CC BY
9
Другая 2D модель ангиогенеза — сокультивирование ЭК с клетками стабилизаторами — мезенхимными стро-мальными (МСК) на пластике, предварительно не покрытом белками ВМ. В данной модели источниками ВМ и ростовых факторов являются МСК. Помимо этого, и сами межклеточные взаимодействия ЭК и МСК могут вносить вклад в формирование КПС ЭК.
Целью работы было сравнительное изучение профилей экспрессии ряда генов в ЭК, вовлеченных в процесс ангиогенеза в разных моделях: ЭК, формирующие КПС на Матригеле, ЭК в ко-культуре с МСК, ЭК в конфлюэнт-ном монослое и делящиеся/мигрирующие ЭК.
Нормировку полученных данных проводили к ЭК в конфлюэнтном монослое.
Мы обнаружили, что:
1) Анализ экспрессионного профиля ЭК с помощью программы Heatmapper показал, что в ЭК на Матригеле по отношению к ЭК в ко-культуре и делящимся/мигрирующим ЭК активировались разные кластеры генов. Данные различия затрагивают гены межклеточных контактов, в том числе Notch и эфриновую сигнализацию.
2) В ЭК на модели Матригеля, в кокультуре и делящимися/мигрирующими ЭК апрегулировалось 4 общих гена: PLAU, PLAUR, JAG1 and NOTCH2.
3) Гены, ассоциированные с EndMT апрегулирова-лись как на Матригеле, так и в ко-культуре, причем в ко-культуре апрегуляция являлась более выраженной.
4) В ко-культуре происходила активная экспрессия белков ВМ, причем это происходило и в ЭК и в МСК. Более того, экспрессия коллагена1 в ЭК при этом возрастала более чем в 77 тысяч раз.
5) На Матригеле повышалась экспрессия эфри-новых лигандов EFNA3, EFNA5, EFNB2, EFNB3 и рецепторов EPHB4, EPHB6. В делящихся/мигрирующих ЭК происходила даунрегуляция генов почти всех ли-гандов и рецепторов, а увеличение отмечалось только для рецептора EPHA2. В ЭК в ко-культуре происходила даунрегуляция генов лигандов EFNA1, EFNB1, EFNB2, EFNB3 и рецептора EPHB4, а также апрегуляция генов рецепторов EPHA2, EPHB1.
6) Даунрегуляция генов CCN1 и CCN2 в ЭК на Матригеле говорит об активации сигнального пути Hippo, в то время как в делящихся/мигрирующих ЭК данный путь не активен.
7) В ЭК на Маригеле происходила апрегуляция всех лигандов и рецепторов Notch, и активация сигнализации Notch. В кокультуре происходила апрегуляция JAG1, JAG2, NOTCH2 и даунрегуляция DLL1 и DLL2 и подавление сигнализации.
Мы можем заключить, что 2Д модели ангиогенеза in vitro на Матригеле и в ко-культуре отражают различные стадии ангиогенеза.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 21-15-00327.
СИНТЕЗ И ОФОРМЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНОВОГО ВОЛОКНА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРЫС
М.Б. Белякова, Н.В. Костюк, М.В. Черноруцкий, Д.В. Лещенко, М.В. Миняев
ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава РФ, Тверь, Россия
e-mail: mayabe@yandex.ru
Ключевые слова: жировая ткань, мезенхимные стромаль-ные клетки, коллагеновые волокна в культуре.
Сборка коллагена определяется контактами фибрилл с поверхностью фибробласта, и пространственное расположение клетки является обуславливающим в ориентации пучков, что, несомненно, сказывается на особенностях коллагенового матрикса, получаемого при культивировании фибробластов различного происхождения. В данной работе изучалась динамика формирования коллагена, создаваемого в донной культуре клетками жировой ткани, при стимуляции коллагеногенеза бычьей сывороткой и аскорбатом. Целью работы было выявить возможности фибриллогенеза клетками жировой ткани при донном культивировании различной длительности в условиях, предпочтительных для фибробластов.
В эксперименте использовались клетки жировых экс-плантов крыс, культивированные в среде ОМЕМ с высокой глюкозой, аскорбатом и 10%-й бычьей сывороткой без пересева в течении 4-16 недель. Контрольные чашки в первую неделю культивирования стимулировались фетальной сывороткой и/или содержались без аскор-бата. Фотодокументирование формирования коллагена проводилось при фазовой микроскопии живых культур и с окраской по Ван-Гизону или Маллори.
Фибробластоподобная морфология культур мезенхим-ных стромальных клеток достаточно легко возникает при пересевах, и при уплотнении застила такие клетки не удается снять с помощью трипсина, однако это становится возможным благодаря применению коллагеназы. Если клетки не пассировались больше двух недель, многие из них при такой дезагрегации сохраняли вытянутую форму и сходили с подложки с элементами созданного ими матрикса. При старении культуры без пересева до 101 6 недель наблюдался апоптоз клеток, с сохранением визуализировавшихся при фазово-контрастном микро-скопировании и гистологически окрашивавшихся колла-геновых волокон. Необходимо отметить, что аскорбат без какой-либо иной стимуляции столь значительно усиливал коллагеногенез и фибриллогенез, что за 60 дней появлялись оформленные волокна длиной 300-500 мкм.
При использовании бычьей сыворотки и стеклянного культурального сосуда возможно целевое получение кол-лагенового матрикса слоистой архитектуры, образованного культурой мезенхимных клеток.
ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА КОНСТИТУТИВНО УВЕЛИЧИВАЕТСЯ В КОСТЯХ СУБЛЕТАЛЬНО ОБЛУЧЕННЫХ МЫШЕЙ
А.Е. Бигильдеев1, Д.М. Карпенко1, А.В. Садовская1, 2, А.И. Дорофеева1
1 ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
2 Биологический факультет, Кафедра иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: bigildeev.ae@gmail.com
Ключевые слова: ФНОа, ИЛ-1 ß, облучение, фактор роста стромы, NF-kB, кости, индукция экспрессии.
Облучение мышей в сублетальной дозе радиации приводит к повышенному уровню интерлейкина-1 бета (ИЛ-1 ß) в крови, который остается повышенным не только в острую фазу после облучения, но и позднее, неопределенно долго. Мы также установили, что ИЛ-1 ß — ростовой фактор для стромальных клеток-предшественниц костного мозга. При сингенной имплантации костного мозга под капсулу почки облученных мышей в месте операции образуется очаг
эктопического кроветворения повышенной клеточности, что указывает на наличие расширенной кроветворной территории, образованной индуцированными ИЛ-1р стро-мальными клетками-предшественницами. Аналогичный эффект происходит при использовании необлученного реципиента, которому под кожу предварительно имплантировали кости от облученного сингенного донора.
Согласно нашему предположению, повышению ИЛ-1 р в крови облученных животных предшествует краткосрочное или конститутивное повышение экспрессии в костях неизвестного фактора, который попадает в кровь и стимулирует где-то в организме повышенный синтез и секрецию ИЛ-ip в периферическую кровь, что и приводит к наблюдаемому феномену. Вероятно, это происходит за счёт деметилирования промотора ИЛ-1р, поскольку эффект наблюдается в течение нескольких месяцев после облучения. Фактором, индуцирующим повышение уровня ИЛ-1 р, может являться фактор некроза опухолей альфа (ФНОа). ФНОа — один из ключевых регуляторов кроветворения и, в частности, врожденного иммунитета. Связывание ФНОа с рецепторами на поверхности клеток приводит к активации таких сигнальных каскадов, как NF-kB, JNK и каспазы-8, которые важны для активации воспаления, пролиферации и апоптоза, соответственно. ИЛ-1 р, в свою очередь, является одной из мишеней NF-kB.
Для проверки предположения мы исследовали экспрессию ФНОа в костях необлученных (n = 3) и облученных в дозе 5 Гр (n = 3) и 6 Гр (n = 5) мышей линии C57Black через 3-5 месяцев после экспозиции. Из бедер и голеней выделяли РНК, строили кДНК и проводили ПЦР в режиме реального времени на Tnfa (ФНОа). Нормализацию проводили по генам домашнего хозяйства Sdha и Rpl13a. Показано, что в костях мышей, облученных в дозе 5 Гр и 6 Гр, через несколько месяцев наблюдается повышенная экспрессия ФНОа в 2,5 ± 0,3 и 2,3 ± 0,3 раз, соответственно, по отношению к контролю. Совместно с данными других экспериментов, демонстрирующих способность ФНОа деметилировать CpG в промоторе гена Il1b, кодирующего ИЛ-1р, это усиливает гипотезу о том, что в наблюдаемом феномене ИЛ-1р является промежуточным звеном, которое регулируется ФНОа.
Наши эксперименты подтверждают важную роль ФНОа не только для кроветворных клеток, но также и для клеток кроветворного микроокружения in vivo, стромальных клеток костного мозга. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-00459.
ВЛИЯНИЕ ЛОКАЛЬНОЙ ГИПОТЕРМИИ НА СОХРАНЕНИЕ НЕРВНОЙ ТКАНИ У КРЫС ПОСЛЕ ТРАВМЫ СПИННОГО МОЗГА
С.О. Бикеева1, О.Н. Чернова2, 3, Д.Э. Сабирова1, Е.В. Федоренко1, Т.В. Балтина1
1 Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский Федеральный Университет, Казань, Россия
2 Кафедра морфологии человека, Северо-Западный государственный медицинский университет
им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
3 Кафедра патологии и судебной медицины, ЧОУ ВО Медико-социальный институт, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: sofYabikeeva01@mail.ru
Ключевые слова: травма спинного мозга, локальная гипотермия, иммуногистохимический анализ, кавитации, синап-тофизин, миелинобразующие клетки, ремиелинизация.
Целью работы явилось проведение морфометриче-ской оценки серого и белого вещества спинного мозга у крыс после травмы спинного мозга (ТСМ) и локальной гипотермии (ТСМ+ГТ).
Исследование проведено на 24 самцах крыс породы Sprague Dawley, весом 160-180 г. Все эксперименты были выполнены с соблюдением биоэтических норм. В условиях операционной, с соблюдением всех правил асептики и антисептики животным наносилась конту-зионная ТСМ на уровне Th8 по А.Р. Аллену (1911) [1]. Для нанесения локальной интраоперационной гипотермии использовался приготовленный хладагент, который на 20 минут помещался в декомпрессионном окне ламинэктомированного позвонка на твердую мозговую оболочку спинного мозга, как описано ранее [2]. Животных выводили из эксперимента на 1, 3, 7 и 21 сутки. Криосрезы окрашивали иммуногистохи-мически с антителами к синаптофизину (в разведении 1:400, ab32127, RabMAb, США) и миелину (в разведении 1:100, ab40390, Abcam, США). Проводили анализ и сравнение общего объема полостей в сером и белом веществе спинного мозга.
В результате контузионной травмы спинного мозга в зоне поражения наблюдались множественные кавитации. В группе ТСМ площадь кавитации в сером веществе в 1 сутки после травмы была на 65 % выше, чем в группе ТСМ+ГТ. В дальнейшем область кавитации в группе ТСМ снижалась. На 21 сутки площадь образованных полостей была на 40 % выше в группе ТСМ+ГТ, чем в группе ТСМ. Иммуногистохимический анализ криосрезов показал, что в клетках серого вещества передних рогов спинного мозга экспрессия синаптофи-зина, начиная с 1 суток до 7 суток, была выше в группе ТСМ+ГТ по сравнению с группой ТСМ. На 3 сутки количество миелинобразующих клеток было выше в группе ТСМ. Наибольшая концентрация миелинобразующих клеток наблюдалась в сером веществе задних рогов спинного мозга на 7 сутки в группе ТСМ+ГТ.
Таким образом, мы показали, что интраоперацион-ная локальная гипотермия способствует сохранению нервной ткани серого и белого вещества спинного мозга после ТСМ у крыс. Локальная гипотермия позволяет уменьшить степень демиелинизации аксонов в передних рогах серого вещества спинного мозга после ТСМ у крыс, способствует восстановлению синап-тических контактов между клетками и более раннему запуску процессов ремиелинизации. Работа выполнена в рамках программы «Стратегическое академическое лидерство Казанского федерального университета» (ПРИ0РИТЕТ-2030).
Литература:
1. Baltina T.V., Silantyeva D.I., Loban E. Yu.et al. Uchenye Zapiski
Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki. 2018. V.
160. № 4. P. 630.
2. lafarova G.G., Tumakaev R.F., Khazieva A.R. et al. Biofizika.
2014. V. 59. № 5. P. 1017.
