CC BY
18
EFFECT OF METHYL TERTIARY-BUTYL ETHER OH THE EXPRESSION OF SHARK, CSNK1E, PERI, BMAL1 AND CLOCK mRHA IN RAT LUNG AND LIVER
Minchenko D.O., Yavorovsky O.P., Paustovsky Y.O., Minchenko O.H.
ЕКСПРЕС1Я мРНК SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 ТА CLOCK
У ЛЕГЕНЯХ ТА ПЕЧ1НЦ1 ЩУР1В ЗА ДМ МЕТИЛ-ТРЕТБУТИЛОВОГО ЕФ1РУ
iльшiсть основних фiзiологiч- довi особливостi та шдивщу-
них та метаболiчних процесiв в альнк Циркадiальнi фактори е
opraHi3Mi мае здатнiсть до ав- ключовими регуляторами pi3-
тономних коливань з перюдом, номaнiтних метaболiчних про-
близьким до 24 годин, яю нази- цеав як в нормi, так i за рiзних
вають циркaдiaльними ритма- пaтологiчних стaнiв. Рiвень ек-
ми i якi генеруються у ппотала- спресií генiв, що кодують син-
мусi системою бiологiчного го- тез циркaдiaльних регулятор-
динника, молекулярну основу них фaкторiв, щоденно зазнае
якого складають регуляторнi та автономних коливань i визна-
трaнскрипцiйнi фактори, що чае циркaдiaльний характер
М1НЧЕНКО Д.О., кодуються циркaдiaльними ге- переб^у рiзномaнiтних фiзiо-
ЯВОРОВСЬКИЙ О.П., нами груп Перюд (Period) та лопчних та метaболiчних про-
ПАУСТОВСЬКИЙ Ю.О., Криптохромiв (Cryptochromes), цесiв в оргашзмк Дисрегуляцiя
М1НЧЕНКО О.Г. raзеíнкiнaз, BMAL (brain and циркaдiaльних ритмiв, зокрема
Нацюнальний медичний muscle ARNT-like protein) та сну, який е штегральною части-
унiверситет CLOCK (circadian locomotor ною нашого життя i контролю-
iм. О.О. Богомольця, м. Кив; output cycles kaput) [1-3]. Цир- еться бюлопчним годинником,
|нститут бюмш кaдiaльнi ритми з перiодом, може сильно впливати на здо-
м О.В. Пaллaдiнa близьким до 24 годин, регулю- ров'я, змiнювaти метaболiзм i
Нaцiонaльноí aкaдемií наук ють фундaментaльнi фiзiоло- призводити до ожиршня та ме-
Нл Укрaíни, м. Киíв гiчнi функцií в оргaнiзмi i тiсно тaболiчних захворювань [4].
^ пов'язaнi з метaболiчним гоме- Основу бiологiчного годин-
УДК 577.112.7:616 остазом. Вони можуть мати ви- ника ссавщв складае група
ЭКСПРЕССИЯ мРНК SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 И CLOCK В ЛЕГКИХ И ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕТИЛТРЕТБУТИЛОВОГО ЭФИРА Минченко Д.А., Яворовский А.П., Паустовский Ю.А., Минченко А.Г. Цель исследования — изучение экспрессии наиболее важных генов циркадиальных регуляторных факторов, являющихся молекулярными компонентами системы циркадиальных часов (CSNK1E, PER1, BMAL1 и CLOCK), а также протеинкиназы SNARk при действии на организм метил-третбутилового эфира, токсического и экологически опасного соединения. Это обусловлено тем, что биологические часы играют чрезвычайно важную роль в регуляции большинства физиологических и метаболических процессов в организме, и нарушение протекания их функции есть одной из причин возникновения ряда патологических процессов. Методы исследования. Уровень экспрессии генов CSNK1E, PER1, BMAL1, CLOCK и SNARK определяли в легких и печени крыс с помощью опосредованной обратной транскрипцией количественной полимеразной реакции в реальном времени в условиях продолжительного (в течение месяца) действия предельно допустимой концентрации метил-третбутилового эфира в воздухе, используя специальную камеру. Результаты. Установлено, что уровень экспрессии циркадиальных генов PER1, BMAL1 и CLOCK
значительно усиливается в легких и в печени крыс под влиянием продолжительного (в течение месяца) действия предельно допустимой концентрации метил-третбутилового эфира в воздухе, причем в легких обнаружены более выраженные изменения в уровнях экспрессии генов PER1 и CLOCK. Показано также, что уровень экспрессии протеинкиназы CSNK1E, что контролирует функциональную активность циркадиальных факторов при действии метил-третбутилового эфира, значительно увеличивается как в легких, так и в печени. В этих же условиях метил-третбутиловый эфир почти вдвое усиливает экспрессию гена SNARK, что кодирует синтез чувствительной к действию различных стрессовых факторов протеинкиназы. Выводы. Результаты данной работы свидетельствуют о выраженном влиянии низких концентраций метил-третбутилового эфира на важные механизмы регуляции метаболических процессов в клетках жизненно важных органов на уровне экспрессии циркадиальных генов CSNK1E, PER1, BMAL1 и CLOCK, а также протеинкиназы SNARK, что может приводить к нарушению сигнальных каскадов в клетках и развитию разнообразных патологических состояний. Уровень экспрессии этих генов может быть чувствительным показателем вредного действия на организм метил-третбутилового эфира и, возможно, других химических веществ, загрязняющих окружающую среду.
© Мiнченко Д.О., Яворовський О.П., Паустовський Ю.О., Мнченко О.Г. Стаття, 2012.
3 Environment & Health № 3 2012
EFFECT OF METHYL TERTIARY-BUTYL ETHER ON THE EXPRESSION OF SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 AND CLOCK mRNA IN RAT LUNG AND LIVER Minchenko D.O., Yavorovsky О.P., Paustovsky Y^., Minchenko O.H. Aims. The effect of methyl tertiary-butyl ether, a toxic and an ecologically dangerous chemical compounds, on the expression of most of the important molecular factors, components of circadian clock system (CSNK1E, PER1, BMAL1 and CLOCK), as well as, protein kinase SNARK. Biological clock plays an important role in the regulation of most physiological and metabolic processes in the organism. The disturbance оf circadian processes behaviour in the organism leads to the development of different pathology. Methods. The expression level of CSNK1E, PER1, BMAL1, CLOCK and SNARK genes was determined in rat lungs and liver by reverse transcription mediated real-time quantitative polymerase chain reaction. Rats were treated in special chamber during one month with aximum permissible concentration of methyl tertiary-butyl ether in air.
Results. It was shown that the expression level of PER1, BMAL1 and CLOCK genes increases both in the lungs and liver in rats treated with maximum
permissible concentration of methyl tertiary-butyl ether in air. Moreover, the changes in the expression level of PER1 and CLOCK genes were more significant in the lungs. We have also shown that methyl tertiary-butyl ether increases the expression level of protein kinase CSNK1E, which controls the functional activity of circadian factors, both in rat lungs and liver. At these experimental conditions methyl tertiary-butyl ether in two fold induces the expression SNARK gene, which encodes the synthesis of sensitive to the action of different stress factors protein kinase. Conclusions. Results of this investigation demonstrate that low concentrations of methyl tertiary-butyl ether affects important regulatory mechanisms of metabolic processes in the cells of vital organs at the expression level of circadian genes CSNK1E, PER1, BMAL1 and CLOCK as well as protein kinase SNARK. Disruption of the normal of expression of these genes can destroy the cellular signal pathways and lead to the development of pathological processes. It could be an important sensitive marker of toxic action on the organism of methyl tertiary-butyl ether and possibly other ecologically dangerous chemical compounds. Keywords: methyl tertiary-butyl ether, gene expression, CSNK1E, PER1, BMAL1, CLOCK, SNARK, lung, liver, rats.
протеши, яка включае не мен-ше восьми фактор1в: CLOCK, BMAL1, PER1 (period 1), PER2, PER3, CRY1 (cryptochrome 1), CRY2 та REV-ERBальфа. BMAL1 та CLOCK е транскрипцмними факторами, що утворюють транскрипцмно активний комплекс шляхом гетеродимери-зацп, здатний зв'язуватися з cis-дючим елементом у про-моторi рiзних гешв-мшеней,
Рисунок 1 Вплив тривалоГ (протягом мюяця) дм МТБЕ на piBHi ГДК
у noBiTpi робочо'Гзони на piBeHb експресГГ мРНК SNF1 проте'Гнкшази, що активу-
еться АМР, (SNARK) у легенях та печшщ щурiв методом полiмеразноТ
ланцюговоГ реакцГГ комплементарних ДНК (кДНК), отриманих шляхом зворотно'ГтранскрипцГГ мРНК. 1 — контрольн тварини, 2 — дiя МТБЕ. Рiвень експресГГ мРНК бета-актину дослщжували
для контролю кшькост РНК, взятоГдля дослщження.
включаючи PER1, PER2, PER3, CRY1 та CRY2, i посилювати транскрипцю самого BMAL1, генеруючи позитивну петлю системи бюлопчного годинни-ка. З шшого боку, комплекс CRY-PER формуе негативну петлю взаемозв'язюв годинни-ка шляхом пригнiчення тран-скрипцмноТ активностi гетеро-димерного комплексу CLOCK / BMALi. 1ншу негативну петлю
взаемозв язкiв циркадiального годинника формуе REV-ER-Вальфа, який пригнiчуе тран-скрипцiйну активнiсть комплексу CLOCK/BMAL в ядрi [2].
Низкою дослщжень було встановлено, що порушення у регуляци експресiï циркадiаль-них гешв мають мiсце за дея-ких захворювань i можуть бути причетними також до вини-кнення та прогресп злоякiсних
Рисунок 2
Кшьюсне визначення рiвня експресГГ мРНК SNF1 проте'Гнкшази, що активуеться АМР, (SNARK) у легенях та печшщ щурiв методом полiмеразноТ ланцюговоГ реакцГГ у реальному час за тривало'Г (протягом мюяця) дм МТБЕ на рiвнi ГДК у повiтрi робочо'Г зони. Рiвень експресГГ мРНК SNARK нормалiзували за бета-актином i виражали у процентах вщ контролю, прийнятого за 100%.
пухлин [5-7]. OcTaHHiM часом виявлено зaлежнicть eKcnpeciï низки циркaдiaльниx reHiB вiд rinoKciï, що також значною Mi-рою може сприяти прогреем бшьшост злоякicних пухлин у рaзi порушень у функцп цих ге-нiв. Екcпрeciя бтьшост цирга-дiaльних гeнiв Ta функ^я фaк-торiв, що кодуеться ними, пeрeбувae пiд контролем про-те^^з, зокрeмa кaзeïнкiнa-зи-1епсилон тa -1дeльтa, якi тaкож беруть учacть у регуляцп низки iнших нaдзвичaйно вaж-ливих процeciв [8, 9]. Ta^ було вcтaновлeно, що кaзeïнкiнaзa-1епсилон зв'язуеться з PER1, PER2, PER3 i фосфорилюе ïx, що ютотно змiнюe функцюну-вaння гeнiв, яю контролюють цикл подiлу клiтин (Cyclin D1, Cyclin A, MDM2, cMYC i GADD45alpha) тa низки онко-гeнiв, a тaкож гeнiв, що пригш-чують рicт пухлин [8, 10]. Ця протeïнкiнaзa бере учacть у дecтaбiлiзaцiï в -кaтeнiн-дeгрa-дуючого комплексу, у функцю-нувaннi TGF-p cигнaльного га-cкaду, в iнaктивaцiï бшга BID через його розщеплення га-cпaзою 8, фосфорилюе Р53, проте'ш, що пригнiчуe рicт пухлин, негативно регулюе фосфо-АКТ через PTEN [9]. ^м того, для циркaдiaльниx фaкторiв у ccaвцiв xaрaктeрнe явище зворотного зв'язку у мexaнiзмax рeгуляцiï, що нaд-звичaйно вaжливо для точно! i ч^коТ роботи циркaдiaльного годиннига [11, 12].
Рисунок 3 Вплив тривалоГ (протягом мiсяця) дГГ МТБЕ на piBHi ГДК у noBiTpi робочо'Г зони на piBeHb експресГГ мРНК казе'Гнкшази-1епсшьон (CSNK1E) у легенях та печшщ щурiв методом полiмеразноï ланцюговоГ реакцГГ кДНК, отриманих шляхом зворотно'Г транскрипцГГ мРНК. 1 — контрольнтварини,
2 — д^я МТБЕ. Рiвень експресГГ мРНК бета-актину дослщжували
для контролю кiлькостi РНК, взято'Г для дослщження.
ФУНДАМЕНТАЛЬН1 ДОСЛ1ДЖЕННЯ =
Протeïнкiнaзa SNARK (SNF1 протeïнкiнaзa, що aктивуeтьcя АМР) е прeдcтaвником AMPK к^з, що нaлeжить до се-рин/треоншових протeïнкiнaз [13]. Вiдомо, що aктивнicть протeïнкiнaзи SNARK змЫюеть-ся зa рiзномaнiтниx стресових cтaнiв клiтин, aлe не у вcix типax кштин, суттево зaлeжить вiд рiвня глюкози i глютaмiну у кли тинax, бере учacть в iндуковaнiй CD95 рухливост тa iнвaзивно-cтi. Нeдaвно було виявлено, що нокaутнi зa геном протeïнкiнaзи SNARK мишi xaрaктeризуютьcя ожирiнням, вщповщними пору-шеннями мeтaболiзму i мaють cxильнicть до виникнення злоя-кicниx пухлин подiбно до твa-рин, нокaутниx зa циркaдiaль-ними гeнaми [14, 15].
Метил-третбутиловий eфiр — 2-мeтокcи-2-мeтил-пропaн (МТБЕ) е еколопчно небезпеч-ною xiмiчною сполукою, що ви-користовуеться для виробниц-твa нeeтильовaниx бензишв. Доcлiджeннями оcтaннix рокiв
встановлено, що МТБЕ е одним з найнебезпечшших глобаль-них хiмiчних забруднювачiв довктля у зв'язку з його висо-кою стабiльнiстю, здатнiстю накопичуватися у фунт i тд-земних джерелах водопоста-чання та вираженим негатив-ним впливом на здоров'я людей [16, 17]. Забруднення щею сполукою довктля може стати причиною отруення людей, може шщювати розвиток рiзних патолопчних станiв: хроычних нефропатiй, гiпертрофií печн ки, алерпчних та рестратор-них захворювань, нейроток-сичних проявiв, у тому чист i виникнення злоякiсних новоу-творень у нирках, печiнцi, сiм'яниках та лiмфовузлах, може iнiцiювати розвиток лей-кемiй [17-19]. Бiльше того, враховуючи iнтенсивнiсть ви-користання бензинiв з МТБЕ та високу стабiльнiсть хiмiчноí сполуки, можна вважати и до-сить небезпечним глобальним забруднювачем довкiлля [18].
Рисунок 4
Кшьюсне визначення рiвня експресГГ мРНК казеïнкiнази-1епсiльон (CSNK1E) у легенях та печшщ щурiв методом полiмеразноï ланцюговоГ реакцГГ у реальному часi за тривалоГ (протягом мiсяця) дГГ МТБЕ на рiвнi ГДК у повiтрi робочо'Г зони. Рiвень експресГГ мРНК CSNK1E нормалiзували за бета-актином i виражали у процентах вщ контролю, прийнятого за 100%.
200 180 160 140 120 100 S0 60 40 20 0
*
r-h г
1 -Г
Контроль МТБЕ Леген! Контроль МТБЕ Печ1нка
В експериментах на щурах та мишах встановлено, що пов-торнi iнгаляцií МТБЕ призво-дять до порушення функцií ни-рок, появи рiзних злоякiсних пухлин та збiльшення смертно-стi [16, 17]. У дослщах на двох видах риб бупо показано, що короткотривапа експози^я риб у водi з МТБЕ або третбутано-пом призводить до деформаци очей i ротовоí порожнини та до пщвищено'Т смертностi личинок. Основними метаболтами МТБЕ у кровi е метанол та трет-бутиловий алкоголь, щд^ як у печiнцi вiн перетворюеться за участi цитохрому Р-450 до фор-мапьдегiду та третбутанолу, але основним мюцем накопи-чення МТБЕ е жирова тканина i дещо меншою мiрою кров та мозок [21, 22]. Разом з тим, де-тальн механiзми токсичноí дм МТБЕ, що iнiцiюють розвиток рiзних захворювань, зокрема зпоякiсних пухлин, залишають-ся нез'ясованими.
Ранiше нами було встановлено, що внутршньошлункове введення рiзних доз МТБе щурам протягом 1-2 мюящв при-зводить до значних порушень в експресп циркадiапьних генiв, протеíнкiназ та PFKFB, а також альтернативного сплайсингу PFKFB4 та VEGF, що переконли-во свiдчипо про високу чутли-вiсть протеíнкiнази SNARK та циркадiапьних генiв, як i альтер-нативний сплайсинг PFKFB4 до дм цiеí токсичноí хiмiчноí сполу-
ки [23-26]. Актуальним постало питання про можливють впливу на оргаызм гранично допустимо! концентраци (ГДК) МТБЕ у пов^ робочоТ зони.
У зв'язку з цим, метою дано-го дослiдження було вивчення можливих молекулярних меха-нiзмiв впливу еколопчно не-безпечноТ хiмiчноí сполуки МТБЕ на рiвнi ГДК у пов^ робочоТ зони на оргашзм. Для цього дослiджували тривалу (протягом мюяця) дiю цieí xi-мiчноí сполуки на експресiю протеТнюнази SNARK та цирка-дiальниx гешв у легенях i печн ц щурiв.
Матерiали i методи до-слiджень. Дослiди проводили на щурах лiнií Wistar вагою 230260 г Тварин поддавали дií МТБЕ у концентраци 100 мг/м3 (на рiв-нi нинi чинноí в УкраМ ГДК цieí речовини у пов^ робочоí зони) у спе^альый камерi по 4 го-дини на день, п'ять дыв на тиж-день протягом чотирьох тижшв.
Видiлення РНК. Тотальнi РНК видшяли iз печiнки та ле-гень щурiв за допомогою реагенту Тризол (Trizol; Invitrogen, USA) згщно з протоколом ви-робника, як описано рашше [27]. Осаджували РНК iз водно)' фази рiвним об'емом 2-пропа-нолу. Осади РНК промивали двiчi 75% етанолом, розчиняли у вод^ що не мютить домiшок рибонуклеаз, i використовува-ли для синтезу комплементар-них ДНК (кДНК).
Аналiз експресГГ мРНК SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 та CLOCK. Експресю мРНК SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 та CLOCK достджували методом полiмеразноí ланцюговоТ' реакцп комппементарних ДНК, отриманих методом зворотно'Т транскрипци мРНК, а також методом кшькюнот попiмеразноí ланцюговоТ реакцп у реальному часк Синтез кДНК проводили за допомогою QuaniTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, Ымеч-чина) зпдно з протоколом ви-робника, використовуючи то-тальну РНК iз легень та печЫки щурiв як матрицю. Для ампшфн кацТТ кДНК SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 та CLOCK викори-стовували HotStarTaq Master Mix Kit (QlAGEN, Нiмеччина) та спе-цифiчнi для цих генiв щурiв пари праймерiв, отриманих вiд компа-нií Sigma, США. Кiпькiсну по^ме-разну ланцюгову реакцiю проводили на апарат "Stratagene Mx 3000P cycler". Для ампшфкаци кДНК протеТнюнази SNARk та циркадiапьних генiв, а також бета-актину (як контрольного гена) використовували ABsolute qPCR SYBR Green Mix (Thermo Scientific, Великобритаыя).
Амппiфiкацiю кДНК протеТ'нюнази SNARK (SNF1 проте'Тнюна-зи, що активуеться АМР) проводили з використанням таких праймерiв: прямого — 5'— AAGTCTCGGCAGCGTGAATC -3' та зворотного 5'— CAG-GATGCTGTCCTCACTCA -3', ну-
Рисунок5 Вплив тривалоГ (протягом мiсяця) дм МТБЕ на рiвнi ГДК у повiтрi робочо'Г зони на рiвень експресГГ мРНК циркадiального гена BMAL1 у легенях та печiнцi щурiв методом полiмеразноT' ланцюговоТ реакцГГ кДНК, отриманих шляхом зворотно'Г транскрипци мРНК. 1 — контрольнтварини,
2 — дiя МТБЕ. Рiвень експресГГ мРНК бета-актину дослщжували
для контролю кiлькостi РНК, взято'Г для дослiдження.
Рисунок 6
Кшькюне визначення рiвня експресГГ мРНК циркадiального гена BMAL1 у легенях та печшщ щурiв методом полiмеразно'Г ланцюговоГ реакцГГ у реальному час за тривалоГ (протягом мiсяця) дм МТБЕ на рiвнi ГДК у повiтрi робочоГ зони. Рiвень експресГГ мРНК BMAL1 нормалiзували за бета-актином i виражали у процентах вщ контролю, прийнятого за 100%.
О
клеотиднi послiдовностi яких вiдповiдають залишкам ну-клеотидiв 1544-1564 та 17371718 вiдповiдно у мРНК SNARK щура (GenBank номер NM_001007617).
Для амплiфiкацií кДНК казе-íнкiнази-1епсилон (CSNK1E) були використанi прямий (5'— GACATCTACCTGGGTGCCAAC -3') та зворотний (5'— TGAT-CATCTGGTCGGCCAGC -3') праймери. Нуклеотидш залиш-ки цих праймерiв вщповщають залишкам нуклеотидiв 64-84 та 340-321 у поспщовност мРНК CSNK1E щура (GenBank номер NM_031617).
Амплiфiкацiю кДНК циркади ального фактора PER1 проводили з використанням таких праймерiв: прямого — 5'-TCTCTTCTCAGAACTGGATG -3' та зворотного 5'— GGA-AGCCTCTCATTAGACTGC -3', нуклеотиднi посшдовност яких вiдповiдають залишкам ну-клеотидiв 3699-3718 та 39833963 вiдповiдно у мРНК Рег1 щура (GenBank номер NM_001034125).
Для амплiфiкацií кДНК BMAL1 були використанi прямий (5'— TGACCCTCATGGAAGGTTAG -3') та зворотний (5'— ААТС-CATCTGCTGCCCTGAG -3') праймери. Нуклеотидш залиш-ки цих праймерiв вщповщають залишкам нуклеотидiв 753-772 та 1042-1061 у поспщовност мРНК BMAL1 щура (GenBank номер NM_024362).
Для амплiфiкацiТ кДНК CLOCK були використанi прямий (5'— TGCACAGTCA-GATGCTAGTG -3') та зворотний (5'— TGATCCACAAGATCA-GATGG -3') праймери. Нуклео-тиднi залишки цих праймерiв вiдповiдають залишкам ну-клеотидiв 264-283 та 455-436 у поспщовност мРНК CLOCK щура (GenBank номер NM_021856).
Для контролю кiлькостi РНК, взятоТ для аналiзу, доспщжува-ли експреаею мРнК ACTb (бета-актину). Амплiфiкацiю кДНК бета-актину проводили з вико-ристанням таких праймерiв: прямий — 5'— GGACTTCGAG-CAAGAGATGG -3' та зворотний — 5'— AGCACTGTGTTGGCGTA-CAG -3'. Прямий праймер по-чинаеться з 704-го нуклео-тидного залишку (5'-позицiя), а зворотний — з 937-го нуклео-тидного залишку (3'-позищя; GenBank номер Х00351).
Ц саме пари праймерiв були використанi також i для ампли фiкацiТ у полiмеразнiй ланцю-говiй реакцiТ у реальному часк Експресiя кожноТ смуги кДНК SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 та CLOCK порiвнювалася з ек-спресiею мРНК бета-актину.
ЗмЫи рiвня експресiТ мРНК циркадiальних факторiв SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 та CLOCK у легенях та печшщ за дм МТБЕ порiвнювали з вщпо-вiдними значеннями у кон-трольних тварин, яю було
прийнято за 100%. Аналiз ре-зультатiв виконували за допо-могою спецiальноï комп'ютер-ноТ програми "Differential expression calculator", а стати-стичний аналiз — у програмi Microsoft Excel.
Продукти амплiфiкацiï анали зували електрофорезом у 2% агарозному гел^ забарвлюючи кДНК за допомогою 5x Sight DNA Stain (EUROMEDEA). ^i аналiзували у системi Quantity One BioRad System (США).
Результати дослiдження та ïx обговорення. У зв'язку з тим, що порушення системи регуляцiï циркадiальних проце-сiв в органiзмi е однieю з причин виникнення низки патоло-гiчних процеав (у тому числi i злояюсних новоутворень), ми дослiджували експресiю мРНК ключових циркадiальних генiв та протешюнази SNARK у легенях та печшщ щурiв у нормi та за тривалоТ дiï на тварин низь-коТ концентрацiï МТБЕ методами полiмеразноï ланцюгово!' реакцiï кДНК, отриманих шляхом зворотно!' транскрипцп мРНК. Результати дослiдження експресiï мРНК протешкшази SNARk представленi на рис. 1 та 2. Встановлено, що рiвень експресп мРНК протеïнкiнази SNARk майже вдвiчi збтьшу-еться у легенях та печЫц щурiв пщ впливом МТБЕ на рiвнi ГДК у пов^ робочоï зони. Ц данi узгоджуються з отриманими нами ранiше даними про пщви-
Рисунок7 Вплив тривалоТ (протягом мюяця) дГТ МТБЕ на piBHi ГДК у noBiTpi робочоТ зони на piBeHb експресГТ мРНК циркадiальнoгo гена CLOCK у легенях та печiнцi щурiв методом пoлiмеразнoТ ланцюговоТ реакцГТ кДНК, отриманих шляхом зворотноТ транскрипцГТ мРНК. 1 — контрольнтварини,
2 — дiя МТБЕ. Рiвень експресГТ мРНК бета-актину дослщжували
для контролю кiлькoстi РНК, взятоТ для дослщження.
Рисунок 8
Кiлькiсне визначення рiвня експресГТ мРНК циркадiальнoгo гена CLOCK у легенях та печшщ щурiв методом пoлiмеразнoТ ланцюговоТ реакцГТ у реальному часi за тривалоТ (протягом мюяця) дГТ МТБЕ на рiвнi ГДК у пoвiтрi робочоТ зони. Рiвень експресГТ мРНК CLOCK нoрмалiзували за бета-актином i виражали у процентах вщ контролю, прийнятого за 100%.
щення р1вня експреси Ц1е1 про-теТ'нюнази п1д впливом тривалоТ' дм лише малих доз метил-третбутилового еф1ру за умов його внутр1шньошлункового введення щурам [23].
Як видно з даних, наведених на рис. 3 та 4, р1вень експресп шшоТ' протеТ'нкшази, казеТню-нази-1епсилон, також суттево збшьшувався за дп' на орга-шзм щур1в МТБЕ на р1вн1 ГДК у пов1тр1 робочоТ' зони: у легенях
— на 64 %, а у печ1нц1 — на 57%. Р1вень експресп циркади ального транскрипц1йного фактора BMAL1 за дм на орга-шзм щур1в МТБЕ збшьшувався у легенях на 73%, а у печ1нц1 — на 91% (рис. 5 та 6). Дослщ-ження експресп шшого цирка-д1ального транскрипц1йного фактора CLOCK показало, що у контрольних щур1в та у тва-рин, що пщдавалися дп' МТБЕ, виявляються дв1 1зоформи цього транскрипц1йного фактора, р1вень експресп обох 1зоформ зб1льшуеться п1д впливом ц1еТ токсично! х1м1чноТ сполуки (рис. 7 та 8). Вод-ночас п1д впливом тривалоТ' дп' МТБЕ на р1вн1 ГДК для пов1тря робочоТ' зони р1вень експресп мРНК CLOCK посилюеться у легенях значно б1льшою м1-рою, пор1вняно з печ1нкою: у легенях — на 225%, а у печ1нц1
— лише на 62% (рис. 8). Пщви-щення р1вня експресп мРНК CLOCK було виявлено нами i ран1ше за умов тривалоТ дм
Рисунок 9 Вплив тривалоТ (протягом мюяця) дГГ МТБЕ на piBHi ГДК у noBiTpi робочо'Г зони на piBeHb експресГГ мРНК циркадiального гена PER1 у легенях та печiнцi щурiв методом полiмеразноï ланцюговоГ реакцГГ кДНК, отриманих шляхом зворотно'Г транскрипцГГ мРНК. 1 — контрольнтварини, 2 — д^я МТБЕ.
Рiвень експресГГ мРНК бета-актину дослщжували
для контролю кiлькостi РНК, взято'Г для дослiдження.
малих доз МТБЕ у разi його внутршньошлункового введення щурам, але ефект був значно меншим [23]. Водно-час за умов внутршньошлун-кового введення щурам малих доз МТБЕ збшьшення рiвня експресiï мРНК казеТ'нкшази-1епсилон було виявлено лише у печшщ, а мРНК циркадiаль-ного транскрипцмного фактора BMAL1 — лише у легенях [23].
При дослщженш експресп циркадiального фактора PER1 було також виявлено значне збшьшення рiвня мРНК у легенях та печшщ щурiв за дiï низь-ких концентрацiй МТБЕ, але у легенях ефект ще'Т токсично)' хiмiчноï сполуки був значно бiльшим (рис. 9 та 10). Так, пщ впливом тривалоТ дп' МТБЕ на рiвнi ГДК у повiтрi робочоТ зони рiвень експресiï мРНК PER1 збТпьшився у легенях на 246%, а у печшщ — лише на 85%, по-рiвняно з контрольними тва-ринами.
Бiльш виражен змiни у рiвнях експресiï циркадiальних фак-торiв PER1 та CLOCK у легенях, порiвняно з печЫкою, можуть бути зумовленими тим, що са-ме через легенi МТБЕ надхо-див до органiзму, а також особ-ливостями епiтелiальних кттин легень i альвеоцитiв та рiзними шляхами метаболiзму МТБЕ у цих тканинах. Наведет вище данi переконливо свщчать про залежнiсть змiн у рiвнях екс-
пресп протеTнкiнази SNARK та основних циркадiальних фак-TopiB вiд величини доз МТБЕ та вщ способу його надходження до оргашзму.
Таким чином, результати да-ноТ роботи вказують на вираже-ну дiю МТБЕ на рiвнi ГДК на експресiю генiв надзвичайно важливих протеTнкiназ та цир-кадiальних факторов, вщпови дальних за регуляцю основних метаболiчних процесiв у кланах органiзму у таких життево важливих органах, як легенi та печшка. Отриманi результати вказують на те, що дiя МТБЕ на оргаызм може бути опосеред-кованою, принаймнi частково, порушенням функцiT бюлопч-ного годинника шляхом змiн в експресп циркадiальних факто-рiв, як контролюють бiльшiсть фiзiологiчних та метаболiчних процесiв в органiзмi. Отриманi результати вказують на необхщнють проведення по-дальших наукових дослiджень з метою з'ясування детальних молекулярних механiзмiв ток-сичноТ та канцерогенноТ дiй МТБЕ i пошуку шляхiв профi-лактики його негативного впли-ву на оргаызм, а також перегляду ГДК ^ie'T речовини у пови трi робочоТ зони. На нашу думку, одним з механiзмiв дп' низь-ких концентрацм МТБЕ на ор-ганiзм можуть бути порушення функцiонування системи бюло-гiчного годинника та сигналь-них каскадiв у клiтинах.
Рисунок 10
Кшькюне визначення рiвня експресГГ мРНК циркадiального гена PER1 у легенях та печiнцi щурiв методом полiмеразноï ланцюговоГ реакцГГ у реальному час за тривалоТ (протягом мiсяця) дГГ МТБЕ на рiвнi ГДК у повiтрi робочоТ зони. Рiвень експресГГ мРНК PER1 нормалiзували за бета-актином i виражали у процентах вщ контролю, прийнятого за 100%.
О
Висновки
1. Тривала дiя метил-третбу-тилового ефiру на оргашзм на рiвнi ГДК у повiтрi робочоТ зони призводить до збшьшення рiвня експресiТ мРНК протеТн-кiнази SNARK у таких життево важливих органах, як легенi та печшка.
2. Рiвень експресiТ гешв клю-чових циркадiальних факторiв суттево збшьшуеться у легенях та печшщ за дiТ на оргашзм метил-третбутилового ефiру на рiвнi ГДК у повiтрi робочоТ зони, що може порушувати регуляцiю основних метабо-лiчних процесiв в органiзмi i сприяти виникненню патоло-гiчних станiв.
3. Експресiя гешв SNARK, CSNK1E, PER1, BMAL1 та CLOCK може слугувати важли-вим чутливим показником шкщливо'Т дм хiмiчних забруд-нювачiв довкiлля у досить низьких концентра^ях.
4. Гранично допустима кон-центрацiя метил-третбутилово-го ефiру у повiтрi робочоТ зони (1 мг/м3) не забезпечуе безпеч-них умов працi оаб, що контак-тують з щею речовиною, i потре-буе перегляду у бк зменшення.
Л1ТЕРАТУРА
1. Harmer S.L., Panda S., Kay S.A. Molecular bases of cir-cadian rhythms // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. — 2001. — № 17.
— P. 215-253.
2. Crumbley C., Burris T.P. Direct regulation of CLOCK expression by REV-ERB // PLoS ONE.
— 2011. — 6, № 3. — P. E17290.
3. Liu A.C., Tran H.G. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptio-nal regulation of intracellular cir-cadian rhythms // PLoS Genet.
— 2008. — 4, № 2. — P. e1000023.
4. Huang W., Ramsey K.M., Marcheva B., Bass J. Circadian rhythms, sleep, and metabolism // J. Clin. Invest. — 2011. — № 121 (6): 2133-2141.
5. Bray M.S., Young M.E. The role of cell-specific circadian clocks in metabolism and disease // Obes. Rev. — 2009. — № 10, Suppl. 2: 6-13.
6. Kovac J., Husse J., Oster H. A time to fast, a time to feast: the crosstalk between metabolism and the circadian clock // Mol. Cells. — 2009. — № 28(2): 75-80.
7. Bechtold D.A., Gibbs J.E., Loudon A.S. Circadian dysfunction in disease // Trends Pharmacol.
Sci. — 2010. — 31, № 5. — R 191198.
8. Vielhaber E., Eide E., Rivers A. et al. Nuclear entry of the circadian regulator mRER1 is controlled by mammalian casein kinase I epsilon // Mol. Cell. Biol.
— 2000. — 20, № 13. — P. 48884899.
9. Okamura A., Iwata N., Tame-kane A. et al. Casein kinase lepsi-lon down-regulates phospho-Akt via RTEN, following genotoxic stress-induced apoptosis in he-matopoietic cells // Life Sci. —
2006. — 78, № 14. — P. 16241629.
10. Miyazaki K., Nagase T, Mes-aki M. et al. Phosphorylation of clock protein RER1 regulates its cir-cadian degradation in normal human fibroblasts // Biochem. J. — 2004. — 380, RT 1. — P. 95-103.
11. Sato T.K., Yamada R.G., Ukai H. et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function // Nat. Genet. — 2006. — 38, № 3. — R. 312-319.
12. Motzkus D., Loumi S., Cadenas C. et al. Activation of human period-1 by RKA or CLOCK/BMAL1 is conferred by separate signal transduction pathways // Chronobiol. Int. —
2007. — 24, № 5. — R. 783-792.
13. Lefebvre D.L., Rosen C.F. Regulation of SNARk activity in response to cellular stresses // Biochim. Biophys. Acta. — 2005.
— 1724, № 1-2. — P. 71-85.
14. Lee C.C. The circadian clock and tumor suppression by Mammalian period genes. Methods Enzymol. — 2005. — 393. — P. 852-861.
15. Tsuchihara K., Ogura T. et al. Susceptibility of Snark-defici-ent mice to azoxymethane-indu-ced colorectal tumorigenesis and the formation of aberrant crypt foci // Cancer Sci. — 2008.
— 99, № 4. — R. 677-682.
16. McGregor D. Ethyl tertiary-butyl ether: a toxicological review // Crit. Rev. Toxicol. — 2007. — 37, № 4. — 287-312.
17. Mehlman M.A. Dangerous and cancer-causing properties of products and chemicals in the oil-refining and petrochemical industry — Rart XXII: Health hazards from exposure to gasoline containing methyl tertiary butyl ether: study of New Jersey residents // Toxicol. Ind. Health. — 1996. — 12, № 5. — R. 613-627.
18. ^BopoBCbKMM O.n., 3eHKi-Ha B.I. Me™.n-TpeT6y™.noBMM e$ip AK mo6anbHMM 3a6pygHro-
вач довюлля. Токсиколопчш та еколопчш аспекти ризику впли-ву в Укра'Тш // Довюлля та здо-ров'я. — 2006. — № 4 (35). — C.75-80.
19. McGregor D. Methyl tertiary-butyl ether: studies for potential human health hazards // Crit. Rev. Toxicol. — 2006. — 36, № 4. — P. 319-358.
20. Moreels D., Lodewijks P., Zegers H. et al. Effect of short-term exposure to methyl-tert-bu-tyl ether and tert-butyl alcohol on the hatch rate and development of the African catfish, Clarias ga-riepinus / // Environ. Toxicol. Chem. — 2006. — 25, № 2. — P. 514-519.
21. Clary J.J. Methyl tert butyl ether systemic toxicity // Risk Anal. — 1997. — 17, № 6. — P. 661-672.
22. Imbriani M., Ghittori S., Pezzagno G. Partition coefficients of methyl tert-butyl ether (MTBE) // G. Ital. Med. Lav. Ergon. — 1997. — 19, № 3. — P. 63-65.
23. Мшченко О.Г., Мшчен-коД.О., Яворовський О.П. та ш. Експреая казе'Тнюнази-1 та SNARK у печшщ, легенях та мiокардi як показник впливу метил-третбутилового ефiру на оргашзм лабораторних тварин // Наук. вюник Нац. мед. ун-ту iм. О.О. Богомольця. — 2008. — № 21 (2). — С. 21-27.
24. МЫченко Д.О., Яворовський О. П. та Ы. Експеримен-тальш даш щодо порушення експресГТ циркадiальних гешв у пе-чЫц та легенях як показник ток-сичноТ дм метил-третбутилового ефiру на оргашзм // Укр. ж. з проблем медицини працк — 2008. — № 3 (15). — С. 20-26.
25. Мшченко О.Г., Яворовський О.П. та Ы. Циркадiальнi гени як чутливi маркери бюне-безпеки // Довюлля та здоров'я. — 2009. — № 1 (48). — С. 10-17.
26. Minchenko D.O., Mykhal-chenko V.G. et al. Unique alternative splice variants of rat 6-phosphofructo-2-kinase/fruc-tose-2,6-bisphosphatase-4 mRNA // Ukr. Biokhim. Zh. et al. 2008. — 80, № 4. — P. 66-73.
27. Minchenko O.H., Openta-nova I.L. et al. Hypoxia induces transcription of 6-phosphofruc-to-2-kinase/fructose-2,6-bis-phosphatase 4 gene via hypoxia-inducible factor-1 alpha activation // FEBS Lett. — 2004. — 576, № 1. — P. 14-20.
Надшшла до редакци 04.04.2012.
