как у полученного из него мутанта B-162/17 уровень продукции феназинов составлял 210 ± 25 мг/л. Однако характерной особенностью последнего штамма является приобретенная им в результате мутагенеза способность синтезировать феназиновые соединения на минимальной среде (М9) на том же уровне, что и на ПСА [8, 9]. Следует отметить, что бактерии рода Pseudomonas, ранее описанные в литературе, вообще не способны синтезировать феназины на минимальных средах.
В ходе сравнительного анализа геномов данных бактерий не было обнаружено мутаций в нуклеотидных последовательностях их феназиновых оперонов. Было сделано предположение, что разный уровень продукции феназинов у исследуемых мутантных штаммов P chlororaphis subsp. aurantiaca, может быть обусловлен изменениями в механизмах экспрессии phz-оперона на разных стадиях роста бактерий на полноценной и минимальной средах.
Материалы и методы
В исследовании использовались бактерии P. chlororaphis subsp. aurantiaca B-162 дикого типа из коллекции кафедры генетики, а также мутанты, полученные на его основе: P. chlororaphis subsp. aurantiaca B-162/255 и P. chlororaphis subsp. aurantiaca B-162/17. Бактерии культивировали при 28 °С.
Концентрацию бактерий, выращенных в жидких средах, определяли с помощью спектрофотометра Cary60 (Aglient Technologies, США) при длине волны 600 нм. Одинаковое количество клеток инокулировали в 2 мл среды М9 и ПСА для получения культуры в log-фазе роста.
Для остановки биосинтетических процессов в клетках перед выделением РНК к ним добавляли 400 мкл смеси фенол:этанол (1:20), после чего производили инкубацию на льду в течение 30 мин. Клетки осаждали 2 мин при 10 000 об/мин и к полученному осадку добавляли ExtractRNA Reagent (Евроген, Россия). Выделение тотальной РНК проводили согласно протоколу фирмы Евроген. Примеси ДНК удаляли с помощью DNAsel (New England
BioLabs, Великобритания).
Разбавленную в 100 раз РНК измеряли на спектрофотометре Cary60 (Aglient Technologies, США) при длинах волн 260, 280 и 320 нм. Концентрацию РНК определяли по формуле: (Х260 - Х320) х 100 х 40. Оценку чистоты РНК производили по формуле: Х260 / Х280 [10]. Полученные результаты по оценке чистоты входили в диапазон 1,8-2,0, что свидетельствовало о пригодности полученного препарата РНК для проведения дальнейших манипуляций.
Обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы ProtoScript II (New England BioLabs, Великобритания). Для
Результаты количественной ПЦР визуализировали с помощью программы Bio-Rad CFX Manager 3.1. Выбор референсных генов для определения экспрессии феназинового
реакции использовался 1 мкг РНК.
Количественную ПЦР проводили на ам-плификаторе Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США) с помощью реагента ArtMixColor (АртБиоТех, Беларусь). Для реакции в качестве матрицы на 20 мкл смеси использовали по 2 мкл разбавленной в пять раз кДНК, полученной в результате обратной транскрипции. В таблице 1 представлены праймеры, которые были использованы в исследованиях. Температура отжига всех праймеров составляла 50 °С. Остальные температуры для проведения количественной ПЦР и длительность инкубаций устанавливались в соответствии с протоколом, предложенным фирмой АртБиоТех.
оперона производили с помощью программы geNorm (https://genorm.cmgg.be). Эффективность амплификации определяли при помощи программы LinReg PCR v.2017.1. Далее
Таблица 1
Последовательности праймеров, используемых в количественной ПЦР
Мишень Последовательности праймеров Ожидаемый размер фрагмента, п. о.
rpoD rpoD-F: TCTGGTGATCTCCATCGC rpoD-R: CGAGAATTTGTAGCCGCG 130
p5cr p5cr-F: AGGCGCAAGAACTGCTGT p5cr-R: TCATGGCTTCGATCAGCAG 126
gyrA gyrA-F: TAGAGGTTGTTGAGGATCAC gyrA-R: GAGCTGGTCAAGGAGAAG 128
16S 16S-F: AGAAAGCAGGGGACCTTC 16S-R: CCGTGTCTCAGTTCCAGT 140
phzA phzA-F: GCTTCGCTTTCCCCTAGC phzA-R: GTTTCGGTGTTCCAGGAACC 158
phzB phzB-F: AACCACTTCCTGCACTCCTTC phzB-R: TAAGTTGGAATGCCTTCGCG 134
phzC phzC-F: GTCAGCGAGTGCGCTTC phzC-R: AAGGGTTGAGGTGGGCTG 140
phzD phzD-F: TGCTGGAACGCATGCGTG phzD-R: TCCTTGCTGAAGTCGGCGAT 154
phzE phzE-F: CCATCAGGTGCTGAGCTTG phzE-R: CCAGGCGGTCACTCG 152
phzF phzF-F: AGCTTCCACGACATGGCCA phzF-R: ATCGCCAAGGGCCCG 129
phzG phzG-F: AACGCCGCCAGGGAAC phzG-R: GTCATAGCGCAAGCGTTCATG 139
относительная экспрессия определялась по формуле Пфаффла;
где ЯЕ — относительная экспрессия стыка А по отношению к стыку В;
Ех и — эффективность амплификации для образцов целевого и референсного гена;
Сх и — значения пороговых циклов для образцов целевого и референсного гена.
Результаты и обсуждение
Для определения уровня экспрессии структурных генов феназинового оперона необходимо было подобрать референсные гены, относительно которых проводилась оценка экспрессии целевых генов. Основываясь на работах [11, 12], нами были выбраны 4 гена-кандидата, стабильность экспрессии которых далее анализировались: ген, кодирующий о-фактор РНК-полимеразы RpoD; ген, кодирующий пирролин-5-карбоксилат редуктазу (КФ 1.5.1.2); ген, кодирующий субъединицу А ДНК-гиразы (ЕС 5.99.1.3) и ген, кодирую-
щий 16S рРНК. Подобранные к последовательностям этих генов праймеры обозначены как rpoD, р5сг, gyrA 16S соответственно. Последовательности праймеров представлены в таблице 1.
Для сравнения стабильности экспрессии выбранных референсных генов в качестве матрицы использовали кДНК, полученные на основе РНК бактерий Р. chlororaphis subsp. аигапйаса В-162, В-162/255 и В-162/17 на различных стадиях роста на средах ПСА и М9. Полученные в ходе обсчета результатов экспериментов значения С обрабатывались программой geNorm. Для каждого из референсных генов определялся индекс стабильности экспрессии «М».
Как видно из рисунка 3 данный показатель по всем исследуемым генам попадает в диапазон от 0,5 до 1,5, что говорит о том, что экспрессия всех исследуемых генов достаточно стабильна [13]. Однако для дальнейших исследований были выбраны гены кодирующие пирролин-5-карбоксилат редуктазу (р5сг) и субъединицу А ДНК-гиразы (^гА), как демонстрирующие наименьший показатель М, а следовательно, наиболее стабильно экспрес-сируемые.
Рис. 3. Индекс стабильности экспрессии для анализируемых референсных генов
Для анализа экспрессии генов феназинового выбраны временные точки 12 ч, 18 ч и 24 ч,
оперона штаммы В-162, В-162/255 и В-162/17 которые соответствуют экспоненциальной
культивировали на питательных средах ПСА стадии роста культуры, и две точки 4,5 сут и 6
и М9 на протяжении разного времени. Были сут, которые приходятся на стационарную фа-
О 2 4 6 S СуТОК
Рис. 4. Кривые роста бактерий B-162, B-162/255 и B-162/17 на средах ПСА и М9
зу роста (рис. 4). Известно, что максимальное количество феназинов накапливается именно на 6-е сут культивирования. Однако экспрессия рИг-оперона должна происходить на более ранних стадиях, чтобы обеспечить образование всех необходимых ферментов в достаточных количествах. По нашим сведениям, на сегодняшний день не существует исследований, которые бы позволили ответить на вопросы, когда именно начинается эта экспрессия и каков паттерн экспрессии генов феназинового оперона.
На следующем этапе исследования была проведена проверка качества и работоспособности праймеров для всех генов рИг-оперона на ДНК исследуемых штаммов. Последовательности праймеров и размер ожидаемых ПЦР-продуктов представлены в таблице 1. Как видно из рисунка 5, для каждого из генов оперона были получены фрагменты ожидаемых размеров.
Далее из бактериальных клеток, культивирование которых осуществляли в условиях описанных выше, была выделена РНК. На основе этой РНК была получена кДНК. Последняя, в свою очередь, использовалась для постановки количественной ПЦР для всех генов рИг-оперона. Затем был рассчитан уровень экспрессии генов оперона относительно выбранных референсных генов.
Для штамма В-162, выращенного на сре-
де М9 в выбранных временных точках роста культуры экспрессия генарИгА не была зафиксирована, в то время как уровень экспрессии
1 234567КМ
Рис. 5. Электрофорез ПЦР-продуктов фрагментов генов phz-оперона
Примечание. ПЦР-продукты: 1 — phzA-ген, 2 — phzB-ген, 3 — phzC-ген, 4 — phzD-ген, 5 — phzE-ген, 6 — phzF-ген, 7 — phzG-ген; К — отрицательный контроль, М — маркер молекулярных масс (TriDye™ 1 kb Plus DNA Ladder)
мума к 6 сут культивирования, увеличившись в 6 раз относительно показателя для 12 ч. Уровень экспрессии гена phzC (рис. 6) возрастал параллельно с уровнем экспрессии phzB-гена. Экспрессию генов phzDFG, так же как и экспрессию генаphzA, зафиксировать не удалось. Для phzE-гена был обнаружен волнообразный характер экспрессии (рис. 6). Очень высокий уровень экспрессии phzE наблюдался уже к 12 ч культивирования, однако потом он снижался и полностью исчезал к 24 ч роста культуры, затем снова регистрировался его рост. Достижение пиковых показателей экспрессии данного гена (увеличение экспрессии в 3 раза по сравнению с 12 ч) приходилось на 6 сут культивирования. При культивировании штамма В-162 на питательной среде ПСА в выбранных временных точках роста не удалось зарегистрировать экспрессию геновphzFG. После 18 ч культивирования обнаруживается слабый уровень экспрессии геновphzABD. Интересно, что на более поздних стадиях роста культуры экспрессия данных генов вообще не регистрируется. На среде ПСА phzE-ген демонстрирует высокий уровень экспрессии уже к 12 ч культивирования, а затем уровень постепенно падает, полностью исчезая на 6 сут (рис. 6).
Уровень экспрессии генаphzC, растет в период с 12 ч до 24 ч культивирования, после чего падает, снова возобновляется и плавно растет, достигая максимума к 6 сут культивирования (рис. 6).
Для мутантного штамма В-162/255 на среде М9 наблюдается интересный паттерн экспрессии генов phzAB: к 12 ч уровень экспрессии гена phzB является максимальным, но к 18 ч заметно снижается и в этой же временной точке фиксируется экспрессия phzA-гена. Когда к 24 ч экспрессия гена phzB практически исчезает, ген phzA по-прежнему активен. Далее экспрессия генаphzA больше не регистрируется, тогда как генphzB снова начинает экспрес-сироваться. Ген phzC достигает максимального уровня экспрессии к 12 ч роста культуры. Затем его экспрессия постепенно снижается и снова вырастает к 6 сут культивирования (рис. 6). Экспрессия генов phzDF обнаружена только для 12-ти часовой культуры, причем уровень экспрессии phzD-гена превышает phzF-ген в девять раз. Намного больший уровень экспрессии демонстрирует phzG-ген, который присутствует не только на 12 ч, но и после 18 ч культивирования. Однако на более поздних стадиях роста, как и в случае с генами
оин
зчп
¡ян
ж
рНгС-ген В-162/255
но.»
■ № ■ ПСА
атм шпр.
гзыв -15СЩ -
10СЛ0 ■
В-162/1?
- м» -чс*
(X 100 ¡К 3.« <00 !СС <00 Г 00 сут
рЬхЕ-ген
□т. шцпр
К-162/17
',.« :« !.С0 V« I» №<УТ
(00 пут
Рис. 6. Уровень экспрессии генов рк2С ирк2Е исследуемых штаммов В-162, В-162/255 и В-162/17 на средах
ПСА и М9
pИzDF, мРНК генаpИzG отсутствует. Для гена рИгЕ высокий уровень экспрессии фиксируется уже к 12 ч культивирования, потом снижается к 24 ч роста культуры и снова растет и достигает своего максимума к 4,5 сут, после чего снова постепенно снижается (рис. 6). На среде ПСА у штамма В-162/255 уровни экспрессии всех генов оперона демонстрируют похожий паттерн экспрессии, что и на среде М9.
Для штамма В-162/17 на среде М9 для рИгВ-гена наблюдается рост уровня экспрессии к 18 ч культивирования, после чего экспрессия плавно снижается, в то время как экспрессия гена рИгА регистрируется только на 4,5 сут культивирования, когда аналогичный показатель для гена рИгВ достигает своего минимума. Изменение уровня экспрессии гена рИгС в данном случае напоминает таковое для штамма В-162 на среде ПСА: уровень растет, начиная с 12 ч до 24 ч культивирования (рис. 6). После чего уровень экспрессии падает, а затем снова плавно возрастает к 6 сут культивирования. Экспрессию гена pИzD можно наблюдать на 4,5 и 6-е сут роста бактерии. Уровень экспрессии гена рИгЕ плавно растет, достигая своего максимума к 18 ч культивирования, после чего снижается и снова возрастает к 6 сут (рис. 6). Экспрессию генов pИzFG на данных временных точках роста зарегистрировать не удалось. На среде ПСА снова наблюдается описанная выше взаимосвязь уровней экспрессии генов рИгАВ. Ген рИгС в данном случае так же, как и ген рИгЕ, активно экспрессируется к 12 ч культивирования, после чего показатель уровня экспрессии постепенно снижается и больше не вырастает. Экспрессия генов pИzDFG наблюдается только в стационарной фазе роста культуры.
Заключение
Таким образом, в ходе данного исследования был проведен анализ уровней экспрессии генов рИг-оперона у штаммов бактерий Р. cИlororapИis subsp. атаШаса (В-162, В-162/255 и В-162/17). Было установлено, что оптимальными референсными генами являются гены, кодирующие пирролин-5-карбоксилат редуктазу и субъединицу А ДНК-гиразы.
Для штаммов В-162/255 и В-162/17 зарегистрирована обратная взаимосвязь между уровнями экспрессии геноврИгА ирИгВ: если
наблюдается рост экспрессии одного из этих генов, то экспрессия второго снижается. При этом оба гена активнее экспрессируются в экспоненциальной стадии роста.
Паттерн экспрессии генарИгС, продукт которого является ключевым ферментом шикимат-ного пути и первым ферментом биосинтеза фе-назинов, существенно отличается у всех трех штаммов. Примечательно то, что на среде М9 уровень экспрессии этого гена у мутантных штаммов существенно выше, чем у штамма дикого типа. Если начальные уровни экспрессии рИгС у В-162 и В-162/255 относительно невысоки, то у штамма В-162/17, способного синтезировать феназины на минимальных средах, этот показатель существенно выше. Возможно, это и является одной из предпосылок приобретения такого рода способности. На среде ПСА уровень экспрессии рИгС-гена демонстрирует значительные флуктуации, которые не характерны для двух мутантных штаммов. Наблюдаемый пик экспрессии данного гена на среде ПСА у мутантных штаммов на 12 ч культивирования согласуется с данными о более раннем начале экспрессии феназинов у этих мутантных штаммов [14].
Экспрессия генаpИzD наблюдается в экспоненциальной стадии роста у штамма дикого типа и мутанта В-162/255, у которого она максимальна при культивировании на ПСА, в то время, как у штамма В-162/17 на минимальной среде этот же уровень экспрессии достигается только в стационарной фазе роста.
Гены рИгЕ всех исследуемых штаммов, выращенных на минимальной среде, демонстрируют сходные паттерны экспрессии, демонстрируя максимальные результаты на начальной и конечной стадиях культивирования. Экспрессия этих генов на ПСА также схожа у всех трех штаммов: максимальные значения наблюдаются на экспоненциальной стадии роста, после чего к стационарной стадии роста экспрессия заметно снижается.
Отсутствие экспрессии генов pИzF и pИzG у штамма В-162, зарегистрированное в данном исследовании, может свидетельствовать о наличии иных генов в геноме данных бактерий, продукты которых в функциональном плане способны заменить белки PhzF и PhzG. Другим возможным объяснением может быть то, что экспрессия этих генов происходит в дру-
гих временных точках, которые в данном исследовании не проверяли, тем более, что для штамма B-162/255 экспрессия данных генов наблюдается на обеих средах на начальных стадиях экспоненциальной фазы (12 ч и 18 ч), а для мутанта B-162/17 слабая экспрессия регистрируется в стационарной фазе роста (4,5 и 6 дней).
Список использованных источников
1. Pierson III, L. S. Metabolism and function of phenazines in bacteria: impacts on the behavior of bacteria in the environment and biotechnologi-cal processes / L. S. Pierson III, E. A. Pierson // Appl. Microbiol. Biotech. - 2010. - Vol. 86, № 6. - P. 1659-1670.
2. Phenazine antibiotic production and antifungal activity are regulated by multiple quorum-sensing systems in Pseudomonas chlorora-phis subsp. aurantiaca StFRB508 / T. Morohoshi, [et. al.] // Biosci. Bioeng. - 2013. Vol. 116, № 5.
- Р. 580-584.
3. Arseneault, T. Phenazine production by Pseudomonas sp. LBUM223 contributes to the biocontrol of potato common scab / T. Arseneault, C. Goyer, M. Filion // Phytopathology - 2013. -Vol. 1. - P. 1-24.
4. Diversity and evolution of the phenazine biosynthesis pathway / D. V. Mavrodi [et. al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2010. - Vol. 76, № 3.
- P. 866-879.
5. Genome-wide identification, domain architectures and phylogenetic analysis provide new insights into the early evolution of shikimate pathway in prokaryotes / X.-Y. Zhi [et. al.] // Molecular Phylogenetics and Evolution. - 2014.
- P. 154-164.
6. Of two make one: the biosynthesis of phenazines / M. Mentel [et. al.] // Chem. Bio. Chem. -2009. - Vol. 10. - P. 2295-2304.
7. Левданская А. И. Анализ генома бактерии Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca B-162 / А. И. Левданская, Е. Г. Веремеенко,
Н. П. Максимова // Сборник научных трудов «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» / Беларуская на-вука. - Минск, 2019. - Том 11. - С. 102-113.
8. Веремеенко Е. Г. Получение и характеристика мутантов Pseudomonas aurantiaca, способных к сверхсинтезу феназиновых ангтиби-отиков при культивировании в минимальной среде / Е. Г. Веремеенко, В. В. Лысак, Н. П. Максимова // Вестник Белорусского государственного университета. Сер. 2, Химия. Биология. География. - 2010. - № 2. - С. 47-53.
9. Veremeenko E. G. Activation of the Antioxidant Complex in Pseudomonas aurantiaca - Producer of Phenazine Antibiotics / E. G. Veremeenko, N. P. Maksimova / Microbiology. - 2010. - Vol. 79, № 4. - P. 439-444.
10. Green, M. R. Molecular cloning: a laboratory manual / M. R. Green, J. Sambrook. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4th ed. New York. - 2012. - P. 365-372.
11. Identification and validation of suitable reference genes for quantitative expression of xylA and xylE genes in Pseudomonas putida mt-2 / С. Chang [et. al.] // Journal of Bioscience and Bioengineering. - 2009. - Vol. 107, №. 2. - Р. 210-214.
12. Selection and validation of reference genes for gene expression studies in Pseudomonas bras-sicacearum GS20 using real-time quantitative reverse transcription PCR / B. Bai [et. al.] // PLoS ONE. - 2020. - Vol. 15, № 1. - 15 p.
13. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data / J. Hellemans [et. al.] // Genome Biol. - 2007. 8(2): R19.
14. Веремеенко, Е. Г. Получение, характеристика и применение продуцентов фенази-новых антибиотиков бактерий Pseudomonas aurantiaca: дис. на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.02.03 / Е. Г. Веремеенко. - М., 2010. - 157 с.
A. I. Liaudanskaya, A. S. Svetlova, N. P. Maximova, K. G. Verameyenka
EXPRESSION OF THE PHENAZINE OPERON IN PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SUBSP. AURANTIACA B-162 STRAINS CAPABLE OF OVERPRODUCTION OF PHENAZINE COMPOUNDS
Belarusian State University 4 Nezavisimosty Ave., 220030 Minsk, Republic of Belarus e-mail: tassigo@gmail.com
For the bacterium Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca B-162 (wild type) and two mutant strains B-162/255 and B-162/17 capable of overproduction of phenazines, a quantitative evaluation of the phz-operon gene expression was carried out during the cultivation of bacteria on full (PMA) and minimal (M9) nutrient media in different phases of culture growth. It was shown that for P chlororaphis subsp. aurantiaca, the most optimal reference genes are the genes encoding pyrroline-5-carboxylate reductase (p5cr) and the DNA gyrase subunit A (gyrA). An inverse relationship between the expression levels ofphzA andphzB genes was registered for B-162/255 and B-162/17 strains. The expression pattern of the phzC and phzD genes of the B-162/17 strain cultivated on the M9 medium differs markedly from that in the other studied strains grown on both nutrient media. For all the studied strains, a clear relationship between the phzE gene expression and the nutrient medium was established. PCR-products of phzF and phzG genes in the strain B-162/255 were registered from 12 to 18 hours of cultivation, and in the strain B-162/17 they were registered on the 4th-6th day of cultivation, while in the B-162 strain the expression of these genes was not observed at the studied time points.
Keywords: phenazine operon, gene expression, Pseudomonas, phenazines.
Дата поступления в редакцию: 22 сентября 2021 г.
