CC BY
16УДК 615.9
ЭКСПРЕССИЯ BCL-2 КАК КРИТЕРИАЛЬНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОБИОКОМПОЗИТОВ
Исследована экспрессия белка Ьс1-2 в структурах головного мозга при воздействии серебро-содержащих полимерных нанобиокомпозитов в подостром 9-дневном эксперименте на нелинейных белых крысах. Установлено достоверное увеличение количества экспрессиро-ванных нервных клеток при воздействии различных доз исследуемых веществ, а также наличие структурных нарушений нервной ткани.
Ключевые слова: наносеребро, арабитногалактан, поливинилтриазол, иммуногистохимия, морфология, Ьс1-2.
Е.А. Титов, М.А. Новиков
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, 665827, Иркутская область, г. Ангарск, Российская Федерация
Введение. В последние годы развивается новый подход к получению терапевтических препаратов, основанный на иммобилизации. В качестве носителей все чаще используют синтезируемые в лабораторных условиях биополимеры, обладающие заданными поверхностными и качественными характеристиками. Использование наноразмерных частиц в качестве биологического агента в совокупности привело к появлению нового типа веществ - нанобиокомпозитов, обладающих разнообразными уникальными биологическими и фармакологическими свойствами. Инкапсулирование на-ночастиц в полимер позволяет улучшить их фармакологические свойства - увеличить активность, избирательность и время действия, снизить токсичность и побочные эффекты, а также улучшить стабильность при хранении, то есть обеспечить безопасность и эффективность действия. Особый интерес представляет разработка препаратов, содержащих серебро в наноформе, позволяющее во много раз снизить концентрации серебра с сохранением всех бактерицидных свойств [1]. Использование в качестве наностабилизирующей матрицы синтетического полимера поли-1-винил-1,2,4-триа-зол (ПВТ) и природного полимера арабиногалактана (АГ), выделяемого из лиственницы сибирской ^апх sibirica L.), является перспективным направлением создания нанобио-композитов с заданными свойствами.
ПВТ - синтезируемый полимер с молекулярной массой около 26 кДа, имеющий в своем составе азотсодержащие гетероциклические фрагменты. На основе исходного вещества был синтезирован комплекс, включающий в себя ПВТ с инкапсулированными в него наночастицами серебра с преобладающим размером 8-20 нм (нано - Ag - ПВТ). Соедине-
ния данного типа способны проявлять уникальные свойства: растворимость, биосовместимость, высокую координирующую способность и др. [4].
В отличие от ПВТ, макромолекула арабиногалактана из древесины лиственницы имеет высоко разветвленное строение: главная цепь ее состоит из звеньев галактозы, соединенных гликозидными связями |3-(1—»3), а боковые цепи со связями Р~(1—»6) - из звеньев галактозы и арабинозы, из единичных звеньев арабинозы, а также уроновых кислот, в основном глюкуроновой [5]. В исследованиях было показано, что арабиногалактан обладает иммуномодуляторной активностью [2], проявляет гастропротекторные свойства [3]. В состав нанобиокомпозита на матрице арабиногалактана (нано - Ag - АГ) входят частицы серебра в нульвалентном состоянии, стабилизированные АГ, находящимся в аморфной фазе. Параметры ячейки серебра - 0,4 нм. Частицы серебра имеют сферическую форму, размер варьируется от 3 до 27 нм. Нанобиокомпозит является узкодисперсным: доля частиц с размерами в интервале 6-12 нм составляет 80%, содержание серебра - 16,73%. Молекулярная масса около 12 кДа [10].
Несмотря на фактическую полезность серебра в макроформе, в настоящее время известно, что его наночастицы обладают различными видами токсичности. Определено, что действие наночастиц серебра зависит от нескольких параметров, критическими из которых являются доза и способ введения [6]. Наряду с этим установлена высокая стабильность наночастиц серебра в окружающей среде и способность сохранять токсические свойства на протяжении длительного времени [7]. Вместе с тем, практически не изучена токсич-
Титов Евгений Алексеевич (Titov Evgeny Alekseevich), кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Восточно-сибирский научный центр экологии человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, 665827, Иркутская область, г Ангарск, g57097@yandex.ru
Новиков Михаил Александрович (Novikov Mikhail Aleksandrovich), аспирант, младший научный сотрудник лаборатории токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Восточно-сибирский научный центр экологии человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, 665827, Иркутская область, г Ангарск, novik-imt@mail.ru
Токсикологический вестник (127)
ность наносеребра, инкапсулированного в полимерную матрицу. В то же время в наших исследованиях определено, что величина LD50 для ПВТ и нано - Ag - ПВТ лежит за пределами 5000 мг/кг и характеризуется для белых мышей как малоопасная (4-й класс). Одновременно с этим, при изучении ответной реакции организма экспериментальных животных на введение нано - Ag - АГ установлено повышение активности процессов АОС при отсутствии изменений в системе ПОЛ [8].
Несмотря на наличие множества работ, посвященных токсическим свойствам наносеребра, перспективность широкого внедрения нанобиокомпозитов требует своевременного углубленного изучения биологических эффектов наноча-стиц серебра, инкансулировнных в полимерную матрицу. В связи с этим целью настоящей работы явилось исследование биологического действия на ткань головного мозга белых крыс образцов полимерных нанокомпозитов нано - Ag -ПВТ и нано - Ag- АГ на клеточном и субклеточном уровнях.
Материалы и методы исследования. Для проведения исследования из вивария ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН получены пятьдесят шесть особей нелинейных белых крыс-самцов в трехмесячном возрасте массой от 240 до 280 г. Животные содержались в специальном помещении с 12-часовым светлым/темным циклом, регулируемой температурой (22 ± 3°С) и влажностью, со свободным доступом к чистой водопроводной воде и пище, включающей в себя все необходимые витамины и микроэлементы. Все исследования на животных были проведены в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986), а также «Правил лабораторной практики» (приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н). Группы животных подбирались в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка безопасности наноматериалов», утвержденными приказом № 280 от 12 октября 2007 г. (Москва, Россия).
Животные (п=56) были разбиты на 7 групп методом рандомизации. Белым крысам второй группы (п=8) на протяжении 9 дней внутрижелудочно через зонд вводили 0,5 мл водного раствора ПВТ без добавления наночастиц серебра, животным третьей группы (п=8) вводили внутрижелудочно водный раствор нано - Ag - ПВТ из расчета 100 мкг серебра на килограмм массы тела в объеме 0,5 мл дистиллированной воды. Животные четвертой группы (п=8) получали водный раствор нано - Ag - ПВТ в эквивалентной дозе 500 мкг серебра на килограмм массы в объеме 0,5 мл. Особи пятой группы (п=8) получали 0,5 мл водного раствора АГ. Животным шестой (п=8) и седьмой (п=8) групп внутрижелудочно через зонд на протяжении 9 дней вводили водный раствор нано - Ag- АГ из расчета 100 мкг и 500 мкг серебра на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольные животные (п=8) - 0,5 мл дистиллированной воды (группа 1).
На следующий день после окончания воздействия животным была проведена эфтаназия путем декапитации. Головной мозг от каждого исследуемого животного был извлечен и фиксирован в нейтральном буферном растворе формалина (10%), обезвожен этанолом восходящей концентрации (70, 80, 90, 95 и 100%) и помещен в гомогенизированную парафиновую среду для гистологических исследований HistoMix
(BioVitrum, Россия). Далее приготовленные с помощью микротома HM 400 (Microm, Германия) срезы толщиной 4-5 мкм окрашивались на обычных гистологических предметных стеклах гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии. Дополнительно для визуализации нервных клеток проводили окраску по Нисслю. Исследование полученных срезов осуществлялось при помощи светооптиче-ского исследовательского микроскопа Olympus BX 51(Япо-ния) с вводом микроизображений в компьютер при помощи камеры Olympus.
Для исследования биологического действия на субклеточном уровне применялся иммуногистохимический метод определения активности белка bcl-2, являющегося одним из основных регуляторов апоптоза. Полученные на микротоме срезы были помещены на полизиновые стекла (Menzel, Германия) и окрашены на антитела к белку апоптоза Ьс1-2 (Monosan, Нидерланды) в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Окрашенные срезы фиксировались полистиролом и накрывались покровным стеклом. После высыхания полистирола полученные микропрепараты просматривались на светооптическом исследовательском микроскопе. Далее при помощи системы микроскопии и анализа Image Scope S были проанализированы заранее выбранные параметры анализа полученных фотоматериалов: общее количество нейронов, количество окрашенных нейронов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0» (Statsoft, США). Статистическую значимость различий в независимых выборках определяли по методу Манна-Уитни. Достигнутый уровень значимости признаков - при p < 0,05.
Результаты и обсуждение. По результатам гистологических исследований воздействия изучаемых биосубстратов в дозе 100 мкг серебра на 1 кг массы тела в ткани коры головного мозга при воздействии нано - Ag - ПВТ отмечался выраженный периваскулярный отек сосудов головного мозга (рис. 1), а также набухание проводящих волокон в подкорковых структурах (рис. 2), что может быть обусловлено метаболическими нарушениями в нервной ткани при проникновении чужеродного агента через гематоэнцефалический барьер. Введение животным ПВТ без наночастиц серебра повлияло на исследуемую ткань незначительно: в коре головного мозга наблюдался стаз сосудов, что, по нашему мнению, может быть результатом адгезии форменных элементов крови к ПВТ. Введение «чистого» АГ вызывало набухание оболочки мозга, расширение сосудов и разрыхление нейро-пиля (рис. 3). При введении нано - Ag - АГ, наряду с аналогичными при введении АГ эффектами (рис. 4), повреждения усугубились очаговым набуханием проводящих волокон в подкорковых структурах (рис. 5).
По результатам имунногистохимического анализа экспрессии белка bcl-2 выяснено, что введение изучаемых доз нанокомпозитов достоверно не повлияло на общее количество клеток на единицу ткани (табл. 1), что, как мы предполагаем, связано с недостаточным временем экспозиции вводимого вещества. Однако по результатам подсчёта числа экспрессированых клеток в 60 полях зрения было достоверно выявлено увеличение клеток с экспрессией белка в срезах головного мозга животных, подвергавшихся воздействию
нанобиокомпозита в различных дозировках. Также отмечено увеличение по сравнению с контролем количества окрашенных клеток в срезах головного мозга животных, подвергавшихся воздействию веществ без добавления наночастиц серебра, что, по нашему мнению, связано с ответной реакцией нейронов на введение чужеродного агента и косвенно может свидетельствовать о проникновении фрагментов полимеров через гематоэнцефалический барьер. Однако в данных срезах зафиксировано наименьшее из всех исследуемых опытных групп количество окрашенных клеток.
Напротив, в срезах головного мозга животных, экспонированных нанобиокомпозитами, имеющими в своем составе наночастицы серебра, выявлено существенное увеличение числа окрашенных клеток по сравнению как с контролем, так и с введением «чистого» полимера. Причем выявлялась прямая зависимость между вводимой дозой наносеребра и изменением процентного количества окрашенных клеток. Аналогичные результаты получены группой ученых из Оренбурга при изучении готовности клеток к апоптозу после введения наночастиц меди, изученных по экспрессии каспазы - 3 [9].
В целом морфологическое исследование головного мозга лабораторных животных, подвергавшихся воздействию серебросодержащих полимерных нанокомпозитов, выяви-
ло изменения, обычно сопровождающие метаболические сдвиги в структуре клеток и тканей. Вероятно, это связано с развитием компенсаторно-приспособительных реакций, возникающих в ответ на введение чужеродного агента и характерно для перестройки функционального состояния организма на новый устойчивый уровень.
Заключение. Все вышеописанное позволяет заключить, что наночастицы серебра проникают через гематоэнцефа-лический барьер и, депонируясь в ткани головного мозга, приводят к структурным нарушениям, а также вызывают гиперхроматоз клеток головного мозга, свидетельствующий об активации белка-ингибитора апоптоза Ьс1-2. В совокупности это позволяет предположить, что апоптоз клеток может являться критериальным показателем для оценки биологических эффектов действия наночастиц металлов в составе нанокомпозитов на живой организм. Дальнейшее изучение биологического ответа организма на введение данных нанокомпозитов позволит определить допустимые пути и дозы введения веществ, которые планируется использовать в качестве биопрепаратов.
■ ■ ( я 4 (! 1
КГ
Рис. 1. Нано - А§ - ПВТ. Мозг Периваскулярный отек сосудов головного мозга (А). Гематоксилин-эозин. УвХ400.
Рис. 3. АГ. Набухание оболочки головного мозга (А), разрыхление нейропиля под оболочкой (Б), расширение сосудов оболочки (В). Гематоксилин-эозин. УвХ400.
Л «»
Рис. 2. Нано - А§ - ПВТ. Мозг Незначительное набухание проводящих волокон (А).Гематоксилин-эозин. УвХ400.
Рис. 4. Нано - А§ - АГ. Набухание эпендимы (А), стаз сосудов эпендимы (Б), разрыхление нейропиля под эпендимой (В).Гематоксилин-эозин. УвХ400.
Токсикологический вестник (127)
У i
-- » it ■ / -V
■ А f <*
f, " t
4 (/ *
Рис. 5. Нано - Ag - АГ. Очаговое набухание проводящих волокон в подкорковых структурах (А). Гематоксилин-эозин. УвХ400.
Таблица 1
Экспрессия белка bel-2 в ткани головного мозга при воздействии исследуемых доз веществ.
Med(Q25 - Q75)n=60
Номер группы животных Общее количество клеток Количество окрашенных клеток % окрашенных клеток от общего числа клеток
1 287,5 (264-306) 11,6 (2-18) 1,02
2 232,3 (196-271) 10 (4-11)* 2,8*
3 281 (275-308) 17,9 (4-22)* 4,3*#
4 313,6 (276-350) 7 (5-9)* • 6,9*#
5 178,3 (156-214) 10 (4-11)* 2,5*
6 172(156-190) 17,9 (4-22)* 4,2*±
7 185,6 (170-210) 7 (5-9)* 6,7*±®
Примечание: * - различия статистически значимы при сравнении с контрольной группой р<0,05; # - различия статистически значимы при сравнении со 2-й группой р<0,05; ® - различия статистически значимы при сравнении с 3-й группой р<0,05; ± - различия статистически значимы при сравнении с 5-й группой; ® - различия статистически значимы при сравнении с 6-й группой. Статистическая значимость рассчитывалась по Манна-Уитни.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Woraz K. Antimicrobial property of silver// Toxicology. 2001. №12. Р. 89-93.
2. Дубровина В.И., Медведева СА., Александрова Г.П., Тюкавкина НА., Голубинский Е.П., Иванова Т.А., Коновалова ЖА. Иммуномодулирующие свойства арабиногалактана лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) // Фармация. 2001. № 5.
С. 26-27.
3. Колхир В.К., Тюкавкина НА., Багинская А.И., Минеева М.Ф.,
Руленко ИА., Стрелкова Л.Б., Лескова Т.Е., Колесник Ю.А., Фатеева Т.Н.// Тезисы докладов 3-го Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М., 1996. С. 27.
4. ПрозороваГ.Ф., Коржова СА., Конькова Т.В., Ермакова Т.Г. Особенности формирования наночастиц серебра в полимерной матрице // Доклады Академии наук. 2011. Т. 437. № 1.
C. 50-52.
5. Medvedeva S., Aleksandrova G., Grischenko L. Transformation of larch polysaccharide. // The 11th Intern. Symposium on Wood Pulp Chemestry Nice, France. 2001. Vol. II. P. 123-126.
6. Witt K.L., Livanos E., Kissling G.E., Torous
D.K. et al. Comparison of flow cytometry-and microscopy-based methods for measuring micronucleated reticulocyte frequencies
in rodents treated with nongenotoxic and genotoxic chemicals // Mutation research.
2008. Vol. 649. P. 101-113.
7. Yen H.-J., Hsu S.-h., Tsai Ch.-L. Cytotoxicity and immunological response of gold and silver nanoparticles of different sizes // Small. 2009. Vol. 5. P. 1553-1561.
8. НовиковМА.,. Титов ЕА, Вокина ВА., Якимова Н.Л., Соседова Л.М., Коржова СА., Поздняков А.С., Емельянов А.И., Пройдакова О.А., Ермакова Т.Г., Прозорова Г.Ф. Биологические эффекты нового серебросодержащего полимерного нанокомпозита // Бюллетень ВСНЦ ЭЧ СО РАМН. 2012. №4 (84), часть 2. С.121-125.
9. Мирошников СА., Полякова В.С., Лебедев С.В., Глущенко Н.Н. Наночастицы меди - модуляторы апоптоза и структурных
изменений во внутренних органах// Морфология. 2013. №4 (144). С. 47-52. 10. Shurygina IA., Sukhov B.G., Fadeeva T. V, Umanets V.A., ShuryginM.G., Ganenko T.V, Kostyro YA., Grigoriev E.G., Trofimov BA. Bactericidal action of Ag(0)-antithrombotic sulfated arabinogalactan nanocomposite: coevolution of initial nanocomposite and living microbial cell to a novel nonliving nanocomposite // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2011. №7. Р. 827-833.
REFERENCES:
1. Woraz K. Antimicrobial property of silver// Toxicology. 2001. №12. P. 89-93.
2. Dubrovina V.I., Medvedeva SA., Aleksandrova G.P., Tukavkina N.A., Golubinskiy E.P., Ivanova T.A., Konovalova Zh. A. Immunomodeling properties of Larix sibirica L. Arabinogalactan // Pharmacy. 2001. № 5. P. 26-27. (in Russian)
3. Kolhir V.K., Tukavkina N.A., Baginskaya A.I., Mineeva M.Ph., Rulenko IA., Strelkova L.B., Leskova T.E., Kolesnik Yu.A., Fateeva T.N. // Abstracts of 3rd Russian National Congress «Man and medicine». M., 1996. P. 27. (in Russian)
4. Prozorova G.F., Korzhova SA., Kon'kova T.V, Ermakova T.G. Features of of silver
nanoparticles formation in the polymer matrix // Reports of Academy of Sciences. 2011. T. 437. № 1. P. 50-52. (In Russian)
5. Medvedeva S., Aleksandrova G., Grischenko L. Transformation
of larch polysaccharide. // The 11th Intern. Symposium on Wood Pulp Chemestry Nice, France. 2001. Vol. II. P. 123-126.
6. Witt K.L., Livanos E., Kissling G.E., Torous D.K. et al. Comparison of flow cytometry-and microscopy-based methods for measuring micronucleated reticulocyte frequencies
in rodents treated with nongenotoxic and genotoxic chemicals // Mutation research. 2008. Vol. 649. P. 101-113.
7. Yen H.-J., Hsu S.-h., Tsai Ch.-L.
Cytotoxicity and immunological response of gold and silver nanoparticles of different sizes // Small. 2009. Vol. 5. P. 1553-1561.
8. Novikov MA., Titov E.A., Vokina V.A., Yakimova N.L., Sosedova L.M., Korzhova S.A., PozdnyakovA.S., Emel'yznovA.I., Proidakova OA., Ermakova T.G., Prozorova G.F. Biological effects of a new silver-polymer nanocomposite // Bulletin of ESSC HE SB RAMS. 2012. №4 (84), part 2. C. 121-125. (in Russian)
9. Miroshnikov S.A., Polyakova VS., Lebedev S.V, Glushenko N.N. Copper nanoparticles
- modulators of apoptosis and structural changes in the internal organs // Morphology
- 2013. №4 (144). P. 47-52 (in Russian)
10. Shurygina I.A., Sukhov B.G., Fadeeva T.V, Umanets V.A., ShuryginM.G., Ganenko T.V, Kostyro YA., Grigoriev E.G., Trofimov BA. Bactericidal action of Ag(0)-antithrombotic sulfated arabinogalactan nanocomposite: coevolution of initial nanocomposite and living microbial cell to a novel nonliving nanocomposite // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2011. №7. P. 827-833.
E.A. Titov, M.A. Novikov
B^-2 EXPRESSION AS CRITERIA INDICATOR OF EXPOSURE TO NANOBIOCOMPOSITES
East-Siberian Scientific Center for Human Ecology, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, 665827, Angarsk, Russian Federation
Bd- 2 expression was studied in brain structures at exposure to silver-based polymer nanobiocomposites in sub-acute 9-day experiments in white outbred rats. It was found out that the amount of expressed nerve cells authentically increases and nerve tissue undergoes stricture disorders at exposure to test substances in different doses.
Key words: Nano silver, arabinogalaktan, polyvinyl triazole, immunohistochemistry, Bcl-2, morphology.
Материал поступил в редакцию 30.04.2014 г
