CC BY
17
ЭКСПРЕССИЯ БЕТА-Ш ТУБУЛИНА В ТКАНИ РАКА ПИЩЕВОДА И ОКРУЖАЮЩЕЙ МОРФОЛОГИЧЕСКИ НОРМАЛЬНОЙ ТКАНИ
И.А. Мамичев1, Т.А. Богуш1, Е.А. Богуш1, А.Н. Гришанина1, Н.О. Вихлянцева1, Н.С. Сапрыкина1, А.А. Каменский2
1ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24; ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; Россия, 119991 Москва, ул. Ленинские Горы, 1
Введение. Белок микротрубочек бета-Ш тубулин (ТиВВЗ) в норме не экспрессируется в эпителиальных клетках, но присутствует во многих опухолях эпителиального происхождения. Мы предположили, что выявление экспрессии ТиВВЗ в морфологически нормальной ткани за пределами первичной опухоли может использоваться для молекулярной диагностики местной распространенности опухолевого процесса, что особенно важно для локально рецидивирующих опухолей, в частности, для рака пищевода.
Цель исследования — количественная оценка экспрессии ТиВВЗ в опухолевой и окружающей морфологически нормальной ткани пищевода, прилежащей к опухоли и отдаленной от нее.
Материалы и методы. Методом проточной иммуноцитофлуориметрии исследована экспрессия белка ТиВВЗ в хирургических биопсийных образцах рака пищевода и морфологически нормальной ткани органа 40 оперированных больных. Результаты. Экспрессия ТиВВЗ выявлена в 35 из 40 исследованных образцов рака пищевода, в 10 из 13 образцов прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани пищевода и в 25 из 40 образцов максимально удаленной от опухоли ткани пищевода вблизи края резекции. В подавляющем большинстве случаев уровень и интенсивность экспрессии ТиВВЗ у каждого больного в опухоли превышали те же показатели в отдаленной морфологически нормальной ткани. Показано, что в ряду «норма ^ норма вблизи опухоли ^ опухоль» экспрессия ТиВВЗ растет, т. е. прослеживается положительный градиент уровня и интенсивности экспрессии белка по мере приближения к опухоли.
Заключение. Экспрессия ассоциированного с опухолевым ростом белка ТиВВЗ за пределами первичной опухоли указывает на молекулярную вовлеченность в опухолевый процесс визуально нормальной ткани органа и может использоваться в качестве дополнительного показателя при стадировании заболевания и определении тактики послеоперационного ведения пациентов.
Ключевые слова: рак пищевода, бета-Ш тубулин, проточная цитофлуориметрия
I.A. Mamichev1, T.A. Bogush1, E.A. Bogush1, A.N. Grishanina1, N.O. Vikhfyantseva1, N.S. Saprykina1, A.A. Kamenskiy2
1N.N.. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Sh., Moscow 115478, Russia; 2Lomonosov Moscow State University; GSP-1, Leninskie Gory, Moscow 119991, Russia
Introduction. Beta-III tubulin (TUBB3), the structural protein of microtubules, is not expressed in normal epithelium, but is frequently present in different epithelial tumors. We suggested that the screening for TUBB3 in morphologically normal tissue outside the tumor may be used for the molecular diagnostics of the local spread of cancer, which is particularly significant in case of the tumors with a high rate of local recurrence, like esophageal cancer.
Objective. The quantitative assessment of TUBB3 expression in tumor and morphologically normal esophageal tissue adjacent and remote from the tumor.
Materials and methods. The expression of TUBB3 in surgical biopsy specimens of tumor and morphologically normal tissue derivedfrom 40patients after radical surgery for esophageal cancer was measured by immunocytometry.
Results. TUBB3 expression was detected in 35 out of 40 studied samples of esophageal cancer, as well as in 10 out of 13 samples of morphologically normal esophagus tissue adjacent to the tumor, and in 25 out of 40samples of esophagus tissue most distant from the tumor near the resection edge. It was shown that the expression of TUBB3 in tissue specimens increases as follows: "normal tissue ^ adjacent normal tissue ^ tumor", which basically means the existence of a positive gradient of TUBB3 expression level and intensity towards the tumor.
Контакты: Иван Андреевич Мамичев Mamichev99@gmail.com
DOI: 10.17650/1726-9784-2019-18-3-48-52
BETA-III TUBULIN EXPRESSION IN ESOPHAGEAL CANCER AND ADJACENT MORPHOLOGICALLY NORMAL TISSUE
Conclusion. The expression of TUBB3, a protein associated with tumor growth, outside the primary tumor may indicate that the tissue appearing to be normal is already affected by the malignancy. It can be used as an additional factor in tumor staging and post-operative patient management.
Key words: esophageal cancer, pIII-tubulin, flow cytometry
Введение
Бета-тубулины — семейство белков, входящих в состав микротрубочек: у позвоночных известно как минимум 9 изоформ бета-тубулина, которые кодируются разными генами и экспрессируются в разных тканях.
В злокачественных опухолях часто экспресси-руются нетипичные для исходной ткани изоформы бета-тубулина. В частности, белок бета-Ш тубулин (ТиВВЗ), который в норме присутствует только в нейронах, меланоцитах, эндотелиоцитах и макрофагах, экспрессируется многими опухолями эпителиального происхождения [1]. ТиВВЗ связан с устойчивостью к препаратам из группы таксанов [2], а также обеспечивает выживание опухолевых клеток в неблагоприятном микроокружении и, возможно, увеличивает метастатический потенциал опухоли [3].
Поскольку ТиВВЗ в норме отсутствует в большинстве тканей, мы предположили, что выявление его в морфологически нормальной ткани за пределами опухоли может быть использовано для молекулярной диагностики местной распространенности опухолевого процесса. Обнаружение ТиВВЗ-позитивных клеток за пределами опухоли будет указывать на большую распространенность болезни [4].
Молекулярная диагностика локальной распространенности особенно важна для опухолей, характеризующихся частым местным рецидивированием, в частности, для рака пищевода — высокоагрессивной опухоли с крайне неблагоприятным прогнозом. Даже после радикальной операции в течение года у 20 % больных диагностируются местные рецидивы опухоли [5].
Цель исследования — количественная оценка экспрессии ассоциированного с опухолевым ростом белка ТиВВЗ в опухолевой и окружающей морфологически нормальной ткани пищевода, прилежащей к опухоли и отдаленной от нее.
Материалы и методы
Изучены хирургические биопсийные образцы рака пищевода и морфологически нормальной ткани 40 больных. У каждого больного охарактеризована экспрессия ТиВВЗ в опухолевой и морфологически нормальной ткани, удаленной от первичного очага. Дополнительно у 13 пациентов исследован материал ткани пищевода, непосредственно прилежащей к опухоли. Суммарно исследовано 93 образца.
Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии TUBB3 проведен с помощью непрямой реакции им-мунофлуоресценции на проточном цитофлуориметре. Ранее метод проточной цитофлуориметрии, традиционно применяемый в исследованиях биологических жидкостей и клеток in vitro, был адаптирован для изучения солидных опухолей человека. Кратко: в процессе пробоподготовки хирургические биопсийные образцы переводят в одноклеточную суспензию и фиксируют 10 % раствором нейтрального формалина [6].
Для определения TUBB3 использованы первичные мышиные моноклональные антитела (ab7751, клон TU-20, Abcam, Великобритания), специфичные к фрагменту аа441—448 последовательности белка TUBB3 в конечной концентрации 0,16 мкг/мл. В качестве вторичных антител использованы козьи антимышиные поликлональные антитела, конъ-югированные с красителем DL650 (ab98729, Abcam, Великобритания) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
Инкубацию клеток с антителами проводили в темноте при 4 °С в течение 15—20 ч (ночь). После инкубации суспензию клеток отмывали 0,5 % раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатном буфере (рН 7,4), добавляли вторичные антитела и инкубировали в течение 1,5 ч при 4 °С. Для выведения из анализа дебриса и эритроцитов после завершения инкубации с вторичными антителами клетки инкубировали в течение 15 мин со специфическим красителем ДНК Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 1,2 мкг/мл. После окончания инкубации пробы дважды отмывали раствором BSA.
Измерение флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США) с применением программного обеспечения Navios Software. Исследованы 2 показателя экспрессии белка: 1) уровень экспрессии — доля специфически флуоресцирующих клеток, выраженная в процентах, и 2) интенсивность экспрессии — средняя интенсивность флуоресценции всех клеток за вычетом автофлуоресценции (AMFI, в у. е.). Для попарных сравнений использован одновыборочный критерий Вилкоксона с поправкой на множественные сравнения.
Результаты и обсуждение
Экспрессия TUBB3 зарегистрирована в большинстве исследованных образцов рака пищевода. При этом отмечена значительная гетерогенность уровня
Количественные показатели нормальной и злокачественной ткани пищевода Quantitative date of TUBB3 expression in normal and malignant esophageal tissue
Группы сравнения минимум нижний квартиль Minimum Lower quartile медиана верхний квартиль максимум
Comparison groups Уровень экспрессии TOBB3 (%)
Норма, n = 40 Norm, n = 40 3 13 21 31,5 75
Норма вблизи опухоли, n = Norm near the tumor, n = 13 13 6 15,5 31 45 56
Опухоль, n = 40 Tumor, n = 40 7 22 36 51 60
интенсивность экспрессии TOBB3 (у. е.)
Норма, n = 40 Norm, n = 40 3 7 15,5 22 65
Норма вблизи опухоли, n = Norm near the tumor, n = 13 13 2 7,5 13 32,5 76
Опухоль, n = 40 Tumor, n = 40 0 19 31 56 184
экспрессии маркера в опухоли у разных пациентов: минимальное значение уровня экспрессии ТиВВЗ — в 7 % клеток, максимальное — в 60 %, медиана — 36 %, а половина всех значений заключена в интервале от 22 до 51 %. Та же закономерность проявляется при анализе интенсивности экспрессии ТиВВ3 (см. таблицу).
Неожиданным оказалось обнаружение ТиВВ3 в морфологически нормальной ткани пищевода, как удаленной от первичной опухоли, так и непосредственно прилежащей к ней. Экспрессия ТиВВ3 в этих группах также оказалась неоднородной: минимальный уровень экспрессии — в 3 % клеток, максимальный — 75 %, медиана — 21 %, половина всех значений заключена в интервале от 13 до 31,5 %. Полностью количественные характеристики экспрессии ТиВВ3 в опухолевой и морфологически нормальной ткани пищевода приведены в таблице.
Отдельная проблема, требующая пристального внимания, — определение пороговых значений экспрессии ТиВВ3 в опухоли, ниже которых ее можно считать негативной. Как уже упоминалось, белок ТиВВ3 не выявляется в большинстве нормальных клеток пищевода, однако существуют данные, согласно которым белок экспрессируется в базальных клетках [7]. Эти клетки, несомненно, присутствуют в исследуемых суспензионных образцах, и при этом известно, что в ткани пищевода на базальный слой у человека приходится около 15 % всей толщины эпителия [8]. В связи с этим мы приняли пороговый уровень экспрессии ТиВВ3 равным 15 %.
С учетом выбранного порогового значения экспрессия ТиВВ3 выявлена в 87,5 % исследованных образцов рака пищевода (35 из 40). В прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани пищевода экспрессия ТиВВ3 выявлена в 76,9 % образцов (10 из 13). В удаленной от опухоли морфологически нормальной ткани пищевода — в 62,5 % образцов (25 из 40).
Важно отметить, что у 95 % больных (38 из 40) уровень экспрессии ТиВВ3 в опухоли был выше, чем в нормальной ткани, а в 90 % случаев (36 из 40) в опухоли была выше и интенсивность экспрессии маркера.
Чтобы оценить статистическую силу наблюдаемых различий экспрессии ТиВВ3 в опухолевом узле и морфологически нормальной ткани на разном отдалении от него, проведено попарное сравнение показателей экспрессии ТиВВ3 в 3 связанных группах с введением поправки на множественные сравнения. Результаты представлены на рисунке.
Видно, что в ряду «норма ^ норма вблизи опухоли ^ опухоль» экспрессия ТиВВ3 растет, т. е. прослеживается положительный градиент уровня и интенсивности экспрессии белка по мере приближения к опухоли. Статистически значимые различия по уровню и интенсивности экспрессии ТиВВ3 выявлены как между опухолевой и отдаленной морфологически нормальной тканью пищевода, так и между опухолью и непосредственно прилежащей к ней нормальной тканью. В то же время разница показателей экспрессии ТиВВ3 в морфологически нормальной
¡S.8
m rn .o oo ir 00
<u P
m i—
o
ü
>
70
60
50
40
30
20
10
Норма / Norm n = 40
Норма вблизи Опухоль /
опухоли / Worm Tumor
near the tumor n = 40 n = 13
0 ш
1 К
m CG
60
40
20
Норма / Норма вблизи Опухоль /
Worm опухоли / Worm Tumor
n = 40 near the tumor n = 40 n = 13
Количественные показатели экспрессии TUBB3 в нормальной и опухолевой ткани пищевода: а — уровень экспрессии; б — интенсивность экспрессии. *Различия статистически значимы; ns — различия статистически незначимы
Quantitative indicators of TUBB3 expression in normal and tumor tissue of the esophagus: a — expression level; б — expression intensity. *Differences are statistically significant; ns — differences are not statistically significant
б
а
0
0
ткани на разном отдалении от опухоли оказалась статистически незначимой. Последнее, впрочем, может быть обусловлено малым количеством образцов прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани, и результаты требуют дальнейшего уточнения.
Заключение
Впервые с использованием строго количественного метода показано, что в морфологически нормальной ткани пищевода, пораженного опухолевым процессом, выявляется ассоциированный с опухолевым ростом молекулярный маркер ТиВВЗ. Экспрессия белка в морфологически нормальной ткани пищевода всегда ниже, чем в опухоли, и варьирует в широких пределах: от 3 до 75 % клеток, экспресси-рующих ТиВВЗ.
Учитывая, что экспрессия ТиВВЗ в норме нехарактерна для ткани пищевода, полученные данные свидетельствуют о наличии малигнизированных кле-
ток за пределами первичной опухоли — в окружающей морфологически нормальной ткани. Это может отражать наличие «опухолевого поля», т. е. множественных фокусов трансформированных клеток по всему органу, невыявляемых под микроскопом [9], что в свою очередь указывает на молекулярную вовлеченность в опухолевый процесс морфологически нормальной ткани органа. Аналогичные результаты были получены нами ранее при сравнительной оценке количественных показателей экспрессии ТиВВЗ в ткани немелкоклеточного рака легкого и окружающей морфологически нормальной ткани органа [10].
Мы считаем, что экспрессия ТиВВЗ за пределами первичной опухоли указывает на молекулярную вовлеченность в опухолевый процесс визуально нормальной ткани органа и может использоваться в качестве дополнительного показателя при стадировании заболевания и определении тактики послеоперационного ведения пациентов.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Katsetos C.D., Herman M.M., Mork S.J. Class III beta-tubulin in human development and cancer. Cell Motil Cytoskeleton 2003;55(2):77-96.
DOI: 10.1002/cm.10116.
2. Jordan A., Hadfield J.A.,
Lawrence N.J. et al. Tubulin as a target for anticancer drugs: agents which interact with the mitotic spindle. Med Res Rev 1998;18(4):259-96. DOI: 10.1002/(SICI)1098-1128(199807)18:4<259::AID-MED3>3.0.C0;2-U.
3. Luduena R.F. A hypothesis on the origin and evolution of tubulin. Int Rev Cell Mol Biol 2013;302:41-185.
DOI: 10.1016/B978-0-12-407699-0. 00002-9.
4. Мамичев И.А., Богуш Т.А., Богуш Е.А. и др. Белок микротрубочек ßIII-ту-булин: строение, экспрессия и функции в нормальных и опухолевых клетках. Антибиотики и химиотерапия 2018;63(7-8):79-90. [Mamichev I.A., Bogush T.A., Bogush E.A. et al. Microtubule Protein ßIII-Tubulin: Structure,
Expression and Functions in Normal and Tumor Cells. Antibiotiki i khimiotera-piya = Antibiotics and Chemotherapy 2018;63(7—8):79—90. (In Russ.)].
5. Скворцов М.Б. Рак пищевода: хирургическое лечение. Сибирский медицинский журнал 2011;4:21-30. [Skvortsov M.B. Esophageal Cancer: Surgical Treatment. Sibirskiy meditsins-kiy zhurnal = The Siberian Medical Journal 2011;4:21-30. (In Russ.)].
6. Шатурова А.С., Богуш Т.А., Дудко Е.А. и др. Экспрессия эстрогеновых
рецепторов р и pj в ткани немелко-клеточного рака легкого человека. Антибиотики и химиотерапия 2012;57(5—6):11—7. [Shaturova A.S., Bogush T.A., Dudko E.A. et al. Expression of Estrogen Receptors a and p in Tissue of Human Non-Small Cell Lung Cancer. Antibiotiki i khimioterapiya = Antibiotics and Chemotherapy 2012;57(5—6):11—7. (In Russ.)]. 7. Person F., Wilczak W., Hube-Maqq C. et al. Prevalence of рШ-tubulin (TUBB3) expression in human normal tissues and cancers. Tumor Biol 2017;39(10):1-11. DOI: 10.1177/1010428317712166.
8. Быков В.Л., Исеева Е.А. Функциональная морфология покровного эпителия слизистой оболочки пищевода. Морфология 2006;129(3):7-21. [Bykov V.L., Iseyeva Ye.A. Functional Morphology of the Surface Epithelium of Esophageal Tunica Mucosa. Morfologiia = Morphology 2006;129(3):7-21. (In Russ.)].
9. Garcia S.B., Park H.S., Novelli M., Wright N.A. Field cancerization, clonali-ty, and epithelial stem cells: the spread of mutated clones in epithelial sheets.
J Pathol 1999;187(1):61-81. DOI: 10.1002/(SICI)1096-9896(199901)187:1<61::AID-PATH247>3.0.C0;2-I.
10. Мамичев И.А., Богуш Т.А.,
Дудко Е.А. и др. Иммунофлуорес-центный анализ экспрессии бета-III тубулина в опухолевой и окружающей нормальной ткани пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(2):16-8. [Mamichev I.A., Bogush T.A., Dudko EA. et al. Immunofluorescent Analyses of Tumor Marker Beta-III Tubuilin Expression in Tumor and Ajacent Normal Lung Tissue Derived from Patients with Non-Small Cell Lung Cancer. Rossiysky bioterapevtichesky zhurnal = Russian Biotherapeutic Journal 2016;15(2):16-8. (In Russ.)].
вклад авторов
И.А. Мамичев, T.A. Богуш: анализ данных, написание текста статьи; Е.А. Богуш: получение данных для анализа;
А.Н. Гришанина, Н.О. Вихлянцева: обзор публикаций по теме статьи; А.А. Каменский: разработка плана, дизайна статьи;
H.С. Сапрыкина: перевод, оформление статьи. Author's contributions
I.A. Mamichev, T.A. Bogush: data analyses, article writing; E.A. Bogush: obtaining data for analysis;
A.N. Grishanina, N.O. Vikhlyantseva: reviewing of publications of the article's theme; A.A. Kamenskiy: developing of the plan and design of the article; N.S. Saprykina: translation and design of the article.
oRCID авторов/oRCID of authors
И.А. Мамичев/I.A. Mamichev: https://orcid.org/0000-0002-6776-4502 Т.А. Богуш/T.A. Bogush: https://orcid.org/0000-0002-7673-4284 Е.А. Богуш/E.A. Bogush: https://orcid.org/0000-0001-5601-3669 А.Н. Гришанина/A.N. Grishanina: https://orcid.org/0000-0002-4277-9222 Н.О. Вихлянцева/N.O. Vikhlyantseva: https://orcid.org/0000-0002-1372-2980 Н.С. Сапрыкина/N.S. Saprykina: https://orcid.org/0000-0003-3378-895X А.А. Каменский/A.A. Kamenskiy: https://orcid.org/0000-0003-4912-922X
конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. Funding. The study was performed without external funding.
Статья поступила: 23.01.19. Принята в печать: 05.08.2019. article received: 23.01.19. accepted for publication: 05.08.2019.
