CC BY
45
УДК 616-097:612.017.1:612.08
ЭКСПРЕССИЯ ЭНДОКАННАБИНОИДНОГО ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА ВТОРОГО ТИПА НА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ ПРИ АКТИВАЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ IN VIVO
Е.Г.Лобанова
Владивостокский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН- НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения, 690105, г. Владивосток,
ул. Русская, 73г
РЕЗЮМЕ
Роль эндогенной каннабннойдной системы в регуляции иммунного ответа в настоящее время активно дискутируется, в связи с чем в настоящей работе изучена экспрессия эндоканнабиноидного рецептора СВ2 на иммунокомпетентных клетках при стимуляции иммунной системы in vivo. Экспрессию эндоканнабиноидного рецептора СВ2 проводили при помощи метода проточной цитофлюорометрии на проточном цитометре с использованием антител. Для стимуляции иммунной системы использовали интракорпоральное облучение крови и обогащение крови озоно-кислородной смесью. Иммуностимулирующий эффект данных физических методов направлен на повышение функциональной активности иммунокомпетентных клеток через активацию синтеза цитокинов, процессов фагоцитоза. Проведенный цитометриче-ский анализ мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров (28 человек) показал, что процентное содержание клеток, экспрессирующих на своей поверхности дифференцирующий антиген к рецептору СВ2, составило более 90% от всех исследуемых клеток. Стимуляция иммунной системы in vivo после интракорпорального облучения крови приводит к уменьшению количества иммунных клеток, экспрессирующих на своей поверхности СВ2 рецепторы на 30% (менее 60% от общего количества иммунокомпетентных клеток). После введения внутривенно озоно-кислородной смеси количество клеток содержащих СВ2 рецептор не превышало 70%. Полученные результаты исследования свидетельствуют об участии эндоканнабино-идной системы в регуляции иммунного ответа и могут быть использованы для целенаправленного воздействия на воспалительную реакцию организма через СВ2 рецептор.
Ключевые слова: иммунная система, иммуноком-петентные клетки, эндоканнабиноидный СВ2 рецептор, стимуляция иммунной системы.
SUMMARY
THE EXPRESSION OF CIRCUMFERENTIAL ENDOCANNABINOID SECOND TYPE RECEPTOR ON IMMUNOCOMPETENT CELLS WITH ACTIVATION OF IMMUNE SYSTEM IN VIVO
E.G.Lobanova
Vladivostok Branch of Far Eastern Scientific Center of
Physiology and Pathology of Respiration of Siberian Branch RAMS - Research Institute of Medical Climatology and Regenerative Treatment, 73g Russkaya Str., Vladivostok, 690105, Russian Federation
The role of endogen cannabioid system in regulation of the immune response is discussed widely nowadays. So the expression of endocannabinoid receptor CB2 on immunocompetent cells with stimulation of immune system in vivo was studied. The expression of endocannabinoid receptor CB2 was performed by flow cytofluorometric method on flow cytometer using antibodies. The intracorporal irradiation of blood and the enrichment of blood with the ozone-oxygen mix were used for stimulation of the immune system. The immu-nostimulating effect of these physical methods is used for increasing of functional activity of immunocompetent cells through the activation of synthesis of cytokines and phagocytosis processes. This cytometric analysis of mononuclear leukocytes of healthy donors (28) demonstrated that the percentage of cells expressing the differentiating antigen to CB2 receptor on their surface was more than 90% of all studied cells. Stimulation of immune system in vivo after intracorporal irradiation of blood leads to the suppression of quantity of immune cells which express CB2 receptors on their surface for 30% (less than 60% of general quantity of immunocompetent cells). The amount of CB2 receptor containing cells was not bigger than 70% after intravenous injection of ozone-oxygen mix. The obtained results of the study demonstrate that endocannabioid system is involved in the regulation of the immune response and can be used for direct influence on the inflammatory reaction of organism through CB2 receptor.
Key words: immune system, immunocompetent cells, endocannabinoid CB-, receptor, stimulation of immune system.
На современном этапе развития фундаментальной и клинической медицины всё большую популярность приобретает концепция синдрома системной воспалительной реакции. Современные исследования в области молекулярной биологии раскрыли многие механизмы гуморальных и клеточных реакций, характеризующих системное воспаление [2]. Согласно современной концепции, системное воспаление развивается в ответ на системный характер воздействия повреждающего фактора или генерализацию маркеров повреждения: продуктов тканевого распада, микробных антигенов, аллергенов, протеолитических
ферментов, изменения кислотно-щелочного равновесия, токсического накопления в кровотоке регуляторных медиаторов и гистогормонов воспаления [2]. Однако данная концепция относительно нова и все чаще в литературе появляются данные о новых участниках системной воспалительной реакции. Одним из таких представителей является эндоканнабиноидная система, которая контролирует образование гормонов, участвует в регуляции активности иммунного ответа [14]. Современные исследования структуры и свойств эндогенных каннабиноидов и их рецепторов, а также обнаружение синтетических аналогов с высокой активностью и селективностью по отношению к специфическим рецепторам привели к открытию основных биологических эффектов эндоканнабиноидов и их функций в организме [9, 11, 14]. Результаты научных исследований показали, что эндоканнабиноидная система задействована в модуляции сигнала иммунного ответа [15]. Данный иммунный ответ связан с функцией периферического рецептора второго типа, который способен регулировать уровень медиаторов воспаления, ограничивать их выделение, контролировать воспалительный процесс на стадии физиологической защиты [13]. Однако, в настоящее время недостаточно исследована роль эндоканнабиноидной системы в регуляции системного воспалительного процесса, в связи с чем целью настоящей работы явилось изучение экспрессии эндоканнабиноидного рецептора СВ, на иммунокомпетентных клетках при стимуляции иммунной системы in vivo.
Материалы и методы исследования
Работу проводили на базе лаборатории биомедицинских исследований. Обследовано 28 здоровых добровольцев в возрасте 23-55 лет (32,2±8,2 лет) из них 9 мужчин и 19 женщин. Исследование было одобрено Комитетом по биомедицинской этике НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения, все участники подписали форму добровольного информированного согласия.
Гематологические параметры периферической крови определяли на анализаторе «Abacus» (Австрия). Фенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили с помощью моноклональных антител к молекулам CD3, CD4, CDg, CD16, CD22, CD25, HLA-DR (Беларусь). Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по методу Д.Н.Маянского и соавт [7]. Для оценки кислородзависимых механизмов бактерицид-ности нейтрофилов использовали тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), определяли НСТ-спон-танный, НСТ резерв, индекс активации нейтрофилов (ИАН) и резерв индекса активации нейтрофилов (ИАНР) по методу Park в модификации Е.В.Шмелева [10]. Уровень провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-8) определяли иммуноферментным методом с помощью тест-системы фирмы INVITROGEN (Бельгия).
Для стимуляции иммунной системы проводили нагрузочные тесты in vivo. В качестве нагрузочного теста in vivo применяли два метода иммуностимуляции: ин-тракорпоральное облучение крови и внутривенное вве-
дение озонированного физиологического раствора. Интракорпоральное облучение крови проводили путем введения одноразового стерильного катетера через пункционную иглу непосредственно в кровеносное русло. Облучение крови проводили однократно с помощью аппарата «Иволга-OMC-Ol» (Россия), использовали спектральный диапазон 650-2000 нм с экспозицией 20 мин. Озонирование физиологического раствора осуществляли на аппарате «Медозон» (Россия). Раствор в количестве 200 мл предварительно озонировали, пропуская через него озоно-кислородную смесь до достижения концентрации озона в жидкости - 6 мкг/мл, после чего вводили внутривенно капельно.
В зависимости от метода стимуляции были сформированы две группы. В 1 группу вошли лица, получавшие световую иммуностимуляцию: 15 человек (из них 6 мужчин и 9 женщин). Лица, получавшие озоно-терапию, составили 2 группу: 13 человек (из них 3 мужчин и 10 женщин).
Забор периферической крови проводили дважды до облучения крови или введения озоно-кислородной смеси и через три часа после процедур. Кровь отбирали из локтевой вены в стерильные силиконизирован-ные пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА - 0,1М 0,02 мл/мл крови; «Venoject»). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего 0,83% раствора NH4C1 [6]. Цельную кровь разбавляли 1:10 лизирую-щим раствором, тщательно перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Взвесь клеток осаждали центрифугированием при 600 g и температуре 20°С. Клетки дважды отмывали средой 199. Отмытые клетки разводили средой RPMI-1640 (Sigma, США) до рабочей концентрации 1 х 105 кл/мл. Определение экспрессии поверхностных маркеров эндоканнабиноидного рецептора СВ, проводили при помощи соответствующих антител (Santa Cruz Biotechnology, США), результаты учитывали методом проточной ци-тофлюорометрии на проточном цитометре FACSCali-bur (Becton Dickinson, США). На мононуклеарных лейкоцитах (МЛ) исследовали уровень эндоканнабиноидного рецептора С Вт. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10000 клеток в гейте. Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WinMDI 2.8.
Результаты исследования и их обсуждение
Цитометрический анализ МЛ здоровых доноров показал, что содержание клеток, экспрессирующих на своей поверхности дифференцирующий антиген к рецептору СВ2, составило более 90% от всех исследуемых клеток (рис. 1). Данный факт подтверждают литературные данные о том, что эндоканнабиноидный рецептор СВ2 экспрессируется на поверхности МЛ [13]. Следовательно, наличие эндоканнабиноидных СВ2 рецепторов на МЛ является маркером лейкоцитарного пула клеток.
Рис. 1. Цитофлуорометрическое определение эндоканнабиноидных рецепторов до стимуляции.
Примечание: А - гистограмма МЛ; Б - распределение МЛ по популяциям. Анализ проводился: I - без использования гейтирования по СВ, рецептору; II - с использованием гейтирования по СВ, рецептору
Ранее нами выявлено, что синтетические лиганды каннабиноидных рецепторов (\УЕЧ55,212-2 и ананда-мид) модулируют сигнальную функцию клеток иммунной системы через эндоканнабиноидный рецептор С Вт. подавляющий выработку провоспалительных ци-токинов П1_-2. 1Ь-8, ТЫГ-а) [3, 4, 12]. Возможно, что интенсивность иммунного ответа опосредована через активность экспрессии эндоканнабиноидного рецептора С Вт. Отсутствие данных об особенностях выработки С Вт рецептора при различных состояниях иммунного ответа побудила нас изучить активность экспрессии С Вт рецептора на иммунокомпетентных клетках при стимуляции иммунной системы нагрузочными тестами.
Из совокупности современных методов, стимулирующих иммунный ответ, было выбрано два физических метода: интракорпоральное облучение крови и обогащение крови озоно-кислородной смесью. По данным литературы [5, 8] и ранним исследованиям НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения [1] оба метода влияют на изменение секреции цитокинов, активность клеток эндотелия микрососудов, сосудистых макрофагов, внутрисосудистых лейкоцитов и тромбоцитов, различных стромальных клеток в зоне микроциркуляторного русла.
Иммуностимулирующий эффект интракорпораль-ного облучения крови проявляется в поглощении клетками фотонов и переходе их в возбужденное состояние в результате как прямого взаимодействия энергии кванта с веществом клетки, так и в результате измене-
ния структуры липидного бислоя цитомембраны, увеличения биосинтеза нуклеиновых кислот, сигнальных молекул, активности экспрессии ферментов. Кроме того, образующиеся в крови фрагменты разрушенных и вновь синтезируемых белков могут играть роль антигенов, вызывая соответствующие иммунные реакции в организме [5].
Внутривенное введение озоно-кислородной смеси сопровождается повышением содержания озонидов в крови, способствующих окислению макромолекул (белки, липиды, ДНК), образованию пероксидов, которые и участвуют в развитии воспалительного процесса. В свою очередь, стимуляция клеток иммунной системы озонидами приводит к активации синтеза провоспалительных медиаторов (лейкотриены, проста-гландины), которые также обеспечивают формирование воспаления [6].
Исследование иммунологических и гематологических параметров периферической крови у здоровых доноров показало прямое воздействие интракорпо-рального облучения крови и внутривенного введения озонированного физиологического раствора на активность иммунного ответа организма. При оценке влияния физических факторов в двух группах отмечено статистическое значимое повышение уровня провоспалительных цитокинов, количества клеток белой крови и фагоцитирующих нейтрофилов (табл.). Выбранные нами два метода, независимо от механизма их действия, имеют однонаправленный эффект на реактивность иммунокомпетентных клеток.
Taблицa
Изменение иммyнoлoгичecкиx нapaмeтpoв y здopoвыx дoнopoв дo и нocлe cтимyляции иммуншй
системы физическими методами (М±т)
Параметры До воздействия физических методов (п=28) После воздействия физических методов
1 группа(п=15) 2 группа(п=13)
Лейкоциты, г/л 6,0±0,28 8,8±0,36* 7,6±0,28
Лимфоциты, % 27,5±1,34 29,5±1,58*** 28,5±1,04**
CD3, % 45,0±4,9 49,77±1,57* 46,81±6,9
CD4, % 40,0±3,13 44,08±1,89 42±3,13
CD8, % 22±1,21 20,82±1,07 20±1,81
CD4/CD8, уел. ед. 1,8±0,08 2,20±0,05 2,1±0,01
CD22, % 24,85±1,3 28,5±1,47 26,85±2,3
CD 16, % 17,5±1,06 19,28±1,26 18,9±2,12
CD25, % 9±0,8 12,55±1,05*** 11,04±0,08**
HLA-DR, % 11,2±0,5 13,18±0,65** 12,2±0,15*
Фагоцитоз, % 60,2±1,41 88,5±1,46*** 78,2±1,81***
ФР, уел. ед. 1,04±0,01 1,23±0,03*** 1,22±0,02***
нет, % 13±1,07 17,6±0,75*** 16±1,04***
НСТР, уел. ед. 1,31±0,74 1,83±0,09 1,61±0,24
ИАН, уел. ед 0,12±0,03 0,18±0,01 0,16±0,05
ИАНР, уел. ед. 2,8±0,92 1,92±0,12 1,8±0,22
TNF-a, пг/мл 23±1,6 64,2±8,1*** 43±4,6***
IL-8, пг/мл 115±12,6 218±22,8*** 188±32,4***
Примечание: *- р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 - уровень статистической значимости различий показателей в сравнении с группой до воздействия физических методов.
Индуцирование клеток иммунной системы in vivo привело к снижению числа клеток, экспрессирующих эндоканнабиноидный СВ, рецептор. В первой группе после интракорпорального облучения крови количество клеток, имеющих СВ, рецепторы составило менее 60% (рис. 2). Сравнительный анализ до воздействия интракорпорального облучения и после показал снижение экспрессии СВ, рецептора на 30% (р<0,001). Полученные результаты свидетельствуют о блокаде экспрессии эндоканнабиноидного СВ, рецептора на поверхности МЛ. Во 2 группе после введения внутри-
венно озоно-кислородной смеси количество клеток, содержащих СВ, рецептор (рис. 3), также снизилось и не превышало 70% (р<0,001). Таким образом, в двух группах наблюдения отмечается снижение числа клеток, экспрессирующих эндоканнабиноидный СВ, рецептор. Вероятно, такая однонаправленная реакция иммунной системы, независимо от механизма действия эффектора, свидетельствует об универсальности механизма иммунного ответа на флогоген и формирование воспалительной реакции.
Рис. 2. Цитофлуорометрическое определение эндоканнабиноидных СВ, рецепторов после интракорпораль-ного облучения крови.
Примечание. А - гистограмма МЛ; Б - распределение МЛ по популяциям. Анализ проводился: I - без использования гейтирования по рецептору СВ,; II - с использованием гейтирования по СВ, рецептору; III -с использованием гейтирования по СВ рецептору после интракорпорального облучения крови.
Рис. 3. Цитофлуорометрическое определение эндоканнабиноидных СВ, рецепторов после внутривенного введения озоно-кислородной смеси.
Примечание: А - гистограмма МЛ; Б - распределение МЛ по популяциям. Анализ проводился: I - без использования гейтирования по рецептору СВ,; II - с использованием гейтирования по СВ, рецептору; III -с использованием гейтирования по СВ, рецептору после внутривенного введения озоно-кислородной смеси.
Таким образом, установленное подавление экспрессии эндоканнабиноидного СВ2 рецептора на поверхности МЛ при нагрузочных тестах in vivo является прямым доказательством того, что эндоканнабиноид-ная система участвует в регуляции иммунного ответа. Учитывая, что СВ2 рецепторы обладают иммуноде-прессирующим действием на синтез провоспалитель-ных медиаторов, снижение их экспрессии под действием экзогенных иммуностимуляторов является первичной реакцией организма, которая запускает воспалительную реакцию и активирует иммунную систему. Возможно, гиперреактивность иммунного ответа обусловлена активацией синтеза эндоканнаби-ноидов, обладающих блокирующим действием на экспрессию СВ2 рецепторов. Полученные данные свидетельствуют о значимой роли эндоканнабиноид-ной системы в регуляции иммунного ответа и могут быть использованы для разработки новых эффекторов, сдерживающих процесс воспаления через СВ2 рецептор.
ЛИТЕРАТУРА
1. Влияние медицинского озона на иммунометабо-лический статус больных хроническим бронхитом и артериальной гипертензией / Т.И.Виткина [и др.] // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2011. Вып.40. С.81-86.
2. Гусев Е.Ю., Осипенко А.В. Иммунология системного воспаления // Иммунол. Урала. 2001. №1. С.4-8.
3. Спонтанный и липополисахарид индуцированный синтез цитокинов клетками крови человека в норме и при аллергопатологиях / Е.Г.Исаченко [и др.] // Иммунология. 1999. №5. С.37-39.
4. Исаченко Е.Г., Виткина Т.И., Бердышев Е.В. Влияние лигандов каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 и анандамида на выработку TNF-a и ИЛ-8 лейкоцитами крови здоровых лиц и больных с аллергопатологией // Иммунопатол., аллергол., инфектол. 2003. №2. С.86-91.
5. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональный потенциал лейкоцитов / Г.И.Клебанов [и др.] // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1997. Т.123, №4. С.395-398.
6. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы. М.: Мир. 1990. 395 с.
7. Маянский А.Н. Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций. Горький: Горьк. мед. инст., 1989. 242 с.
8. Техника озонотерапии: методические рекомендации / С.П.Перетягин [и др]. Н. Новгород, 1991. 15 с.
9. Чурюканов М.В., Чурюканов В.В. Функциональная организация и терапевтический потенциал эндогенной каннабиноидной системы // Эксперим. и клин, фармакол. 2004. Т.67, №2. С.70-78.
10. Шмелев Е.В., Бумагина Т.К., Митеров Г.Г. Модификация метода Park // Лаб. дело. 1979. №9. С. 1315.
11. Isolation and structure of a brain constituent that
binds to the cannabinoid receptor / W.A.Devane [et. al.] //
Science. 1992. Vol.258. P.1946-1949.
12. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations / S.Galiegue [et. al.] // Eur. J. Biochem. 1995. Vol.232, №1. P.54-61.
13. CB1 and CB2 cannabinoid receptors differentially regulate the production of reactive oxygen species by macrophages / K.H.Han [et. al.] // Cardiovasc. Res. 2009. Vol.84, №3. P.378-386.
14. Marquez L., Abanades S., Andreu M. Endocan-nabinoid system and bowel inflammation // Med. Clin. (Bare). 2008. Vol.131, №13. P.513-517.
15. Munro S., Thomas K.L., Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabi-noids //Nature. 1993. Vol.365. P.61-65.
REFERENCES
1. Vitkina T.I., Khmeleva E.V., Antonyuk M.V., Nov-gorodtsev A.D. Bulleten' fiziologii i patologii dyhaniyd 2011;40:81-86.
2. Gusev E.Yu., Osipenko A.V. Immunologiya Urala 2001; 1:4-8.
3. Isachenko E.G., Vitkina T.I., Geronina S.A., Berdyshev E.V., Potapov V.N. Immunologiya 1999; 5:37-39.
4. Isachenko E.G., Vitkina T.I., Berdyshev E.V. Immu-nopatologiya, allergologiya, infektologiya 2003; 2:86-91.
5. Klebanov G.I., Teselkin Yu.O., Babenkova I.V., Bashkueva T.Yu., Modestova T.M., Steklova L.S., Vladimirov Yu. A. Byulleten'eksperimental’noy biologii i medit-siny 1997; 123(4):395-398.
6. Klaus J. Limfotsity. Metody [Lymphocytes. Methods]. Moscow: Mir; 1990.
7. Mayanskiy A.N. Modelirovanie i klinicheskaya kha-rakteristika fagotsitarnykh reaktsiy [Modeling and clinical characteristic of phagocytic reactions]. Gor'kiy: Gor'kov-skiy meditsinskiy institut; 1989.
8. Peretyagin S.P, Boyarinov G.A., Zelenov D.N. et al. Tekhnika oozonoterapii: metodicheskie rekomendatsii [Ozone therapy method: methodical recommendations]. Nizhniy Novgorod; 1991.
9. Churyukanov M.V., Churyukanov V.V. Eksperimen-tal’naya i klinicheskaya farmakologiya 2004; 67(2):70-78.
10. Shmelev. E.V., Bumagina T.K., Miterov G.G. La-boratornoe delo 1979; 9:13-15.
11. Devane W.A., Hanus L., Breuer A., Pertwee R.G., Stevenson L.A., Griffin G., Gibson D., Mandelbaum A., Etinger A., Mechoulam R. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 1992; 258:1946-1949.
12. Galiegue S., Mary S., Marchand J., Dussossoy D., Carriere D., Carayon P., Bouaboula M., Shire D., Le Fur G., Casellas P. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations. Eur. J. Biochem. 1995; 232(1):54-61.
13. Han K.H., Lim S., Ryu J., Lee C.W., Kim Y., Kang J.H., Kang S.S., Ahn Y.K., Park C.S., Kim J.J. CB1 and CB2 cannabinoid receptors differentially regulate the production of reactive oxygen species by macrophages. Cardiovasc. Res. 2009; 84(3):378-386.
14. Marquez L., Abanades S., Andreu M. Endocanna- 15. Munro S., Thomas K.L., Abu-Shaar M. Molecular
binoid system and bowel inflammation. Med. Clin. (Bare) characterization of a peripheral receptor for cannabinoids.
2008; 131(13):513—517. Nature 1993; 365:61-65.
Поступила 16.03.2012
Контактная информация
Елена Григорьевна Лобанова,
кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований,
НИИ медицинской климатологии и восстановитечьного лечения, 690105, г. Владивосток, ул. Русская, 73г.
E-mail: isachenkol@yandex.ru Correspondence should be addressed to Elena G. Lobanova,
MD, PhD, Staff scientist of Laboratoiy of Biomedical Researches, Research Institute of Medical Climatology and Regenerative Treatment, 73g Russkaya Str., Vladivostok, 690105, Russian Federation.
E-mail: isachenkol@yandex.ru
