Экспрессия CD38 и Cx43 в клетках среднего мозга при экспериментальной болезни Паркинсона

Малиновская Наталия Александровна; Салмина Алла Борисовна; Прокопенко Семен Владимирович; Комлева Юлия Константиновна; Морозова Галина Александровна; Панина Юлия Анатольевна; Гасымлы Эльтадж Джамил Кызы

Оригинальные исследования

УДК 616-092.19

ЭКСПРЕССИЯ СЭ38 И СХ43 В КЛЕТКАХ СРЕДНЕГО МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина, С. В. Прокопенко, Ю. К. Комлева, Г. А. Морозова, Ю. А. Панина, Э. Д. Гасымлы ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения РФ, ректор - д. м. н., проф. И. П. Артюхов; кафедра биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, зав. - д. м. н., проф. А. Б. Салмина; НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, руководитель - д. м. н.. проф. А. Б. Салмина.

Цель исследования. Выяснить роль потенциальных молекул-маркеров нейрон-астротлиальных взаимодействий (CD38, Cx43, лактат) в патогенезе болезни Паркинсона в эксперименте.

Материалы и методы. На томотенатах и срезах среднего мозга крыс с ротеноновой моделью болезни Паркинсона (БП) и в контроле проведена оценка содержания лактата спектрофометрическим методом, иммунотистохимическая оценка экспрессии CD38, коннексина 43 и маркеров вида клеток.

Результаты. При болезни Паркинсона выявлено значимое увеличение концентрации лактата, усиление экспрессии CD38 на дофаминертических нейронах, астроцитах и микротлии и его коэкспрессии с Сх43.

Заключение. Обнаружена важная роль CD38, коннексина 43 и лактата как участников нейрон-астротлиальных взаимодействий при развитии БП. Ключевые слова: болезнь Паркинсона, CD38, Сх43.

EXPRESSION OF CD38 AND CX43 IN THE MIDBRAIN CELLS AT EXPERIMENTAL PARKINSON'S DISEASE

N. A. Malinovskaya, A. B. Salmina, S. V. Prokopenko, Yu. K. Komleva, G. A. Morozova , Yu. A. Panina, E. D. Gasymly Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V. F. Voyno-Yasenetsky

The aim of the research. To study the role of potential molecular markers of neuron-astrocyte interactions in the pathogenesis of Parkinson's disease (PD).

Materials and Methods. In the homogenates tissue and midbrain slices of rats with the rotenone model of Parkinson's disease and in healthy controls, have been evaluated the levels of lactate, CD38 and Cx43 expression.

Results. It was found the significant increase in lactate concentrations, CD38 expression in dopaminergic neurons, astrocytes and microglia, and its co-expression with Cx43.

Conclusion. The data allows to suggest that development of PD is associated with alterations in NAD+ metabolism in communicating cells of neuronal and glial origin. Key words: Parkinson's disease, CD38, Cx43.

Введение

Коммуникация клеток центральной нервной системы (ЦНС) происходит посредством сигнальных молекул (белки, пептиды, аминокислоты, нуклеотиды, стероиды, ретиноиды, производные жирных кислот, газы - оксид азота, оксид углерода и др.). Взаимодействия между нейронами и глией (нейрон-глиальные взаимодействия) подразделяются на контактные (быстрые, локальные, прямые: к примеру, ней-рон-нейрональная сигнализация через синапсы или глия-глиальная взаимосвязь посредством щелевых контактов) и бесконтактные (медленные, дистантные, опосредованные:

например, нейрон-астроцитарные взаимодействия через выработку трансмиттеров нейронами и последующую активацию рецепторов на астроцитах). Интересно, что астроциты играют роль в функционировании нейронов, образуя с ними интерактивные нейрон-астроцитарные сигнальные сети [6].

Метаболическая поддержка астроцитами активных нейронов (нейрон-астроглиальное нейрометаболическое сопряжение) осуществляется следующим образом: и глия, и нейроны обладают гликолитическими ферментами для расщепления глюкозы и использовании ее для продукции АТФ, однако основным источником энергии для активных

нейронов является не только глюкоза, но и лактат, продуцируемый астроглией. Эта гипотеза носит название «лак-тат-челночной» (astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis) предполагая, что перенос глутамата астроцитами после активации нейронов стимулирует астроцитарный гликолиз и продукцию лактата. Лактат, в свою очередь, покидает астроциты и используется нейронами как источник энергии [1, 5].

Однако до сих пор не известны или малоизвестны молекулярные пути нейрон-глиальных взаимодействий после повреждения ЦНС.

Цель исследования - выяснить роль потенциальных молекул-маркеров нейрон-астроглиальных взаимодействий (CD38, Cx43, лактат) в патогенезе болезни Паркинсона в эксперименте.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись самцы зрелых крыс линии Wistar массой 300-500 г. Эксперименты на животных были одобрены представителями биоэтической комиссии по работе с лабораторными животными при Локальном этическом комитете КрасГМУ (протокол №7 биоэтической комиссии по работе с лабораторными животными при Локальном этическом комитете от 12.12.2011; протокол №49/2012 заседания локального этического комитета от 05.06.2013).

Моделирование болезни Паркинсона выполнялось по методу R.J. Ferrante et al. (1997) и T.B. Sherer (2003) с модификациями: крысам проводили ежедневные подкожные инъекции ротенона (1-3 мг/кг веса/в сутки) c растворителем (экспериментальная группа, n=11), контролем (n=10) являлись животные с ежедневными подкожными инъекциями растворителя (100% диметилсульфоксид). Забор материала проводили на 30-е сутки с момента создания модели, эвтаназия осуществлялась передозировкой фоторотанового наркоза. Животных декапитировали и на льду производили забор среднего мозга. Перед эвтаназией при осмотре животных оценивали в баллах (0-3 балла) признаки болезни Паркинсона (гипо-, бради- и олигокинезия, постуральная нестабильность, неустойчивость походки, ригидность мышц, тремор, нарушение равновесия), подсчитывали суммарную выраженность признаков.

Определение лактата в гомогенатах ткани мозга проводилось спектрофотометрическим методом (H.J. Hohorst, 1957). Измеряли поглощение при 340 нм в динамике, в качестве контроля использовали смесь без добавления гомогената, результат реакции выражали в мкг/мл.

Оценку коэкспрессии антигена CD38 с маркерами вида клеток (тирозин-гидроксилаза, NSE, GFAP, MAP2) и кон-нексином 43 (Сх43) на замороженных срезах проводили согласно стандартным протоколам непрямого методов им-муногистохимии (иммунофлуоресцентный вариант) путем одновременного или последовательного комбинированного окрашивания препаратов.

Флуоресцентную микроскопию проводили при увеличении 400, конфокальную микроскопию - при увеличении

900 (за счет оптического и цифрового увеличения). Подсчет относительного количества клеток, экспрессирующих соответствующий антиген, производился на 100-300 клеток в образце при анализе не менее 10 полей зрения.

Статистический анализ (с помощью программы 81а1р1ия Professional 2009) включал тест Манна-Уитни, корреляционный анализ включал проведение ранговых корреляций Спирмена. Результаты представлены в виде медианы и межквартильного размаха, p - уровень значимости.

Результаты и обсуждение Осмотр животных на наличие признаков болезни Паркинсона подтвердил развитие у экспериментальных животных признаков этого заболевания: выявлено значимое (p<0,01) многократное нарастание суммарной выраженности признаков в сравнении с контролем (табл. 1).

Таблица 1

Выраженность симптомов болезни Паркинсона при ее экспериментальном моделировании

Определяемые параметры Группы животных

Контрольная (n=9) Экспериментальная (n=11)

Сумма баллов 0,0 (0,0.. .0,0) 7,0 (3,75.7,75)

Уровень значимости p<0,01

Анализ содержания лактата (табл. 2) выявил значимое увеличение его концентрации (в 1,5 раза, р<0,01) в экспериментальной модели болезни Паркинсона (рис. 1), что указывает на активизацию процессов продукции лактата и астроцит-нейронального транспорта при хронической нейродегенерации, известно, что лактат играет ключевую роль в нейрон-глиальных взаимодействиях [4, 5, 9].

Таблица 2

Изменение содержания лактата (мкг/мл) в гомогенате ткани среднего мозга в ротеноновой модели болезни Паркинсона

Определяемые параметры Группы животных

Контрольная (n=10) Экспериментальная (n=10)

Содержание лактата (мкг/мл) 31,4 (28,2.46,8) 46,5 (39,9.78,0)

Уровень значимости p<0,01

Продукция лактата, во многом, определяется биодоступностью НАД+, поэтому важную роль в регуляции указанных процессов могут играть НАД+-конвертирующий фермент С038 и сопряженный с ним функционально Сх43. Нами была проведена оценка экспрессии С038 в норме и при экспериментальной болезни Паркинсона, его коэкспрессии с маркерами вида клеток (нейронов, в том числе дофами-нергических, астроцитов и активированной микроглии) в норме и при развитии ротеноновой нейродегенерации и коэкспрессии С038 с коннексином 43 (рис. 1, табл. 3).

Б В

Рис. 1. А — коэкспрессия CD38 и маркеров вида клеток (NSE, TH, GFAP, MAP2) в среднем мозге животных с моделью болезни Паркинсона (флуоресцентная микроскопия, х400); Б — коэкспрессия CD38 и коннексина 43(Cx43) в среднем мозге животных с моделью болезни Паркинсона (флуоресцентная микроскопия, х400); В - внутриклеточная локализация антигена CD38 в клетках среднего мозга (конфокальная микроскопия, х900 за счет оптического и цифрового увеличения).

Известно, что CD38 экспрессируется в клетках нейронов (перикариально - в теле нейрона вокруг ядра, в отростках, примембранно)[8], в астроцитах располагается диффузно (перикариально и в цитоплазме), в активированной микроглии [10, 12]. Нами были получены данные о локализации CD38 диффузно в цитоплазме клеток, в перикариальной области и по ходу отростков нервных клеток (рис. 2), что соответствует литературным данным об особенностях экспрессии CD38 в нейронах и астроцитах. При развитии болезни Паркинсона выявлено значимое (p<0,001) 4-кратное увеличение количества ОТ38-позитивных клеток в сравнении с контролем.

Экспрессия CD38 на нейронах в целом (коэкспрессия CD38 и NSE) не выявила значимых различий между контрольной и экспериментальной группой, однако выявлено 7-кратное значимое (p<0,05) увеличение доли CD38-экспрессирующих дофаминергических нейронов (коэкспрессия CD38 и тирозингидроксилазы - фермента, участвующего в биосинтезе дофамина) при развитии болезни Паркинсона, что, вероятно, играет роль в индукции клеточного повреждения и их гибели при нейродегенерации [12].

При экспериментальной болезни Паркинсона отмечено значимое увеличение количества астроцитов (p<0,05)

Таблица 3

Результаты оценки экспрессии CD38, коэкспрессии CD38 и маркеров вида клеток, коэкспрессии CD38 и коннексина 43 (в % от общего количества клеток) на срезах среднего мозга

Определяемые параметры Группы животных

Контрольная Экспериментальная

Экспрессия CD38

Кол-во CD38+ клеток 2,0 (1,3...3,0), n=9 8,0 (3,0.12,3), n=11

Уровень значимости p<0,001

Коэкспрессия CD38 и маркеров вида клеток

Дофаминергические нейроны (ТН+) 0,0 (0,0.1,5), n=9 7,0 (0,0.8,8), n=11

Уровень значимости p<0,05

Нейроны (ШЕ+) 7,1 (6,1.9,4), n=5 8,7 (8,4.11,7), n=5

Уровень значимости p>0,05

Астроциты (GFAP+) 3,4 (3,2.3,9), n=5 10,9 (8,9.19,2), n=5

Уровень значимости p<0,05

Активированная микроглия (МАР2+) 3,7 (3,5.6,4), n=5 15,9 (9,8.18,1), n=5

Уровень значимости p<0,01

Коэкспрессия CD38 и коннексина 43

Кол-во Сх43+ клеток 2,5 (1,0.3,0), n=5 1,0 (1,0.6,5), n=5

Уровень значимости p>0,05

Кол-во CD38+ клеток 2,5 (1,5.9,5), n=5 3,5 (2,5.7,0), n=5

Уровень значимости p>0,05

Кол-во Cx43/CD38 коэкспрессирующих клеток 4,5 (2,5.10,0), n=5 11,5 (10,5.15,5), n=5

Уровень значимости p<0,01

Суммарное кол-во Сх43+ клеток 2,5 (0,0.9,0), n=5 15,0 (12,0.20,0), n=5

Уровень значимости p<0,001

Рис. 2. Корреляционные взаимосвязи между симптомами болезни Паркинсона (БП), экспрессией СЮ38, маркеров вида клеток, коннексина 43 и содержанием лактата в контрольной (слева) и экспериментальной (справа) группах (уровни значимости корреляционных взаимосвязей: *р<0,05; **р<0,01).

и клеток активированной микроглии (p<0,01), экспресси-рующих CD38, в сравнении с контролем, что согласуется с данными о реактивном астро- и микроглиозе и развитии нейровоспаления при хронической нейродегенерации, включая болезнь Паркинсона [2, 11].

Обнаруженное увеличение числа клеток, коэкспрес-сирующих тирозингидроксилазу и CD38, указывает на потенциальную роль CD38 в реализации повреждения и гибели дофаминергических нейронов, а рост числа CD38+ астроцитов и микроглии указывает на роль CD38 во взаимодействии дофаминергических нейронов с этими

типами клеток (нейрон-астроглиальные и нейрон-микро-глиальные), приводящем, вероятнее всего, к гибели дофаминергических нейронов, при этом виде хронической нейродегенерации.

Известно, что коннексин 43 (Сх43) является белком каналов щелевых контактов, сопряженным с С038 и играющим роль в нейрон-астроглиальных взаимодействиях (экспрессируется на астроцитах и функционально взаимодействует, согласно литературным данным, в мембранах ряда клеток с С038, обеспечивая доступность НАД+ в качестве субстрата для каталитической реакции С038) [3, 7].

Рис. 3. Маркеры аейроа-астротлиальаых взаимодействий (лактат, СВ38, Сх43) в реализации межклеточных взаимодействий при болезни Паркинсона.

Выявлено значимое (р<0,01) увеличение количества клеток, коэкспрессирующих СБ38 и Сх43, в экспериментальной группе. Вход кальция в астроциты определяется активностью белков-коннексинов и ионных обменников, благодаря которым происходит сообщение между астроцитами (транспорт ионов кальция, калия, НАД+, глутамата и др.).

При проведении корреляционного анализа (рис. 2) были выявлены сильные корреляции между симптомами болезни Паркинсона и уровнем экспрессии СБ38 на нейронах среднего мозга (0,93, р<0,05), также обнаружена сильная взаимосвязь между уровнем экспрессии СБ38 на активированной микроглии и на нейронах (-0,83, р>0,05) в экспериментальной группе; в физиологических условиях в среднем мозге выявлены корреляции между отсутствием признаков развития болезни Паркинсона и уровнем экспрессии СБ38 на астроцитах (-0,99, р<0,01), между концентрацией лактата, уровнем экспрессии Сх43 (-0,84, р>0,05), СБ38 на активированной микроглии (-0,82, р>0,05), между уровнем экспрессии СБ38 на активированной микроглии и нейронах (0,86), между уровнем экспрессии СБ38 на астроцитах и коннексина 43 (0,96, р>0,05).

Таким образом, обнаружена важная роль дофаминерги-ческих нейронов, астроцитов и активированной микроглии, экспрессирующих СБ38, и астроцитов, экспрессирующих коннексин 43, а также роль лактата в среднем мозге как участников нейрон-астроглиальных взаимодействий, при развитии ротеноновой болезни Паркинсона (рис. 3).

Заключение

У животных с хронической нейро-дегенерацией усиливается экспрессия С038/НАД+-гликогидролазы с преимущественной локализацией этого фермента в астроцитах (10,9%), микроглии (15,9%) и дофаминергических нейронах (7,0%).

В нейрон-астроглиальных взаимодействиях при болезни Паркинсона важную роль нейрометаболического посредника выполняет лактат, а реализация НАД+-зависимых сигналов между нейронами и астроцитами осуществляется посредством увеличения экспрессии СБ38 и коннексина 43 на взаимодействующих клетках (увеличение их коэкспрессии до 11,5%).

В патогенезе болезни Паркинсона ее проявления коррелируют с уровнем экспрессии СБ38 на нейронах и астроци-тах среднего мозга, также коррелируют экспрессия СБ38 на активированной микроглии и на нейронах, на астроцитах с экспрессией Сх43, выявлены корреляционные взаимосвязи между концентрацией лактата, уровнем экспрессии Сх43 и СБ38 на активированной микроглии.

Литература

1. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Возможное участие лактата в нейрон-глиальном взаимодействии через Н-холинергические синапсы в краниальном шейном симпатическом ганглии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 11. - С. 573-575.

2. Кувачева Н.В., Моргун А.В., Хилажева Е.Д., Малиновская Н.А., Горина Я.В., Пожиленкова Е.А., Фролова О.В., Труфанова Л.В., Мартынова Г.П., Салмина А.Б. Формирование инфламмасом: новые механизмы регуляции межклеточных взаимодействий и секреторной активности клеток // Сибирское медицинское обозрение. - 2013. -№ 5. - С. 3-10.

3. Салмина А.Б., Малиновская Н.А., Окунева О.С., Таранушенко Т.Е.,Фурсов А.А., Михуткина С.В., Моргун А.В., Прокопенко С.В., Зыкова Л.Д. Перинатальное гипок-сически-ишемическое поражение центральной нервной системы вызывает изменение экспрессии коннексина 43, CD38 и активности АДФ-рибозилциклазы в клетках головного мозга // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - № 12. - С. 641-645.

4. Abbott N.J., Ronnback L., Hansson E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier // Nat. Rev. Neurosci. - 2006. - Vol. 7. - P. 41-53.

5. Araque A., Navarrete M. Glial cells in neuronal network function // Phil. Trans. R. Soc. B. - 2010. - Vol. 365. -P. 2375-2381.

6. Bezzi P., Volterra A. A neuron-glia signalling network in the active brain // Curr. Opin. Neurobiol. - 2001. -Vol. 11. - P. 387-394.

7. Bruzzone S., Franco L., Guida L., Zocchi E., Contini P., Bisso A., Usai C., De Flora A. A self-restricted CD38-connexin 43 cross-talk affects NAD+ and cyclic ADP-ribose metabolism and regulates intracellular calcium in 3T3 fibroblasts // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276, № 51. - P. 48300-48308.

8. Kato I., Yamamoto Y., Fujimura M., Noguchi N., Taka-sawa S., Okamoto H. CD38 disruption impairs glucose-induced increases in cyclic ADP-ribose, [Ca2+]i, and insulin secretion // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 1869-1872.

9. Magistretti P.J. Neuron-glia metabolic coupling and plasticity // J. Exp. Biol. - 2006. - Vol. 209. -P. 2304-2311.

10. Mizuguchi M., Otsuka N., Sato M., Ishii Y., Kon S., Ya-mada M., Nishina H., Katada T., Ikeda K. Neuronal localization of CD38 antigen in the human brain // Brain Res. - 1995. -Vol. 697. - P. 235-240.

11. Salmina A.B. Neuron-glia interactions as therapeutic targets in neurodegeneration // J. Alzheimer's Dis. -2009. - Vol. 16, № 3. - P. 485-502.

12. Yamada M., Mizugushi M., Otsuka N., Ikeda K., Taka-hashi H. Ultrastructural localization of CD38 immunoreactiv-ity in rat brain // Brain Res. - 1997. - Vol. 756, № 1-2. -P. 52-60.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

References

1. Gorelikov P.L., Savelyev S.V. Possible involvement of lactate in neuron-glia interactions through H-cholinergic synapses in the cranial cervical sympathetic ganglion // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2006. -№ 11. - P. 573-575.

2. Kuvacheva N.V., Morgun A.V., Khilazheva E.D., Ma-linovskaya N.A., Gorina Ya. V., Pozhilenkova E.A., Frolova O.V., Trufanova L.V., Martynova G.P., Salmina A.B. Inflammasomes forming: new mechanisms of intercellular interactions regulation and secretory activity of the cells // Siberian Medical Review. - 2013. - № 5. - P. 3-10.

3. Salmina A.B., Malinovskaya N.A., Okuneva O.S., Tara-nushenko T.E., Fursov A.A., Mikhutkina S.V., Morgun A.V., Prokopenko S.V., Zykova L.D. Perinatal hypoxic-ischemic injury of the central nervous system causes a change in the expression of connexin 43, CD38 and ADP-ribosyl cyclase activity in brain cells // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2008. - № 12. - P. 641-645.

4. Abbott N.J., Ronnback L., Hansson E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier // Nat. Rev. Neurosci. - 2006. - Vol. 7. - P. 41-53.

5. Araque A., Navarrete M. Glial cells in neuronal network function // Phil. Trans. R. Soc. B. - 2010. - Vol. 365. -P. 2375-2381.

6. Bezzi P., Volterra A. A neuron-glia signalling network in the active brain // Curr. Opin. Neurobiol. - 2001. -Vol. 11. - P. 387-394.

7. Bruzzone S., Franco L., Guida L., Zocchi E., Contini P., Bisso A., Usai C., De Flora A. A self-restricted CD38-connexin 43 cross-talk affects NAD+ and cyclic ADP-ribose metabolism and regulates intracellular calcium in 3T3 fibroblasts // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276, № 51. - P. 48300-48308.

8. Kato I., Yamamoto Y., Fujimura M., Noguchi N., Taka-sawa S., Okamoto H. CD38 disruption impairs glucose-induced increases in cyclic ADP-ribose, [Ca2+]i, and insulin secretion // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 1869-1872.

9. Magistretti P.J. Neuron-glia metabolic coupling and plasticity // J. Exp. Biol. - 2006. - Vol. 209. - P. 2304-2311.

10. Mizuguchi M., Otsuka N., Sato M., Ishii Y., Kon S., Yamada M., Nishina H., Katada T., Ikeda K. Neuronal localization of CD38 antigen in the human brain // Brain Res. - 1995. -Vol. 697. - P. 235-240.

11. Salmina A.B. Neuron-glia interactions as therapeutic targets in neurodegeneration // J. Alzheimer's Dis. -2009. - Vol. 16, № 3. - Р. 485-502.

12. Yamada M., Mizugushi M., Otsuka N., Ikeda K., Taka-hashi H. Ultrastructural localization of CD38 immunoreactiv-ity in rat brain // Brain Res. - 1997. - Vol. 756, № 1-2. -P. 52-60.

Сведения об авторах

Малиновская Наталия Александровна - доктор медицинских, наук, научный сотрудник НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, доцент кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого МЗ РФ.