ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ, ОТТЕКАЮЩЕЙ ОТ ГИПОФИЗА, У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ИЦЕНКО-КУШИНГА И АКТГ-ЭКТОПИРОВАННЫМ СИНДРОМОМ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ, ОТТЕКАЮЩЕЙ ОТ ГИПОФИЗА, У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ИЦЕНКО-КУШИНГА И АКТГ-ЭКТОПИРОВАННЫМ СИНДРОМОМ

© А.А. Малыгина1*, Ж.Е. Белая1, А.Г. Никитин2, Ф.А. Кошкин3, И.И. Ситкин1, А.М. Лапшина1, П.М. Хандаева1, А.С. Луценко1, Д.А. Трухина1, Г.А. Мельниченко1

Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии, Москва, Россия Научно-исследовательский институт пульмонологии, Москва, Россия 3Медико-генетический центр «Геномед», Москва, Россия

ОБОСНОВАНИЕ. За последние десятилетия микроРНK зарекомендовали себя как новые маркеры для целого ряда заболеваний. Определение специфичной панели микроРНК отличающей пациентов с болезнью Иценко^ушинга (БИ^ и AKTr-эктопированным синдромом (AKTr-ЭС; AKTr — адренокортикотропный гормон), смогло бы значительно упростить диагностику.

ЦЕЛЬ. Выявить циркулирующие микроРН^ отличающиеся у пациентов с БИK и AKTr-ЭС в плазме крови, оттекающей от гипофиза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Выполнено одноцентровое одномоментное выборочное исследование случай-контроль. Включены 24 пациента с AKTr-зависимым эндогенным гиперкортицизмом (ЭГ), которым требовалось проведение селективного забора крови из нижних каменистых синусов (HKC). Из них 12 пациентов с БИK (м=2, ж=10), возрастная медиана 46,5 [33,8; 53,5] года, и 12 пациентов с AKTr-ЭС (м=4, ж=8), возрастная медиана 54 [38,75; 60,75] года. Образцы плазмы крови из Н^ были получены до введения стимуляционного агента, центрифугированы и заморожены при температуре -80°С. Выделение микроРНK из плазмы крови проводили с помощью miRNeasy SerumlPlasma Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкции компании-производителя на автоматической станции QIAcube (Qiagen, Германия). ^нцентрацию суммарной РНK в водном растворе оценивали на спектрофотометре NanoVue Plus (GE Healthcare, США). Библиотеки были подготовлены с помощью QIAseq miRNA Library Kit согласно стандартным протоколам производителя. Экспрессию микроРНK исследовали с помощью секвенирования на Illumina NextSeq 500 (Illumina NextSeq 500, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Обнаружены 108 дифференциально экспрессирующихся микроРНK (p<0,05) после поправки на множественность сравнений. МикроРНK разделены на три группы — группа 1 с числом прочтений более 10 в обеих группах сравнения, группа 2 — с числом прочтений менее 10 в одной из групп, группа 3 — с числом прочтений менее 10 в обеих группах. Для верификации методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR) планируется использовать следующие микроРН^ miR-383-3p, miR-4290 и miR-6717-5p, экспрессия которых была повышена у пациентов с БИK по сравнению с пациентами из группы А^Г-ЭС в 46,36 (p=0,01), 6,84 (p=0,036) и в 4,49 раза (p=0,031) соответственно, miR-1203, miR-1229-3p, miR-639, экспрессия которых была снижена у пациентов с БИK в 36,74 (p=0,013), 78,3 (p=0,003), 73,22 раза (p=0,002) соответственно, а также miR-302c-3p, экспрессия которой была повышена у пациентов с БИK в 92,69 раза (p=0,001).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. В ходе исследования был значительно расширен список микроРН^кандидатов для диагностики А^Г-зависимых форм ЭГ. Необходима валидизация полученных микроРНK в периферической крови на расширенной выборке пациентов методом RT-qPCR.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: болезнь Иценко-Кушинга; АКТГ-эктопированный синдром; микроРНК; NGS; аденома гипофиза.

DIFFERENCES IN PLASMA MIRNA LEVELS IN INFERIOR PETROSAL SINUS SAMPLES OF PATIENTS WITH ACTH-DEPENDENT CUSHING'S SYNDROME

© Anastasia A. Malygina1*, Zhanna E. Belaya1, Alexey G. Nikitin2, Philipp A. Koshkin3, Ivan I. Sitkin1, Anastasia M. Lapshina1, Patimat M. Khandaeva1, Alexander S. Lutsenko1, Diana A. Trukhina1, Galina A. Melnichenko1

1The National Medical Research Center for Endocrinology, Moscow, Russia 2Pulmonology Scientific Research Institute under FMBA of Russia, Moscow, Russia 3Center of medical genetics «Genomed», Moscow, Russia

BACKGROUND: For the last decades microRNAs (miR) have proven themselves as novel biomarkers for various types of diseases. Identification of specific circulating microRNA panel that differ patient with Cushing's disease (CD) and ectopic ACTH syndrome (EAS) could improve the diagnostic procedure.

© Endocrinology Research Centre, 2021_Received: 14.09.2021. Accepted: 12.11.2021._BY NC ND

AIM: to evaluate the differences in miR levels in plasma samples drained from inferior petrosal sinuses in patients with CD and EAS.

MATERIALS AND METHODS: single-center, case-control study: we enrolled 24 patients with ACTH-dependent Cush-ing's syndrome (CS) requiring bilateral inferior petrosal sinus sampling (BIPSS). Among them 12 subjects were confirmed as CD (males=2, females=10; median age 46,5 [IR 33,8;53,5]) and 12 as EAS (males=4, females=8, median age 54 [IR 38,75;60,75]). BIPSS was performed through a percutaneous bilateral approach. Once catheters were properly placed, blood samples were withdrawn simultaneously from each petrosal sinus and a peripheral vein. Plasma samples from both sinuses were centrifuged and then stored at -80 C. MiRNA isolation from plasma was carried out by an miRneasy Plasma/Serum Kit (Qiagen, Germany) on the automatic QIAcube station according to the manufacturer protocol. To prevent degradation, we added 1 unit of RiboLock Rnase Inhibitor (Thermo Fisher Scientific, USA) per 1 ^L of RNA solution. The concentration of total RNA in the aqueous solution was evaluated on a NanoVue Plus spectrophotometer (GE Healthcare, USA). The libraries were prepared by the QIAseq miRNA Library Kit following the manufacturer standard protocols. MiR expression was then analyzed by sequencing on Illumina NextSeq 500 (Illumina, USA).

RESULTS: 108 miRNAs were differently expressed (p <0,05) in inferior petrosal sinus samples of patients with CD vs EAS. We divided these miRNAs into 3 groups based on the significance of the results. The first group consisted of samples with the highest levels of detected miR in both groups. Four miRNAs were included: miR-1203 was downregulated in CD vs EAS — 36.74 (p=0,013), and three other were upregulated in CD vs EAS: miR-383-3p 46.36 (p=0,01), miR-4290 6.84 (p=0,036), miR-6717-5p 4.49 (p=0,031). This miRs will be validated in larger cohorts using RT-qPCR.

CONCLUSION: Plasma miR levels differ in inferior petrosal samples taken from patients with CD vs EAS. These miRs need to be validated by different methods and in peripheral plasma samples in order to be used as potentially non-invasive biomark-ers to differentiate ACTH-dependent CS.

KEYWORDS: Cushing's disease; ectopic ACTH syndrome; microRNA; NGS.

ОБОСНОВАНИЕ

Болезнь Иценко-Кушинга (БИК) — тяжелое нейроэндо-кринное заболевание, сопровождающееся развитием серьезных инвалидизирующих осложнений и повышенной смертностью [1]. БИК является наиболее частой причиной эндогенного гиперкортицизма (ЭГ) (до 70-80% случаев) [2], характеризуется гиперкортизолемией, развившейся вследствие гиперпродукции адренокортикотропного гормона (АКТГ) кортикотропиномой гипофиза [3]. Женщины болеют чаще мужчин в соотношении 3-4:1 [4]. Другой АКТГ-зависимой формой ЭГ является АКТГ-эктопирован-ный синдром (АКТГ-ЭС) (5-10%) [5], когда симптомоком-плекс гиперкортицизма развивается вследствие паранео-пластического синдрома и источник гиперпродукции АКТГ находится в других органах и тканях — в легких, тимусе, щитовидной железе, поджелудочной железе, толстом кишечнике и др. [6]. При этом приблизительно в 19% случаев АКТГ-ЭС локализовать опухоль не удается [7]. АКТГ-ЭС одинаково распространен как среди мужчин, так и среди женщин [7]. Клиническая картина БИК и АКТГ-ЭС обусловлена в первую очередь проявлениями хронической гиперкортизолемии и характеризуется перераспределением подкожножировой клетчатки, повышением артериального давления, нарушением углеводного обмена, образованием характерных багровых стрий на поверхности передней брюшной стенки, груди, плеч, матронизмом, мышечной слабостью, патологическими переломами костей скелета, ломкостью капилляров (приводящей к легкому образованию кровоизлияний, экхимозов и петехий), нарушением менструальной функции у женщин, снижением потенции у мужчин [8, 9]. Несмотря на то что причины гиперпродукции АКТГ разные и тактики лечения, соответственно, тоже, установить диагноз по сумме клинических проявлений и комплекса лабораторно-инструментальных исследований не всегда

представляется возможным. В связи с этим ряд пациентов за все годы активного лечения АКТГ-зависимого ЭГ проходили через заведомо неэффективные вмешательства на гипофизе в виде транссфеноидальной аденомэктомии или радиохирургии [10]. Причинами этого являются несовершенство имеющихся в арсенале врача методов лабораторной диагностики, отсутствие высокочувствительных тестов для дифференциальной диагностики АКТГ-зависи-мых форм ЭГ [11]. Несмотря на то что разрабатываются не-инвазивные алгоритмы дифференциальной диагностики из имеющихся тестов и проб, золотым стандартом остается селективный забор крови из нижних каменистых синусов (НКС) [12, 13]. Ценность селективного забора крови из НКС неоспорима, однако данная процедура инвазивна и требует оснащенной рентген-операционной и высокой квалификации сосудистого хирурга. Чувствительность и специфичность селективного забора крови варьируют в пределах 88-100 и 67-100 соответственно [14]. Такая разница в показателях эффективности частично объясняется разной методологией проведения процедуры (наличие/отсутствие стимулирующего агента) и опытностью хирургов. Критически важным этапом, влияющим на ценность результата всей процедуры, является правильное позиционирование катетеров в НКС, для подтверждения чего предложено использовать определение градиента пролактина до введения стимулирующего агента [15]. Тем не менее такой контроль проводится не всегда, отчего повышаются шансы ошибочного заключения. К наиболее частым побочным эффектам относится гематома в области венепункции, тем не менее зарегистрированы случаи и более серьезных осложнений, таких как перфорации бедренной вены, формирование артериовенозной фистулы, тромбоз глубоких вен, тромбоэмболии легочной артерии и даже случай летального исхода в результате тромбоза кавернозного синуса [16]. Учитывая трудоемкость селективного забора, для улучшения дифференциальной

диагностики АКТГ-зависимого ЭГ необходимы более доступные и неинвазивные методы.

МикроРНК — класс малых (~23 нуклеотида) некодиру-ющих молекул РНК, играющих важную роль в посттранскрипционной регуляции генов через связывание с матричной РНК (мРНК). Как правило, связь микроРНК с мРНК приводит к ее деградации или препятствует считыванию белок-кодирующей последовательности [17]. Первые микроРНК были открыты более 20 лет назад, однако прошло более 10 лет, прежде чем эти молекулы из биологии начали «приходить» в медицинские исследования [18-22]. Будучи достаточно стабильными циркулирующими молекулами, концентрацию которых можно измерить в разных биологических жидкостях, микроРНК могут служить надежными онкомаркерами [23]. В 2002 г. было впервые описано влияние измененного уровня экспрессии конкретных микроРНК на развитие онкологического заболевания — сниженный уровень экспрессии т1М5 и т1М6, возникающий при делеции ^14.3, приводит к развитию хронического лимфолейкоза [24]. Далее последовал целый ряд исследований по поиску изменений в экспрессии микроРНК, характерных для различных неоплазий, и на данный момент найдены специфические изменения профилей микроРНК при раке простаты [25], молочной железы [26], шейки матки [27], легких [28] и др.

В 2015 г. на базе ФГБУ ЭНЦ Минздрава России было выполнено исследование уровня экспрессии ранее описанных в литературе микроРНК в плазме крови пациентов с АКТГ-зависимым ЭГ [29]. В исследовании участвовал 41 пациент с АКТГ-зависимым ЭГ (п=28 БИК, п=13 АКТГ-ЭС) и 11 человек из группы контроля. У всехучастников выполнен забор плазмы крови натощак, проведен анализ 21 микроРНК (т1М0Ь-5р, т1М29-5р, т1М33а-5р, т^-141-3р, т1М43-3р, тнМ45-5р, т^-150-3р, т^-15а-5р, т^-16-5р, т1М46а-5р, т^-185-3р, т^-191-5р, т^-203а-5р, т1К-210-5р, т^-211-5р, т^-31-5р, т^-409-3р, т^-409-5р, т^-431-5р, т^-488-3р, т^-7д-5р) методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (КТ^РСК). Статистически значимая разница уровня экспрессии между пациентами с БИК и АКТГ-ЭС была обнаружена по уровням т^-16-5р [45,04 (95% доверительный интервал (ДИ) 28,77-61,31) у пациентов с БИК уб. 5,26 (95% ДИ 2,65-7,87) в группе АКТГ-ЭС, р<0,001; q=0,001], т^-145-5р [0,097 (95% ДИ 0,027-0,167) у пациентов с БИК уб. неопределяемый уровень у пациентов с АКТГ-ЭС, р=0,008; q=0,087] и т^-7д-5р [1,842 (95% ДИ 1,283-2,400) у пациентов в БИК уб. 0,847 (95% ДИ 0,187-1,507) в группе АКТГ-ЭС, р=0,02; q=0,14]. Таким образом, было выявлено 3 микроРНК, статистически значимо отличающихся у пациентов с БИК и АКТГ-ЭС, при этом наибольшие различия показала т1М6-5р, уровень экспрессии которой отличался не только между пациентами с разным генезом АКТГ-зависимого ЭГ, но также между пациентами с разными формами АКТГ-зависимого ЭГ и здоровыми добровольцами.

Планировалось провести анализ экспрессии микроРНК в крови, оттекающей от гипофиза, у пациентов с разными формами АКТГ-зависимого гиперкортицизма методом высокопроизводительного секвенирования в целях выявления большего количества микроРНК, потенциально пригодных для формирования панели для дифференциальной диагностики АКТГ-зависимых форм ЭГ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выявить различно экспрессирующиеся циркулирующие микроРНК в плазме крови из НКС у пациентов с БИК и АКТГ-ЭС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Исследование проведено на базе отделения нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России. Высокопроизводительное секвенирование выполнено на базе лаборатории «Геномед». Выделение микроРНК и биоин-форматический анализ полученных данных выполнены на базе ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России.

Время исследования. Набор пациентов осуществлялся с сентября 2017 г. по май 2019 г.

Изучаемые популяции

В исследование были включены пациенты с подтвержденным диагнозом АКТГ-зависимого гиперкортицизма, поступившие в отделение нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России для проведения селективного забора крови из НКС.

Критерии включения: АКТГ-зависимый гиперкорти-цизм, подтвержденный на основании критериев, установленных действующими клиническими рекомендациями по диагностике БИК; аденома гипофиза менее 6 мм в диаметре, или отсутствие визуализации аденомы по данным МРТ, или неэффективная транссфеноидальная аденомэк-томия в анамнезе при отсутствии данных гистологического исследования послеоперационного материала.

Критерии исключения: возраст моложе 18 лет, прием препаратов, снижающих уровень кортизола, тяжелые системные заболевания, беременность, множественные метастатические поражения у пациентов с АКТГ-ЭС.

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое одномоментное выборочное исследование случай-контроль.

Описание медицинского вмешательства (для интервенционных исследований)

Всем пациентам выполнена процедура селективного забора крови из НКС. Доступ осуществлялся через бедренную вену, через которую под рентгенологическим контролем после установки интродьюсеров 4F и 5F проводились многоцелевые катетеры 4F, которые устанавливались в правом и левом НКС. До введения стимуляционного агента осуществлялся забор плазмы крови из НКС в пробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА). Далее проводились двукратное центрифугирование образцов (лабораторная центрифуга Eppendorf 5810R с комплектом роторов (А-4-81, Ф-4-81 -MTP/Flex, FA-45-30-11 и F-45-48-PCR)) на скорости 3000 оборотов в минуту в течение 15 мин при температуре +5оС, забор плазмы и замораживание материала при температуре -80 оС до дальнейшего анализа.

Методы

Перед проведением селективного забора крови из НКС все пациенты проходили лабораторное обследование для подтверждения активности гиперкортицизма:

выполнялись анализ слюны на кортизол в 23:00 на автоматическом анализаторе Cobas е601 фирмы F. Hoffmann-LaRocheLtd (каталожный № 11875116 122), используя метод электрохемилюминесцентного анализа (ЭХЛА) (точка разделения 9,4 нмоль!л) [30], сбор суточной мочи с определением свободного кортизола иммунохемилю-минесцентным методом на аппарате Vitros ECi с предварительной экстракцией диэтиловым эфиром (рефе-ренсный интервал 60-413 нмоль!сут), малая проба с 1 мг дексаметазона (точка разделения более 50 нмоль!л), для оценки генеза ЭГ выполнялся анализ крови на AKTr утром (референсный интервал 7-66 пг!мл), значение кортизола утром, равное или более 10 пг!мл, указывало на центральный генез ЭГ. Для оценки циркадного ритма выработки А^Г оценивался его уровень в 23:00 (референсный интервал 0-30 пг!мл). Исследование уровней кортизола и А^Г плазмы крови выполнено на элек-трохемилюминесцентных анализаторах фирмы Roche (Elecsys 2010; Cobas e601) стандартными наборами фирмы F. Hoffmann-La Roche Ltd.

Всем пациентам была выполнена MPT гипофиза в целях поиска аденомы на магнитно-резонансном томографе Magnetom Harmony (Siemens, Германия) с введением контрастного вещества по показаниям.

Выделение микpоPНK из плазмы крови проводили с помощью miRNeasy SerumIPlasma Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкции компании-производителя на автоматической станции QIAcube (Qiagen, Германия). Для предотвращения деградации в выделенную PHK добавляли 1 ед. RiboLock RNase Inhibitor (Thermo Fisher Scientifi», США) на 1 мкл раствора нуклеиновых кислот. ^нцентрацию суммарной PHK в водном растворе оценивали на спектрофотометре NanoVue Plus (GE Healthcare, Великобритания). Для дальнейшей работы отбирали образцы с концентрацией суммарной PHK в водном растворе не ниже 5 нг!мкл. Экспрессию микpоPНK анализировали с помощью секвенирования на Illumina NextSeq 500 (Illumina NextSeq 500, США). Библиотеки были подготовлены с помощью QIAseq miRNA Library Kit в соответствии со стандартными протоколами производителя. ^нтроль качества библиотек выполнялся на Lab Chip GX. Биоинформационная обработка была следующей: адаптеры удалялись с помощью Cutadapt; полученные файлы FASTQ были затем картированы на геном человека (сборка GRCh37) с помощью bowtie2. FastQC использовался в качестве инструмента для визуализации различных измерений контроля качества. Для каждого образца последовательности аннотировалась с использованием баз данных человеческих пpe-микpоPНK

и зрелых микроРНК, предоставленных в miRBase (http:// microrna.sanger.ac.uk/sequences/) с помощью SeqBuster. TargetScan, Diana-TarBase v8 и mirPath v.3, были использованы для предсказания мишеней. Платформа miRNet использовалась для анализа взаимодействия микроРНК и их генов-мишеней.

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался ввиду редкости заболевания. Основные количественные характеристики пациентов представлены в виде медианы и интерквартильного размаха. Сравнение описательных параметров пациентов с БИК и АКТГ-ЭС выполнено с использованием непарных двусторонних t-тестов. Для сравнения качественных параметров двух независимых групп использован точный критерий Фишера. Статистически значимым считалось значение p<0,05. Аналитическая статистика выполнена с помощью статистического пакета SPSS 23.0. Биоинформати-ческий анализ данных секвенирования выполнен при помощи пакета DESeq2.

Этическая экспертиза

Проведение исследования было одобрено комитетом по этике ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России (протокол №1 от 25.01.2017 г.) в рамках темы «Постгеномные технологии и неинвазив-ные методы в диагностике эндогенного гиперкортициз-ма и его АКТГ-зависимых форм».

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследование включены 12 пациентов с диагнозом БИК и 12 пациентов с диагнозом АКТГ-ЭС. Исходные характеристики участников исследования сведены в таблице 1. В группе пациентов с БИК у 3 (25%) не было выявлено аденомы гипофиза по данным МРТ, у 9 пациентов (75%) по данным МРТ было выявлено образование гипофиза менее 6 мм, в связи с чем и был выполнен селективный забор крови из НКС. В когорте пациентов с АКТГ-ЭС у 7 пациентов (58,3%) была обнаружена нейроэндокрин-ная опухоль (НЭО) легкого, у 1 пациента (8,3%) — НЭО правого надпочечника, у 1 пациента (8,3%) — НЭО поджелудочной железы, у 3 пациентов (24,9%) источник эктопической продукции АКТГ не идентифицирован. Окончательный диагноз устанавливался на основании клинической и лабораторной ремиссии после операции, а также по данным иммуногистохимического (ИГХ)

Таблица 1. Сравнительная характеристика участников исследования

Параметры БИК АКТГ-ЭС P

^личество 12 12

Возраст, годы 46,5 [33,8; 53,5] 54 [38,75; 60,75] 0,343

Пол(м!ж) 2I10 4I8 0,515

ИMT, кг!м2 30,7 [29,8; 36,2] 33,4 [24,6; 41,4] 0,987

А^Г крови в 23:00, пг!мл 51,3 [35; 73,9] 112,8 [66,3; 193,7] 0,007

БИК — болезнь Иценко-Кушинга, АКТГ-ЭС — АКТГ-эктопированный синдром, ИМТ — индекс массы тела, АКТГ — адренокортикотропный гормон, Р — уровень значимости, п — количество пациентов, м — мужчины, ж — женщины.

Таблица 2. Результаты иммуногистохимического исследования послеоперационного материала пациентов с болезнью Иценко-Кушинга

Таблица 4. МикроРНК с числом прочтений менее 10 в одной из групп (группа 2)

№

ИГХ

1 ПГК

2 РГК

3 РГК

4 РГК

5 ПГК

6 ПГК

При дорезке с блока в срезах, 7 окрашенных гематоксилином и эозином, импрегнацией серебром и ИГХ с антителами к АКТГ опухолевой ткани не обнаружено.

ПГК — плотногранулированная кортикотропинома, РГК — редкограну-лированная кортикотропинома.

исследования послеоперационного материала. Пациенты, у которых в результате селективного забора крови из НКС был подтвержден центральный генез ЭГ, были направлены на нейрохирургическое лечение в отделение нейрохирургии ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России. У 11 из 12 пациентов зарегистрирована послеоперационная ремиссия, у 1 пациентки после выполнения повторной транссфеноидальной аденомэк-томии ремиссии достигнуто не было, учитывая тяжесть состояния было принято решение о проведении двусторонней адреналэктомии. ИГХ-исследование было выполнено на 7 образцах послеоперационного материала: в 3 случаях выявлена плотногранулированная кортикотропинома, еще в 3 случаях — редкогранулированная кортикотропинома, в одном случае опухолевой ткани выявлено не было (табл. 2).

Основные результаты исследования

Были обнаружены 108 дифференциально экспресси-рующихся микроРНК с уровнем значимости <0,05 после поправки на множественность сравнений. По достоверности обнаруженных различий микроРНК разделены на три группы — группа 1 с числом прочтений более 10 в обеих группах сравнения (табл. 3), группа 2 с числом прочтений менее 10 в одной из групп, группа 3 с числом прочтений менее 10 в обеих группах (табл. 4 и 5). Для групп 2 и 3 из-за низкой представленности микроРНК потребуется большее количество образцов в группах при валидации обнаруженных изменений с помощью

Таблица 3. МикроРНК с числом прочтений более 10 для обеих групп сравнения (группа 1)

микроРНК Изменение экспрессии Уровень значимости p

hsa-miR-1203 -36,74 0,013

hsa-miR-383-3p 46,36 0,01

hsa-miR-4290 6,84 0,036

hsa-miR-6717-5p 4,49 0,031

В столбце «Изменение экспрессии» указано, во сколько раз экспрессия микроРНК больше или меньше (в случае отрицательного значения) у пациентов с БИК по сравнению с пациентами с АКТГ-ЭС.

микроРНК Изменение экспрессии Уровень значимости р

m R-1185-2-3p 26,23 0,038

m R-1229-3p -78,3 0,003

m R-1238-5p 22,61 0,05

m R-1265 85,85 0,003

m R-1267 31,39 0,012

m R-1294 -21,65 0,036

m R-138-5p 30,44 0,005

m R-15b-3p -14,29 0,036

m R-2114-3p 23,7 0,044

m R-2116-5p 35,37 0,022

m R-302c-3p 92,69 0,001

m R-31-5p 30,89 0,029

m R-3145-5p 32,13 0,027

m R-335-5p 36,81 0,012

m R-3683 -49,02 0,007

m R-3692-3p -33,5 0,015

m R-376b-5p 32,52 0,021

m R-3928-3p 44,64 0,002

m R-3939 11,06 0,04

m R-4287 -43,19 0,013

m R-4427 -20,01 0,019

m R-4470 -60,35 0,005

m R-4476 24,31 0,042

m R-4516 11,34 0,045

m R-4632-3p -42,63 0,011

m R-4693-5p 176,66 0,0001

m R-4752 72,89 0,006

m R-4771 24,24 0,036

m R-4792 33,77 0,014

m R-4804-5p 106,51 0,001

m R-504-5p 28,22 0,027

m R-505-5p -48,24 0,004

m R-5100 56,83 0,001

m R-519e-5p 96,19 0,001

m R-521 -34,78 0,014

m R-532-5p 79,29 0,002

m R-548ay-3p 98,87 0,001

m R-548w 93,25 0,001

m R-555 23,77 0,044

m R-5584-3p 90,89 0,001

m R-5702 168,27 8,268

m R-613 -22,19 0,048

m R-639 -73,22 0,002

m R-6508-5p 50,38 0,009

m R-6735-5p 80,64 0,002

m R-6739-5p 28,9 0,014

m R-6784-5p 58,52 0,006

m R-6790-3p -19,75 0,032

m R-6796-5p 23,64 0,008

m R-6802-5p 16,47 0,017

m R-6808-5p -17,86 0,032

m R-6866-5p 116,55 0,001

m R-6879-5p 16,16 0,025

m R-6881-3p 44,87 0,001

m R-6881-5p 13,84 0,029

m R-7110-3p 36,64 0,012

m R-7111-3p 113,64 0,001

m R-7975 71,63 0,003

m R-8073 -25,49 0,033

m R-8088 20,53 0,049

m R-877-3p -9,97 0,049

m R-877-5p -20,45 0,048

m R-888-3p 31,28 0,028

Таблица 5. МикроРНК с числом прочтений менее 10 в обеих группах (группа 3)

микроРНК Изменение экспрессии Уровень значимости p

miR-1228-3p 66,25 0,003

miR-1252-5p -24,28 0,029

miR-145-5p 32,67 0,026

miR-16-1-3p 32,67 0,026

miR-21-3p 22,34 0,048

miR-212-5p 26,89 0,036

miR-296-5p 33,91 0,019

miR-298 60,3 0,004

miR-29b-1-5p 42,09 0,013

miR-3125 -33,83 0,009

miR-3202 28,24 0,033

miR-331-5p 23,23 0,039

miR-3922-5p 27,93 0,034

miR-4481 54,11 0,005

miR-4498 26,22 0,038

miR-4645-3p 28,43 0,033

miR-4685-3p 38,67 0,005

miR-4762-3p 65,2 0,004

miR-4773 -27,69 0,029

miR-5003-5p 21,42 0,027

miR-5007-3p 17,35 0,05

miR-513b-5p 29,34 0,031

miR-5583-5p -21,76 0,049

miR-5586-5p 39,09 0,015

miR-5699-3p 48,2 0,01

miR-6507-3p 13,95 0,036

miR-6726-5p 24,48 0,042

miR-6733-5p 27,86 0,034

miR-6739-3p 23,53 0,045

miR-6755-5p 22,5 0,048

miR-6792-5p 21,92 0,034

miR-6805-3p 26,72 0,03

miR-6815-5p 28,28 0,033

miR-6828-3p 29,92 0,03

miR-6846-3p 32,55 0,026

miR-6869-3p 27,96 0,028

miR-6878-3p 59,79 0,003

miR-718 29,96 0,019

miR-8063 21,82 0,044

miR-921 29,28 0,026

miR-93-3p 22,17 0,049

КТ^РСК. Тепловая карта экспрессии 108 микроРНК в группе пациентов с БИК по сравнению с АКТГ-ЭС представлена на рис. 1.

Для дальнейшей верификации методом КТ^РСК планируется использовать следующие наиболее отличающиеся по профилю экспрессии между 2 группами микроРНК: т^-383-3р, т^-4290 и т^-6717-5р, экспрессия которых была повышена в группе пациентов с БИК по сравнению с пациентами из группы АКТГ-ЭС в 46,36 (р=0,01), 6,84 (р=0,03) и 4,49 раза (р=0,03) соответственно, тнК-1203, т^-1229-3р, т^-639, уровень экспрессии которых был снижен у пациентов с БИК по сравнению с пациентами из группы АКТГ-ЭС в 36,74 (р=0,01), 78,3 (р=0,003), 73,22 раза (р=0,002) соответственно, а также т^-302с-3р, уровень экспрессии которой был повышен в группе пациентов с БИК по сравнению с АКТГ-ЭС в 92,69 раза (р=0,001).

Проведенный с помощью mirNet 2.0 [31] анализ показал, что обнаруженные микроРНК регулируют транскрипционные факторы и гены-онкосупрессоры (рис. 2). Значительная часть дифференциально экспрессирую-щихся микроРНК, которые мы обнаружили на первом этапе исследования, связана преимущественно с процессами онкогенеза и различными сигнальными путями, а также процессами передачи сигналов с помощью фокальных контактов. Значительное снижение экспрессии онкосупрессорных miR-302c-3p и miR-383-3p в АКТГ-ЭС может являться следствием происходящих в организме опухолевых процессов.

Нежелательные явления

За время проведения исследования нежелательные события не фиксировались.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сопоставление с другими публикациями

В данном исследовании мы продолжаем поиск различающихся по профилю экспрессии микроРНК у пациентов с БИК и АКТГ-ЭС. Забор крови, оттекающей от гипофиза, осуществлялся непосредственно в ходе проведения селективного забора крови из НКС. Нам удалось выявить порядка 108 микроРНК, которые различно экспрессировались в плазме крови, оттекающей от гипофиза, у пациентов с АКТГ-секретирующей аденомой (БИК) по сравнению со здоровым гипофизом у пациентов с АКТГ-ЭС.

Спустя сравнительно небольшое время после открытия микроРНК их начали изучать в отношении диагностики и дифференциальной диагностики образований гипофиза. Первая публикация результатов исследования относится к 2005 г., когда были впервые описаны изменения микроРНК в ткани аденом гипофиза на основании исследования 10 образцов соматотропином и 10 пролак-тином методом нозерн блоттинга. Была выявлена гипоэкс-прессия тнМ5а и тнК16-1 в тканях аденом по сравнению с тканью здорового гипофиза [32-34]. По данным нашего исследования, тнМ6-1-3р значится в группе 3 с числом прочтений менее 10 в обеих группах сравнения, при этом экспрессия данной микроРНК была в 32,7 раза выше у пациентов с БИК по сравнению с группой пациентов с АКТГ-ЭС (р=0,03). В 2009 г. были опубликованы первые

- hsa-miR-4693-5p

- hsa-miR-5702

" hsamiR-4470

hsamiR-1229-Зр hsa-miR-639 h&a-miR-15b-3p hsa-miR-877-Зр hsa-miR-4773 hsa-miR-8073 h$a-miR-1252-5p hsa-miR-6808-5p hsa-miR-613 hsa-miR-1294 hsa-miR-5583-5p h$a-miR-877-5p hsa-miR-4427 hsamiR-6790-Зр hsa-miR-1203 hsa-miR-521 hsa-miR-3692-3p hsa-miR-3125 hsa-miR-4287 hsa-miR-4632-3p hsa-miR-3683 hsamiR-505-5p hsa-miR-4685-Зр hsa-miR-5586-5p hsa-miR-2116-5p hsa-miR-335-5p hsa-miR-7110-Зр hsa-miR~6508-5p hsa-miR-5699-Зр hsa-miR-29b-1-$p hsa-miR-383-3p hsa-miR-3928-3p hsa-miR-6881-Зр hsa-miR-6726-5p hsa-miR-4476 hsamiR-4771 hsa-miR-33l-5p hsa-miR-6739-Зр hsa-miR-555 hsa-miR-2114-Зр hsa-miR-6796*5p hsa-miR-8088 hsa-miR-1238-Sp hsa-miR-6755-5p hsa-miR-21-Зр hsa-miR-93-3p hsa miR-5003 5p hsa miR 6792 5p hsa-miR-8063 hsa-miR-4792 hsa-miR-296-5p hsa-miR-31-5p hsa-miR-1267 hsa-miR-888-Зр hsa-miR-3145-5p hsa-miR-145-Sp hsa-miR-l6-1-3p h$a-miR-376b-5p hsamiR-6846-Зр hsa-miR-1185-2-3p hsa-miR-4498 ™ -212-5p 6805-Зр h$a-miR-6733-5p hsa-miR-3922-5p h$a-miR-6869-3p hsa-miR-4645-Зр hsa-miR-6815-5p hsa miR-504-5p hsa-miR-3202 hsa-miR-S739-5p hsa-miR-513b-5p hsa-miR-921 hsa-miR-138-5p hsa-miR 6828 3p hsa-miR-718 hsa-miR-4290 hsa-miR-6717-Sp hsa-miR-5007-Зр hsa-miR-6802-5p hsamiR-6879-5p hsa-miR-6881-Sp hsa-miR-6507-Зр hsa-miR-3939 hsa-miR-4516 hsa-miR-4481 hsamiR-5100 hsa-miR-6784-5p hsa-miR-298 hsa-miR-6878-Зр hsa-miR-1228-Зр hsa-miR-4762-Зр hsa-miR-4752 hsamiR-7975 hsa-miR~4804-5p hsa-miR-6866-5p hsa-miR-7111-Зр hsamiR-5584-Зр hsa-miR-302c-3p hsa-miR-548w hsa-miR-519e-5p hsa-miR-548ay-3p hsa-miR-1265 hsa-miR-532-Sp hsa-miR-6735-5p

hsa-miR-212-5| hsa-mjR-6805-Зр

CL

О CL

Изменение экспрессии

Рисунок 1. Тепловая карта экспрессии 108 микроРНК в группе пациентов с болезнью Иценко-Кушинга относительно пациентов с АКТГ-эктопированным синдромом. Синий цвет соответствует низкому уровню экспрессии, желтый — высокому.

результаты исследования экспрессии микроРНК в тканях кортикотропином при сравнении со здоровой тканью гипофиза [35]. При анализе данных 14 пациентов с БИК методом КТ-яРСК в реальном времени было выявлено снижение уровня экспрессии ^-7а, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-141, miR-143, miR-145 и miR-150. По данным нашего исследования, miR-145-5p находится в группе 3 с количеством прочтений менее 10 в обеих группах сравнения, и уровень ее экспрессии был увеличен в группе пациентов с БИК в 32,7 раза (р=0,03), что подтверждает данные, полученные в пилотном исследовании [29], где уровень экспрессии miR-145-5p был также повышен в группе па-

циентов с БИК. В исследовании, опубликованном в 2010 г., было выявлено повышение экспрессии miR-122 и miR-493 в тканях АКТГ-продуцирующих карцином гипофиза при сравнении с тканью кортикотропином и здоровым гипофизом, что потенциально делает их маркерами злокачественности образования [36]. В 2021 г. была опубликована работа, в которой было выполнено сравнение профилей экспрессии микроРНК у пациентов с БИК, кортикостеро-мой надпочечника и здоровым контролем. Были проведены высокопроизводительное секвенирование образцов сыворотки пациентов, а также валидизация полученных микроРНК методом количественной ПЦР. Выявлено,

что т1М82-5р значимо отличалась у пациентов с БИК по сравнению с кортикостеромой надпочечника и группой контроля [37]. В исследовании В. Ы и соавт. изучались взаимосвязь тнМ6 и тенденции аденом гипофиза к инвазии в прилежащие ткани и усиленному росту. Снижение уровня экспрессии тнМ6 было ассоциировано с более интенсивным ростом и склонностью к инвазии опухоли, предположительно через усиление выработки васку-лярного эндотелиального фактора роста (УЕСР2) через УЕСРК2/р38/ЫР-кВ сигнальный путь [38]. В исследовании М Кепре и соавт. также выделяется роль тнМ6 в подавлении миграции, пролиферации и инвазии клеток опухолей гипофиза наравне с тнМ5а и тнМ32, мишенью которых является Бох5 [39]. По данным Р. СагЫс! и соавт., экспрессии тнК-93-3р, тнК-25-3р, тнК-93-5р и т1М06Ь-5р, кодируемые в 13м интроне гена МСМ7, были значительно повышены в тканях инвазивных АКТГ-секретирующих аденом гипофиза, что делает данную панель потенциальным маркером инвазивного характера роста аденомы и фактором риска послеоперационных рецидивов и отсутствия ремиссии у пациентов после нейрохирургического вмешательства по поводу БИК [40].

При помощи базы данных TargetScan был выполнен анализ возможных генов-мишеней выявленных нами микроРНК (табл. 6). В TargetScan оценивается вероятность взаимодействия микроРНК и гена-мишени при помощи

Таблица 6. Некоторые возможные мишени микроРНК по данным базы TargetScan

Общее miR-383-3p miR-4290 miR-639 miR-6717-5p miR-1203 miR-1229-3p

количество

генов- 5483 3978 814 642 1058 4005

мишенеи

USP8 -0,18

PRKAR1A -0,01 -0,09

CABLES1 -0,07 0 -0,01 0

ZNF264 -0,07 -0,07 -0,09

GATA6 -0,03 -0,12 -0,01

CDKN1A -0,14 -0,14 -0,39

CDKN1B -0,46

TSC1 -0,29 -0,07

SSTR2 0

SSTR3 -0,02 -0,48

SSTR5 -0,01 -0,32

TP53 -0,13

VHL -0,33 -0,29

SDHC -0,14 -0,22

MAX -0,17 -0,59

TMEM127 -0,03 -0,13

SOX4 -0,23 -0,3

В таблице представлено значение индекса cumulative weighted context++ score: значения ранжируются от -3 до 1, при этом, чем ближе значение к -3, тем больше вероятность связывания.

Рисунок 2. Карта взаимодействия микроРНК с генами-мишенями [30].

индекса cumulative weighted context++ score на основании 14 показателей вероятности связывания, при этом чем ближе значение к -3, тем больше вероятность воздействия определенной микроРНК на ген. В первую очередь был выполнен поиск связи выявленных микроРНК с описанными в литературе генами, изменения в которых были выявлены у пациентов с БИК и АКТГ-ЭС [41, 42]. Следует отметить, что в базе данных TargetScan не содержится информации о miR-302c-3p. В результате поиска среди возможных мишеней числится USP8 (miR-383-3p), кодирующий убик-витин-специфическую протеазу 8. По разным данным, от 31 до 61% всех соматических мутаций, обнаруженных

Таблица 7. Характеристика возможных генов-мишеней [41-43, 55]

в кортикотропиномах, приходится на активирующие мутации гена USP8 [42]. При таких мутациях предотвращается деградация рецепторов к эпидермальному ростовому фактору (EGF) и стимулируется синтез POMC. Выявлена зависимость данного вида мутации от развития микроаденом гипофиза с высокой АКТГ-секретирующей активностью и склонностью к рецидивированию [43]. На момент написания данной статьи из всех исследованных генетических механизмов формирования кортикотропином мутация гена USP8 является одной из наиболее изученных и доказанных [44]. Описания других возможных генов-мишеней представлены в таблице 7.

Ген

CDKN1A

GATA6

Описание

Кодирует ингибитор циклинзависимых киназ, является

регулятором клеточного цикла, играет ключевую роль в ответе клетки на повреждение ДНК

Кодирует фактор регуляции транскрипции, является онкосупрессором, снижение экспрессии приводит к усилению пролиферации клеток

ZNF264 Кодирует фактор регуляции транскрипции

Кодирует убиквитин-специфическую протеазу 8. Регулирует содержание внутриклеточных USP8 рецепторов EGF в кортикотрофах и влияет на синтез POMC. Активирующая мутация USP 8 является

наиболее часто встречающейся в кортикотропиномах

Ген регуляторной субъединицы I-альфа. Инактивирующая мутация гена PRKAR1A клинически проявляется формированием Карни-комплекса. Описано всего два случая формирования кортикотропином при Карни-комплексе, гораздо чаще встречается первичная пигментная нодулярная надпочечниковая дисплазия с развитием синдрома Кушинга

PRKAR1A

CABLES1 повышает экспрессию р27, который, в свою очередь, блокирует клеточную пролиферацию CABLES1 за счет угнетения рецепторов к эпидермальному ростовому фактору (EGF). Инактивирующая мутация потенциально приводит к онкогенному эффекту

Кодирует ингибитор циклинзависимой киназы 1B р27, являющейся регулятором клеточного цикла CDKN1B (онкосупрессор). Терминальные мутации встречаются у 2% пациентов с синдромом, подобным синдрому множественных эндокринных неоплазий

TSC1

Инактивирующая мутация данного гена приводит к формированию туберозного склероза, для которого кортикотропиномы не специфичны, но тем не менее описаны в литературе

SSTR2

Рецепторы соматостатина 2 подтипа

SSTR3

Рецепторы соматостатина 3 подтипа

SSTR5

TP53

SDHC

MAX

TMEM127

Рецепторы соматостатина 5 подтипа

Кодирует один из ключевых опухолевых супрессоров 0:53). Мутации данного гена встречаются при неоплазиях разного генеза

Герминальная инактивирующая мутация приводит в формирования болезни фон Гиппеля-Линдау УИЬ (УИЬ-синдром), при котором возможно формирование феохромоцитом и нейроэндокринных

опухолей поджелудочной железы, в том числе с секрецией АКТГ и развитием АКТГ-ЭС

Мутации данного гена клинически могут проявляться феохромоцитомой и параганглиомой

Кодирует онкопротеин, участвующий в регуляции клеточного цикла. Клинически мутации в данном гене также могу проявляться феохромоцитомой и параганглиомой

Кодирует трансмембранный протеин 127. Клинически мутации данного гена также описаны при развитии наследственных феохромоцитом и параганглиом

Представитель семейства транскрипционных факторов, играющих ключевую роль в эмбриональном БОХ4 развитии гипофиза. Гиперэкспрессия гена SOX4 обнаружена более чем в 20 видах неоплазий,

данные многочисленных исследований приводят к выводу, что SOX4 является онкогеном

Далее рассмотрим опубликованные данные касательно выявленных в нашем исследовании микроРНК при других новообразованиях и заболеваниях. В 2018 г. было опубликовано исследование влияния высокого уровня экспрессии длинной некодирующей РНК (lcRNA) HOXC13-AS на высокие показатели клеточной миграции и пролиферации в тканях назофарингеальных карцином [45]. В ходе исследования было выявлено, что HOXC13-AS оказывает онкогенное влияние, воздействуя на ось miR-383-3p/HMGA2, а именно снижая уровень экспрессии miR-383-3p и усиливая экспрессию HMGA2. Ранее было выявлено, что miR-383 может играть онкосупрес-сорную роль в культурах клеток рака молочной железы, подавляя экспрессию Gadd45g (growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma) [46]. Подавление экспрессии miR-4290 длинной некодирующей РНК DLX6-AS1 связано с ростом клеток рака желудка и обеспечением анаэробного гликолиза по данным исследования Y. Qian [47]. В исследовании 2020 г. отмечено, что высокий уровень экспрессии miR-1229-3p в клетках аденокарциномы желудка и плазме крови пациентов ассоциирован с резистентностью к химиотерапии, в первую очередь к 5-фторураци-лу, и потенциально может использоваться при выборе дальнейшей тактики ведения пациентов [48]. В другом исследовании было выявлено, что miR-1229-3p участвует в оси взаимодействия с интегрином-бета 8 (ITGB8), и при ее подавлении кольцевой РНК circ_0037655 наблюдается рост клеток глиомы и увеличивается риск метастазирова-ния [49]. Повышенный уровень экспрессии miR-639 ассоциирован с более тяжелой стадией назофарингеальной карциномы и непосредственно влияет на пролиферацию и миграцию клеток [50]. Изменения в экспрессии miR-639 также выявлены в ткани карцином щитовидной железы: в тканях опухоли уровень экспрессии miR-639 был значительно повышен, ассоциирован с клеточной пролиферацией, предположительно действуя на CDKN1A [51]. Тем не менее, по данным исследования G. Xiao и соавт., miR-639, вероятно, служит онкосупрессором, и ее уровень значительно подавлен в ткани рака печени, в первую очередь посредством гиперметилирования ее промоторного участка гена [52]. В исследовании S. Hamada-Tsutsumi выявлено противовирусное действие miR-302c-3p на вирус гепатита B, что делает ее потенциальным терапевтическим агентом [53]. В другом исследовании показано, что данная микроРНК является одним из возможных биомаркеров цирроза печени и гепатобилиарной карциномы в исходе гепатита C: уровень ее экспрессии в плазме крови был значительно повышен в указанных группах пациентов по сравнению с группой контроля [54].

Клиническая значимость результатов

Обнаружение панели дифференциально экспресси-рующихся микроРНК в периферической крови пациентов с БИК и АКТГ-ЭС смогло бы значительно упростить процесс дифференциальной диагностики АКТГ-зависи-мых форм ЭГ, убрав необходимость проведения такой инвазивной, дорогостоящей и высокотехнологической процедуры, как селективный забор крови из НКС. Полученные нами данные станут основой для дальнейшей валидизации наиболее отличающихся между группами микроРНК на расширенной выборке пациентов с использованием метода RT-qPCR.

Ограничения исследования

К ограничениям исследования можно отнести малую выборку пациентов и отсутствие группы контроля. Тем не менее следует отметить, что наибольший интерес для нас представляет выявление микроРНК, отличающихся между группами пациентов с БИК и АКТГ-ЭС, так как планируемая в перспективе специфическая панель микроРНК будет использоваться в случаях уже подтвержденного АКТГ-зависимого гиперкортицизма для дифференциальной диагностики. Также следует отметить, что в нашем исследовании мы изучали микроРНК в материале крови от гипофиза, в дальнейших исследованиях необходима валидизация на образцах периферической крови.

Направления дальнейших исследований

Для подтверждения практической значимости микроРНК для дифференциальной диагностики заболеваний, тем более таких редких, как БИК и АКТГ-ЭС, необходимо проводить дополнительные исследования на широкой выборке пациентов. Таким образом, следующим шагом исследования должна стать валидизация полученных данных в периферической крови на расширенной выборке пациентов методом RT-qPCR.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данном исследовании мы продолжили поиск циркулирующих микроРНК, отличающихся между пациентами с БИК и АКТГ-ЭС. По результатам был значительно расширен список микроРНК, потенциально пригодных для формирования панели для малоинвазивной дифференциальной диагностики АКТГ-зависимых форм ЭГ, в первую очередь за счет miR-383-3p, miR-1229-3p, miR-1203, miR-639, miR-4290, miR-6717-5p, miR-302c-3p. Разработка подобной панели значительно упростила бы диагностику тех противоречивых случаев, когда при подтвержденном ЭГ и высоком уровне АКТГ крови не удается обнаружить аденому гипофиза по данным МРТ или ее размеры не превышают 6 мм. Использование более простого и доступного по сравнению с селективным забором крови из НКС метода дифференциальной диагностики позволило бы избежать возможных диагностических ошибок, в том числе проведения заведомо неэффективного нейрохирургического вмешательства пациентам с АКТГ-ЭС.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование выполнено за счет средств гранта РНФ № 19-15-00398.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Белая Ж.Е., Мельниченко Г.А., Малыгина А.А. — концепция и научное руководство исследования; Малыгина А.А, Ситкин И.И., Хандаева П.М., Трухина Д.А. - сбор материала; Никитин А.Г., Кошкин Ф.А. — выделение РНК и анализ экспрессии микроРНК; Никитин А.Г., Малыгина А.А. — статистическая обработка данных; Малыгина А.А. — написание основного текста рукописи; Белая Ж.Е., Никитин А.Г., Мельниченко Г.А., Луценко А.С., Лапшина А.М. — редактирование текста рукописи. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES

1. Pivonello R, De Martino M, De Leo M, et al. Cushing's disease: the burden of illness. Endocrine. 2016;56(1):10-18. doi: https://doi.org/10.1007/s12020-016-0984-8

2. Lonser R, Nieman L, Oldfield E. Cushing's disease: pathobiology, diagnosis, and management. JNeurosurg. 2017;126(2):404-417. doi: https://doi.org/10.3171/2016.1-jns152119

3. Nieman LK, Biller BM, Findling JW, et al. The diagnosis of Cushing's syndrome: an Endocrine Society Clinical Practice Guideline. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2008;93:1526-1540.

doi: https://doi.org/10.1210/jc.2008-0125

4. Sharma ST, Nieman LK, Feelders RA. Cushing's syndrome: Epidemiology and developments in disease management. Clin Epidemiol. 2015;7:281-293. doi: https://doi.org/10.2147/CLEP.S44336

5. Lacroix A, Feelders R, Stratakis C, Nieman L. Cushing's syndrome. The Lancet. 2015;386(9996):913-927.

doi: https://doi.org/10.1016/s0140-6736(14)61375-1

6. Young J, Haissaguerre M, Viera-Pinto O, et al. Management of endocrine disease: Cushing's syndrome due to ectopic ACTH secretion: an expert operational opinion. Eur J Endocrinol. 2020;182(4):R29-R58. doi: https://doi.org/10.1530/EJE-19-0877

7. Ilias I, Torpy D, Pacak K, et al. Cushing's Syndrome Due to Ectopic Corticotropin Secretion: Twenty Years' Experience at the National Institutes of Health. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2005;90(8):4955-4962. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2004-2527

8. Ситкин И.И., Малыгина А.А., Белая Ж.Е., и др. Значение селективного забора крови из нижних каменистых синусов для дифференциальной диагностики АКТГ-зависимого гиперкортицизма // Эндокринная хирургия. — 2018. — Т. 12. — №2. — С. 89-95. [Sitkin II, Malygina AA, Belaya ZE, et al. Inferior petrosal sinus sampling in differential diagnosis of ACTH-dependent hypercortisolism. EndocrSurg. 2018;12(2):89-95. (In Russ.)].

doi: https://doi.org/10.14341/serg9752

9. Белая Ж.Е., Рожинская Л.Я., Драгунова Н.В., и др. Метаболические осложнения эндогенного гиперкортицизма. Выбор пациентов для скрининга // Ожирение и метаболизм. — 2013. — Т. 10. — № 1. — С. 26-31. [Belaya ZE, Rozhinskaya LY, Dragunova NV, et al. Metabolic complications of endogenous Cushing: patient selection for screening. Obesity and metabolism. 2013;10(1):26-31. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.14341/2071-8713-5068

10. Мельниченко Г.А., Дедов И.И., Белая Ж.Е., и др. Болезнь Иценко-Кушинга: клиника, диагностика, дифференциальная диагностика, методы лечения // Проблемы Эндокринологии. — 2015. — Т. 61. — №2. — С. 55-77. [Melnichenko GA, Dedov II, Belaya ZE, et al. Cushing's disease: the clinical features, diagnostics, differential diagnostics, and methods of treatment. Problems of Endocrinology. 2015;61(2):55-77. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.14341/probl201561255-77

11. Barbot M, Trementino L, Zilio M, et al. Second-line tests in the differential diagnosis of ACTH-dependent Cushing's syndrome. Pituitary. 2016;19(5):488-495. doi: https://doi.org/10.1007/s11102-016-0729-y

12. Reimondo G, Paccotti P, Minetto M, et al. The corticotrophin-releasing hormone test is the most reliable noninvasive method to differentiate pituitary from ectopic ACTH secretion in Cushing's syndrome. Clin Endocrinol (Oxf). 2003;58(6):718-724. doi: https://doi.org/10.1046/j.1365-2265.2003.01776.x

13. Frete C, Corcuff J-B, Kuhn E, et al. Non-invasive Diagnostic Strategy in ACTH-dependent Cushing's Syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(10):3273-3284. doi: https://doi.org/10.1210/clinem/dgaa409

14. Zampetti B, Grossrubatscher E, Dalino Ciaramella P, et al. Bilateral inferior petrosal sinus sampling. Endocr Connect. 2016;5(4):R12-R25. doi: https://doi.org/10.1530/EC-16-0029

15. Белая Ж.Е., Рожинская Л.Я., Мельниченко Г.А., и др. Роль градиента пролактина и АКТГ/пролактин-нормализованного отношения для повышения чувствительности и специфичности селективного забора крови из нижних каменистых синусов для дифференциальной диагностики АКТГ-зависимого гиперкортицизма // Проблемы Эндокринологии. — 2013. — Т. 59. — №4. — С. 3-10. [Belaia ZE, Rozhinskaia LI, Mel'nichenko GA, et al. The role of prolactin gradient and normalized ACTH/prolactin ratio in the improvement of sensitivity and specificity of selective blood sampling from inferior petrosal sinuses for differential diagnostics of ACTH-dependent hypercorticism. Problems of Endocrinology. 2013;59(4):3-10. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.14341/probl20135943-10

16. Losa M, Allora A, Panni P, et al. Bilateral inferior petrosal sinus sampling in adrenocorticotropin-dependent hypercortisolism: always, never, or sometimes?. J Endocrinol Invest. 2019;42(8):997-1000. doi:10.1007/s40618-019-1006-5

17. Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 2009;136(2):215-233. doi: https://doi.org/10.1016/jcell.2009.01.002

18. Belaya Z, Grebennikova T, Melnichenko G, et al. Effects of active acromegaly on bone mRNA and microRNA expression patterns. Eur

J Endocrinol. 2018;178(4):353-364. doi: https://doi.org/10.1530/EJE-17-0772

19. Belaya ZE, Grebennikova TA, Melnichenko GA, et al. Effects of endogenous hypercortisolism on bone mRNA and microRNA expression in humans. OsteoporosInt. 2018;29(1):211-221. doi: https://doi.org/10.1007/s00198-017-4241-7

20. Луценко А.С., Белая Ж.Е., Пржиялковская Е.Г., и др. Экспрессия циркулирующих микроРНК в плазме у пациентов с акромегалией // Проблемы эндокринологии. — 2019. — Т. 65. — №5. — С. 311-318. [Lutsenko AS, Belaya ZE, Przhiyalkovskaya EG, et al. Expression of plasma microRNA in patients with acromegaly. Problems of Endocrinology. 2019;65(5):311-318. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.14341/probl10263

21. Луценко А.С., Белая Ж.Е., Пржиялковская Е.Г., Мельниченко Г.А. МикроРНК и их значение в патогенезе СТГ-продуцирующих аденом гипофиза // Вестник Российской академии медицинских наук. — 2017. — Т. 72. — №4. — С. 290-298. [Lutsenko AS, Belaya ZE, Przhiyalkovskaya EG, et al. MicroRNA: role in gh-secreting pituitary adenoma pathogenesis. Ann Russ Acad Med Sci. 2017;72(4):290-298. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.15690/vramn856

22. Аушев В.Н. МикроРНК: малые молекулы с большим значением // Клиническая онкогематология. — 2015. — Т. 8. — №1 — С. 1-12. [Aushev VN. MikroRNK: malye molekuly s bol'shim znacheniem. Klinicheskaya onkogematologiya. 2015;8(1):1-12. (In Russ.)].

23. Hanahan D, Weinberg R. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 2011;144(5):646-674. doi: https://doi.org/ 10.1016/j.cell.2011.02.013

24. Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Nonlinear partial differential equations and applications: Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci. 2002;99(24):15524-15529. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.242606799

25. Pashaei E, Pashaei E, Ahmady M, et al. Meta-analysis of miRNA expression profiles for prostate cancer recurrence following radical prostatectomy. PLoS One. 2017;12(6):e0179543.

doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0179543

26. Adhami M, Haghdoost AA, Sadeghi B, et al. Candidate miRNAs in human breast cancer biomarkers: a systematic review. Breast Cancer. 2018;25:198-205. doi: https://doi.org/10.1007/s12282-017-0814-803

27. Pardini B, De Maria D, Francavilla A, et al. MicroRNAs as markers of progression in cervical cancer: a systematic review. BMC Cancer. 2018;18(1):696. doi: https://doi.org/10.1186/s12885-018-4590-4

28. Shao C, Yang F, Qin Z, et al. The value of miR-155 as a biomarker for the diagnosis and prognosis of lung cancer: a systematic review with meta-analysis. BMC Cancer. 2019;19(1):1103.

doi: https://doi.org/10.1186/s12885-019-6297-6

29. Belaya Z, Khandaeva P, Nonn L, et al. Circulating Plasma microRNA to Differentiate Cushing's Disease From Ectopic ACTH Syndrome. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11:331. doi: https://doi.org/10.3389/fendo.2020.00331

30. Белая Ж.Е., Малыгина А.А., Гребенникова Т.А., и др. Диагностические возможности исследования кортизола слюны в ходе малой пробы с дексаметазоном // Ожирение и метаболизм. — 2020. — Т. 17. — № 1. — С. 13-21. [Belaya ZE, Malygina AA, Grebennikova TA, et al. Diagnostic value of salivary cortisol in 1-mg dexamethasone suppression test. Obe Metab. 2020;17(1):13-21. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.14341/omet10117

31. Chang L, Zhou G, Soufan O, Xia J. miRNet 2.0: network-based visual analytics for miRNA functional analysis and systems biology. Nucleic Acids Res. 2020;48(W1):W244-W251. doi: https://doi.org/10.1093/nar/gkaa467

32. Bottoni A, Zatelli MC, Ferracin M, et al. Identification of differentially expressed microRNAs by microarray: a possible role for microRNA genes in pituitary adenomas. J Cell Physiol. 2007;210(2):370-377. doi: https://doi.org/10.1002/jcp.208321

33. Bottoni A, Piccin D, Tagliati F, et al. miR-15a and miR-16-1 down-regulation in pituitary adenomas. J Cell Physiol. 2005;204(1):280-285. doi: https://doi.org/10.1002/jcp.20282

34.

35.

36.

37.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

Yang Z, Zhang T, Wang Q, Gao H. Overexpression of microRNA-34a

Attenuates Proliferation and Induces Apoptosis in Pituitary Adenoma

Cells via SOX7. Molecular Therapy - Oncolytics. 2018;10:40-47.

doi: https://doi.org/10.10167j.omto.2018.07.001

Amaral F, Torres N, Saggioro F, et al. MicroRNAs Differentially

Expressed in ACTH-Secreting Pituitary Tumors. The Journal

of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2009;94(1):320-323.

doi: https://doi.org/10.1210/jc.2008-1451

Stilling G, Sun Z, Zhang S et al. MicroRNA expression in ACTH-

producing pituitary tumors: up-regulation of microRNA-122

and -493 in pituitary carcinomas. Endocrine. 2010;38(1):67-75.

doi: https://doi.org/10.1007/s12020-010-9346-0

Vetrivel S, Zhang R, Engel M, et al. Circulating microRNA Expression

in Cushing's Syndrome. Front Endocrinol (Lausanne). 2021;12.

doi: https://doi.org/10.3389/fendo.2021.620012

Lu B, Liu G, Yu F, et al. MicroRNA-16/VEGFR2/p38/NF-KB signaling

pathway regulates cell growth of human pituitary neoplasms. Oncol

Rep. 2018. doi: https://doi.org/10.3892/or.2018.6227

Renjie W, Haiqian L. MiR-132, miR-15a and miR-16 synergistically

inhibit pituitary tumor cell proliferation, invasion and

migration by targeting Sox5. Cancer Lett. 2015;356(2):568-578.

doi: https://doi.org/10.1016/j.canlet.2014.10.003

Garbicz F, Mehlich D, Rak B et al. Increased expression of

the microRNA 106b~25 cluster and its host gene MCM7

in corticotroph pituitary adenomas is associated with tumor

invasion and Crooke's cell morphology. Pituitary. 2017;20(4):450-463.

doi: https://doi.org/10.1007/s11102-017-0805-y

Hernández-Ramírez L, Stratakis C. Genetics of Cushing's

Syndrome. Endocrinol Metab Clin North Am. 2018;47(2):275-297.

doi: https://doi.org/10.1016/jecl.2018.02.007

Albani A, Theodoropoulou M, Reincke M. Genetics of

Cushing's disease. Clin Endocrinol (Oxf). 2018;88(1):3-12.

doi: https://doi.org/10.1111/cen.13457

Янар Э.А., Маказан Н.В., Орлова Е.М., Карева М.А. Молекулярно-генетические основы болезни Иценко-Кушинга у детей и перспективы таргетной терапии // Проблемы Эндокринологии. — 2020. — Т. 66. — №6. — С. 39-49. [Yanar EA, Makazan N V., Orlova EM, Kareva MA. Genetic basis of Cushing's disease in children and targeted therapeutic future perspectives. Problems of Endocrinology. 2020;66(6):39-49. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.14341/probl12676 Neou M, Villa C, Armignacco R, et al. Pangenomic Classification of Pituitary Neuroendocrine Tumors. Cancer Cell. 2020;37(1):123-134. doi: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.11.002

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

Gao C, Lu W, Lou W, et al. Long noncoding RNA HOXC13-AS

positively affects cell proliferation and invasion in nasopharyngeal

carcinoma via modulating miR-383-3p/HMGA2 axis. J Cell Physiol.

2018;234(8):12809-12820. doi: https://doi.org/10.1002/jcp.27915

Zhao L, Gu H, Chang J et al. MicroRNA-383

Regulates the Apoptosis of Tumor Cells through

Targeting Gadd45g. PLoS One. 2014;9(11):e110472.

doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110472

Qian Y, Song W, Wu X et al. DLX6 Antisense RNA 1 Modulates

Glucose Metabolism and Cell Growth in Gastric Cancer by

Targeting microRNA-4290. Dig DisSci. 2020;66(2):460-473.

doi: https://doi.org/10.1007/s10620-020-06223-4

Nishibeppu K, Komatsu S, Imamura T, et al. Plasma microRNA

profiles: identification of miR-1229-3p as a novel chemoresistant

and prognostic biomarker in gastric cancer. Sci Rep. 2020;10(1):3161.

doi: https://doi.org/10.1038/s41598-020-59939-8

Zou W, Cao Y, Cheng K, et al. Downregulation of circ_0037655

impedes glioma formation and metastasis via the regulation of

miR-1229-3p/ITGB8 axis. Open Life Sciences. 2021;16(1):442-454.

doi: https://doi.org/10.1515/biol-2021-0048

Wang Y, Yin Y, Zhou H, Cao Y. miR639 is associated with

advanced cancer stages and promotes proliferation

and migration of nasopharyngeal carcinoma. Oncol Lett. 2018.

doi: https://doi.org/10.3892/ol.2018.9512

Lei S, Shen F, Chen J, et al. MiR-639 promoted cell proliferation

and cell cycle in human thyroid cancer by suppressing CDKN1A

expression. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2016;84:1834-1840.

doi: https://doi.org/10.1016Zj.biopha.2016.10.087

Xiao J, Liu Y, Wu F, et al. miR-639 Expression Is Silenced by DNMT3A-

Mediated Hypermethylation and Functions as a Tumor Suppressor

in Liver Cancer Cells. Molecular Therapy. 2020;28(2):587-598.

doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2019.11.021

Hamada-Tsutsumi S, Naito Y, Sato S, et al. The antiviral effects

of human microRNA miR-302c-3p against hepatitis B virus

infection. Aliment Pharmacol Ther. 2019;49(8):1060-1070.

doi: https://doi.org/10.1111/apt.15197

Oksuz Z, Serin M, Kaplan E, et al. Serum microRNAs; miR-30c-

5p, miR-223-3p, miR-302c-3p and miR-17-5p could be used as

novel non-invasive biomarkers for HCV-positive cirrhosis and

hepatocellular carcinoma. Mol Biol Rep. 2014;42(3):713-720.

doi: https://doi.org/10.1007/s11033-014-3819-9

Moreno C. SOX4: The unappreciated oncogene. Semin Cancer Biol.

2020;67:57-64. doi: https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2019.08.027

Рукопись получена: 14.09.2021. Одобрена к публикации: 12.11.2021. Опубликована online: 21.12.2021. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ [AUTHORS INFO]

* Малыгина Анастасия Андреевна [Anastasia A. Malygina, MD]; адрес: Россия, 117036,

Москва, ул. Дм. Ульянова, д. 11 [address: 11 Dm. Ulyanova street, 117036 Moscow, Russia];

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4567-2412; eLibrary SPIN: 8990-8260; e-mail: malygina.aa@gmail.com

Белая Жанна Евгеньевна, д.м.н. [Zhanna E. Belaya, MD, PhD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6674-6441; eLibrary SPIN: 4746-7173; e-mail: jannabelaya@gmail.com

Никитин Алексей Георгиевич, к.б.н. [Alexey G. Nikitin, PhD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9762-3383; eLibrary SPIN: 3367-0680;e-mail: avialn@gmail.com

Кошкин Филипп Александрович, к.б.н. [Philipp A. Koshkin, PhD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9512-9277; eLibrary SPIN: 5627-2121;e-mail: philipkoshkin@gmail.com

Ситкин Иван Иванович, к.м.н. [Ivan I. Sitkin, MD, PhD]; e-mail: sitkin_ivan@rambler.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2175-3170; eLibrary SPIN: 9779-3780 Лапшина Анастасия Михайловна, к.м.н. [Anastasia M. Lapshina, MD, PhD];

ORCID: http://orcid.org/0000-0003-4353-6705; eLibrary SPIN:1582-5033; e-mail: nottoforget@yandex.ru Хандаева Патимат Магомедовна [Patimat M. Khandaeva, MD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6993-5096; eLibrary SPIN: 6950-5200; e-mail: pati_khandaeva@mail.ru

Луценко Александр Сергеевич [Alexander S. Lutsenko, MD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9314-7831; eLibrary SPIN: 4037-1030; e-mail: some91@mail.ru

Трухина Диана Аршалуйсовна, клинический ординатор [Diana A. Trukhina, MD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1359-8297; elibrary SPIN: 5618-8971; email: diadavtyan@gmail.com Мельниченко Галина Афанасьевна, д.м.н., профессор, академик РАН [Galina A. Melnichenko, MD, PhD, professor]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5634-7877; eLibrary SPIN: 8615-0038; email: teofrast2000@mail.ru

ЦИТИРОВАТЬ

Малыгина А.А., Белая Ж.Е., Никитин А.Г., Кошкин Ф.А., Ситкин И.И., Лапшина А.М., Хандаева П.М., Луценко А.С., Трухина Д.А., Мельниченко Г.А. Экспрессии микроРНК в плазме крови, оттекающей от гипофиза, у пациентов с болезнью Иценко-Кушинга и АКТГ-эктопированным синдромом // Проблемы эндокринологии. — 2021. — Т. 67. — №6. — С. 18-30. doi: https://doi.org/10.14341/probl12817

TO CITE THIS ARTICLE

Malygina AA, Belaya ZE., Nikitin AG, Koshkin FA, Sitkin II, Lapshina AM, Khandaeva PM, Lutsenko AS, Trukhina DA, Melnichenko GA. Differences in plasma miRNA levels in inferior petrosal sinus samples of patients with ACTH-dependent Cushing's syndrome. Problems of Endocrinology. 2021;67(7):18-30. doi: https://doi.org/10.14341/probl12817