CC BY
163
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные и клинические исследования стафилокиназы и Фортелизина®
Вышлов Е.В.1' 2, Алексеева Я.В.1, Герасимец Е.А.3, Марков В.А.1 2
1 НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН
2 ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск
3 ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», Москва
В статье представлены экспериментальные и пилотные клинические исследования стафилокиназы - наиболее фибринселективного тромболитика. Показаны высокая эффективность и безопасность болюсно-инфузи-онного применения стафилокиназы по сравнению с Актилизе® у больных с инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST (ОИМпST). Вместе с тем авторы наблюдали появление нейтрализующих антистафилокиназных антител в высоких титрах, что не позволяло вводить препарат повторно. Представлены результаты клинического применения генно-модифицированной неимуногенной стафилокиназы - препарата Фортелизин®. Как и стафилоки-наза, Фортелизин® обладает самой высокой фибринселективностью среди всех тромболитиков, что позволило применять меньшие дозы препарата (15 мг) и достичь высоких значений коронарной реперфузии. При введении Фортелизина® не образовывались нейтрализующие антитела. Результаты 4-летнего мониторинга применения препарата Фортелизин®, охватившего 4123 пациентов с ОИМпST, показали его высокую эффективность, безопасность и удобство применения.
Ключевые слова:
инфаркт миокарда, острый коронарный синдром с подъемом сегмента БТ, тромболизис, Фортелизин®
Experimental and clinical studies of staphylokinase and Fortelyzin®
Vishlov E.V.1 2, Alekseeva Ya.V.1, Gerasimets Е.А.3, Markov V.A.1 2
1 Cardiology Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences
2 Siberian State Medical University, Tomsk
3 Peoples Friendship University of Russia, Moscow
The article presents experimental and pilot clinical studies of staphylokinase as the most fibrin-selective thrombolytic. It was shown a high efficacy and safety of bolus-infusion usage of staphylokinase compared to Actilyse® in patients with myocardial infarction with S7~-segment elevation (5TEMI). However, the authors observed the appearance of anti-staphylokinase neutralizing antibodies in high titers, which was not allowed to use the thrombolytic agent again. The article presents the results of the clinical application of genetically modified nonimmunogenic staphylokinase - thrombolytic agent Fortelyzin®. As a staphylokinase, Fortelyzin has the highest fibrin-selectivity among all the thrombolytics, which allowes to use the smaller doses of the agent (15 mg) and to obtain high values of coronary reperfusion. After the usage of Fortelyzin® the neutralizing antistaphylokinase antibodies didn»t appear. The results of the 4-year monitoring of the Fortelyzin®, covering 4123 patients with STEMI showed its high efficacy, safety and a simple way of usage.
Keywords:
myocardial infarction, acute coronary syndrome with ST segment elevation, thrombolysis, Fortelyzin®
Тромболитический потенциал стафилокиназы был выявлен в 1964 г.: этот тромболитик сначала испытывали в двух сериях экспериментов на собаках [1]. Собакам вводили стафилокиназу в бедренную артерию системно и внутриартериально. Результаты проведенных экспериментов обескуражили, так как препарат показал себя как тромболитик, вызывающий полную деградацию фибриногена и сильные кровотечения.
При ретроспективном анализе результатов исследования было обнаружено, что фибринолитическая система собак и человека по-разному реагирует на введение стафилокиназы. Оказалось, что низкая фибринселектив-ность тромболитика у собак обусловлена замедленным ингибированием а2-антиплазмином плазмин-стафило-киназного комплекса. Таким образом, выбор плазмы собак для первоначальной оценки стафилокиназы in vivo
привел к ошибочному выводу о неперспективности этого тромболитика [2].
Ошибочность изначальных заключений об эффективности и безопасности стафилокиназы в последующем подтвердили эксперименты, проведенные на хомяках и бабуинах [1, 2]. В опыте на хомяках проводилось сравнительное исследование стафилокиназы и стрептоки-назы на модели легочной тромбоэмболии. Животные были поделены на 3 группы: 1-й группе вводили тромбы из человеческой плазмы, обедненной тромбоцитами, 2-й группе - тромбы, богатые тромбоцитами (3х105 тромбо-цитов/ммоль), 3-й группе - тромбы, насыщенные тромбоцитами (1,5х106 тромбоцитов/ммоль). При определении тромболитической активности стафилокиназа и стреп-токиназа показали относительно сопоставимые результаты в группах с тромбами с обедненными и богатыми тромбоцитами. Однако в 3-й группе хомяков, где тромбы состояли из человеческой плазмы, насыщенной тромбоцитами, эффективность стафилокиназы оказалась в 5 раз выше по сравнению со стрептокиназой. У бабуинов внутривенное введение как стрептокиназы, так и стафилокиназы вызывало одинаковый дозозависимый фибрин-селективный лизис фибрина, меченного аутологическими тромбоцитами, но при применении стафилокиназы река-нализация на модели богатого тромбоцитами артериального тромба достигалась чаще и более продолжительное время, чем при стрептокиназе.
Среди тромболитиков III поколения (алтеплаза, тенек-теплаза, стафилокиназа), по мнению одного из ведущих
кардиологов Европы M. Verstraete, наиболее фибринсе-лективным является стафилокиназа [3]. Этого же мнения придерживаются и другие исследователи [4], а D. Collen называет стафилокиназу уникальным фибринселектив-ным тромболитиком [1]. Механизм действия фибрин-селективного тромболитика основано на связывании только с тем фибрин-фибриногеном, который находится на тромбе, и игнорировании фибриногена, находящегося в системном кровотоке, что не приводит к массивным кровотечениям. В противоположность этому фибрин-неселективный тромболитик, например стрептокиназа, связывается как с фибрин-фибриногеном, находящимся на тромбе, так и с циркулирующим фибриногеном, приводя к массивным кровотечениям. Фибринселектив-ность тромболитика обусловливает и его дозозависимый клинический эффект. По данным M. Verstraete, доза умеренно селективного тромболитика алтеплазы равна 100 мг, селективного тромболитика тенектеплаза - 50 мг, а наиболее селективного тромболитика стафилокиназы -15-20 мг [3]. В рандомизированных сравнительных исследованиях стафилокиназа vs алтеплаза в виде болюс-но-инфузионного способа введения у больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST (ИМп5Г) было показано преимущество стафилокиназы по эффективности (частота коронарной реперфузии) и безопасности (наличие кровотечений и минимальное снижение фибриногена крови, плазминогена, а2-антиплазмина) (см. рисунок) [5, 6]. Основным недостатком стафилокиназы, применявшейся в этих исследованиях, было обра-
6 -
4 -
2 -
10
100 log, мин
1000 10000
10
100 log, мин
1000 10000
120 ^ 100 £ 80 мин 60
СО
| 40 20 0
100
| 80 а.
СО
о 60 о
СО
о
Л 40 м
О
5 20 1=
0
10
100 log, мин
1000 10000
10
100 log, мин
1000 10000
Сравнение показателей фибринолиза и коагуляции (фибриноген, плазминоген, а2-антиплазмин и протромбиновое время) у пациентов, получавших стафилокиназу (о) и алтеплазу (■); * - р<0,000001
0
зование нейтрализующих антистафилокиназных антител, что не позволяло вводить ее повторно.
Появление нейтрализующих антистафилокиназных антител было ожидаемо. Ген стафилокиназы был клонирован из бактериофагов sakéC и sak42D [7], a также из геномной ДНК (sakSTAR) лизогенного штамма Staphylococcus aureus. Экспрессию гена проводили под контролем промотора ÀPR и его трансляционных сигналов в Escherichia coli. Стафилокиназный ген кодирует белок из 163 аминокислот с аминокислотой 28, соответствующей NН2-концевому остатку зрелой стафилокиназы полной длины [2, 8]. Таким образом, применение стафилокиназы, подобно стрепто-киназе, необходимо ограничивать единственным введением. С учетом того, что уровни уже сформированных антистафилокиназных антител в общей популяции ниже, чем антистрептокиназных, в проведенных исследованиях введение стафилокиназы не вызывало развития аллергических реакций. Однако у большинства пациентов через
2 нед после введения препарата выявляли нейтрализующие антистафилокиназные IgG, которые сохранялись на протяжении 2 мес. В связи с этим следует избегать повторного применения стафилокиназы со 2-й недели после первого введения. Пациенты с высокими титрами антител не только невосприимчивы к тромболитическому действию препарата, но и подвержены высокому риску развития аллергических реакций, в том числе анафилактического шока.
Именно иммуногенность стафилокиназы препятствовала ее широкому применению. В связи с этим стали использовать генную инженерию для снижение иммунно-генности препарата. Было выявлено, что стафилокиназа дикого типа (sakSTAR) состоит из 3 иммунодоминантных эпитопов, и с помощью специфичного сайт-направленного мутагенеза две антигенных детерминанты могут быть убраны без снижения фибринолитической активности.
В ходе проведенных экспериментов было получено несколько модификаций стафилокиназы дикого типа. Так, D. Collen с группой ученых создали 21 производную молекулы нативной стафилокиназы. Некоторые из них были неактивными, другие реагировали с панелью моно-клональных антител, как и нативная стафилокиназа. Все
3 производных оказывали тромболитический эффект, но слабо реагировали с панелью антител [9].
Параллельно этим исследованиям L. Moons создал мутантную полиэтиленгликолевую молекулу с заменой аминокислоты цистеина на серин в кластере 3, сокращенное название молекулы - SY 161-P5 [10]. Таким образом, исследователям удалось увеличить период полувыведения молекулы, чтобы можно было назначать исследуемый препарат однократным болюсом. Но при испытаниях этого препарата на крысах, мышах, хомяках и кроликах был обнаружен кардиотоксический эффект. При секционном исследовании у животных выявляли миокардит с умеренной или минимальной активностью. Хотя в выводах исследователи указали, что мутантная стафилокиназа по кардиотоксичности аналогична нативной стафилоки-назе и стрептокиназе, больше в литературе не найдено описаний последующих исследований SY 161-P5.
Фортелизин® - отечественный фибринселективный тромболитик. В 2012 г. Минздрав РФ зарегистрировал оригинальный тромболитический препарат Фортелизин® (ЛП-001941 от 18.12.2012) для лечения больных ИМп57\ Фортелизин® - это рекомбинантный белок E. coli, полученный по генно-инженерной технологии и содержащий аминокислотную последовательность неиммуногенной стафилокиназы. Для его создания был сконструирован ген Sak7-457, получена сначала рекомбинантная плаз-мида pZT11, несущая этот ген под контролем промотора бактериофага Т5, а затем синтезирован штамм-продуцент неиммуногенной стафилокиназы Sak7-457 (E. coli MZ09) с заменой аминокислот в иммунодоминантном эпитопе белка.
Были разработаны инновационные способы хрома-тографической очистки лекарственной субстанции Фор-теплазе® на СМ- и DEAE-сефарозах и на G-25-сефадексе. Создан оригинальный состав вспомогательных веществ для получения готовой лекарственной формы, отработаны промышленные технологии лиофильной сушки, позволяющие сохранять фибринолитическую активность препарата Фортелизин® на протяжении всего 3-летнего срока годности.
Проект создания инновационного отечественного лекарственного препарата Фортелизин® осуществлялся с участием ведущих медицинских и научных центров (МГУ им. М.В. Ломоносова, Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, РУДН, НИИ кардиологии СО РАМН и др.) и занял более 12 лет [11, 12]. При разработке субстанции и лекарственной формы препарата Фортелизин® были учтены требования Российской, Британской, Европейской и Американской фармакопей.
Доклинические и клинические исследования препарата Фортелизин® проходили в ведущих кардиологических клиниках и региональных сосудистых центрах России и показали, что восстановление коронарного кровотока, по данным ангиографии, происходит не менее чем в 80% (критерии TIMI 2-3), по данным электрокардиографии (снижение сегмента ST) - не менее чем в 85% случаев. Отмечена незначительная доля малых кровотечений из мест пункций, геморрагических инсультов не было, что, по-видимому, обусловлено минимальным снижением циркулирующего фибриногена (7%). Такое незначительное снижение фибриногена при введении Фортелизина® подтверждает предыдущие исследования стафилокиназы как самого фибринселективного среди всех существующих тромболитиков. Подробно результаты доклинического и клинических исследований Фортелизина® были опубликованы ранее [13, 14].
Производство лекарственного препарата Фортелизин® осуществляется в соответствии с действующими в РФ нормативными актами и правилами Good Manufactured Practice (Лицензия № 00204-ЛС от 08.06.2016).
Мониторинг эффективности и безопасности препарата Фортелизин® осуществляется постоянно, с июня 2013 по март 2017 г. он охватил 4123 больных с ИМпST. Средний возраст больных, которым вводился Фортелизин®, составил 64 года, старше 75 лет было 610 человек, мужчины со-
ставили 72% от общего числа больных. По локализации патологии преобладал передний инфаркт миокарда (табл. 1).
Время от начала симптомов инфаркта миокарда до введения препарата Фортелизин® составило 206 мин. Признаки реперфузии миокарда, по данным ЭКГ, к 90-й минуте при неинвазивной стратегии отмечались у 2542 из 3139 больных, что составило 81%, при фармакоинва-зивной стратегии - у 826 из 984 больных (83%).
При фармакоинвазивной стратегии (ТЛТ + ЧКВ), по данным коронарной ангиографии восстановление коронарного кровотока по критериям TIMI 3 наблюдалось у 403 из 984 больных (41%), по критерию TIMI 2 - у 305
больных (31%), всего по сумме Т1М1 2-3 - у 708 из 984 больных (72%).
Геморрагический инсульт был у 9 (0,3%) больных при неинвазивной стратегии (ТЛТ) и у 3 (0,3%) больных -при фармакоинвазивной.
Смертность за время госпитализации была несколько выше в неивазивной группе по сравнению с фармакоинвазивной - 4,5 и 3,2% соответственно.
Количество кровотечений, потребовавших переливания крови, и малых кровотечений в течение 7 сут было одинаково в обеих группах и составило соответственно 0,7 и 2,5% (табл. 2, 3).
Таблица 1. Основные характеристики пациентов, участвующих в мониторинге эффективности и безопасности медицинского применения препарата Фортелизин®
Количество Пол (м/ж) Возраст Количество Локализация инфаркта Время «боль - игла»
больных mediana, minmax, лет пациентов >75 лет передний задний mediana, min-max, мин
4123 2981/1142 64 32-93 610 (15%) 2300 1823 206 40-720
Таблица 2. Мониторинг эффективности и безопасности применения препарата Фортелизин® при фармакоинвазивной стратегии (ТЛТ + ЧКВ) (п=984)
Признаки TIMI Геморрагический Госпитальная Кровотечения, Малые
реперфузии инсульт за время летальность потребовавшие кровотечения
(снижение подъема госпитализации переливания в течение
ST 3 2 крови за время первых суток
на 50%) на 90-й В3Ы госпитализации
минуте
826 403 305 708 3 31 7 24
(83%) (41%) (31%) (72%) (0,3%) (3,2%) (0,7%) (2,5%)
Примечание. ТЛТ - тромболитическая терапия; ЧКВ - чрескожное вмешательство.
Таблица 3. Мониторинг эффективности и безопасности применения препарата Фортелизин® при неинвазивной стратегии (ТЛТ) (п=3139)
Признаки реперфузии Геморрагический инсульт Госпитальная Кровотечения, потребовавшие Малые кровотечения
(снижение подъема ST за время госпитализации летальность переливания крови за время в течение 1 суток
на 50%) на 90-й минуте госпитализации
2542 9 141 22 72
(81%) (0,3%) (4,5%) (0,7%) (2,3%)
Приведенные данные эффективности и безопасности препарата Фортелизин®, основанные на мониторинге 4123 больных с ИМп5Г, говорят о результатах, сопоставимых с применением зарубежных тромболитиков алте-плазы и тенектеплазы. В настоящее время в инструкции по медицинскому применению препарата Фортелизин® разрешены болюсный (двойной болюс) и болюсно-инфу-зионный (30 мин) способы введения.
В целях изменения Инструкции по медицинскому применению препарата Фортелизин® в части однократного болюсного введения в соответствии с разрешением Министерства здравоохранения РФ № 261 от 16.05.014 закончено многоцентровое рандомизированное открытое сравнительное исследование эффективности и безопасности однократного болюсного введения препаратов
Фортелизин® и Метализе® у больных с ИМп5Г, которое позволит расширить применение Фортелизина®, особенно на догоспитальном этапе, в скорой медицинской помощи.
В рамках стратегии импортозамещения, а также учитывая актуальность вопроса проведения тромболитиче-ской терапии на догоспитальном и раннем госпитальном этапах больным с острым инфарктом миокарда, Правительство РФ включило оригинальный отечественный лекарственный препарат Фортелизин® (рекомбинантный белок, содержащий аминокислотную последовательность стафилокиназы) в обновленный Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения на 2017 г. (Распоряжение Правительства РФ от 28.21.2016 № 2885-р) [15].
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Вышлов Евгений Викторович - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отделения неотложной кардиологии НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, доцент кафедры кардиологии ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России E-mail: evv@cardio-tomsk.ru
Алексеева Яна Валерьевна - аспирант НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН
E-mail: Marckova.Yanochka@yandex.ru
Герасимец Евгений Алексеевич - аспирант кафедры кардиологии, рентгенэндоваскулярных и гибридных методов диагностики и лечения факультета повышения квалификации медицинских работников ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», Москва E-mail: j.hydro@yandex.ru
Марков Валентин Алексеевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой кардиологии ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, ведущий научный сотрудник отделения неотложной кардиологии НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН
E-mail: markov@cardio.tsu.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Collen D. Staphylokinase: a potent, uniquely fibrin-selective thrombolytic agent // Nat. Med. 1998. Vol. 4, N 3. P. 279-284.
2. Collen D., Lijnen H.R. Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator with therapeutic potential? // Blood. 1994. Vol. 84, N 3 P. 680-686.
3. Vestraete M. Third-generation thrombolytic drugs // Am. J. Med. 2000. Vol. 109. P. 52-58.
4. Kunadian V., Gibson C.M. Trombolytics and myocardial infarction // Cadriovasc. Ther. 2012. Vol. 30. P. 81-88.
5. Vanderschueren S., Dens J., Kerdsinchai P. et al. Randomized coronary patency trial of double-bolus recombinant staphylokinase versus front-loaded alteplase in acute myocardial infarction. Acute Ischemic Heart Disease // Am. Heart J. 1997. Vol. 134, N 2. Pt 1. P. 213-219.
6. A randomized multicenter trial comparing recombinant staphylokinase with recombinant tissue-type plasminogen activator in patients with acute myocardial infarction / Department of Cardiology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032. China // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2007. Vol. 35, N 8. P. 691-696.
7. Szarka S.J., Sihota E.G., Habibi H.R. et al. Staphylokinase as a plasminogen activator component in recombinant fusion
proteins // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, N 2. P. 506513.
8. Sazonova I.Y.,. Houng A.K et al. The mechanism of a bacterial plasminogen activator intermediate between streptokinase and staphylokinase // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, N 16. P. 1260912613.
9. Collen D. Пат. ЕАПО № 000121 от 30.06.1998 г. Новые производные стафилокиназы.
10. Moons L., Vanlinthout I., Roelants I. Toxicology studies with recombinant Staphylokinase and with SY 161-P5, a polyethylene glycol-derivatized cysteine-substitution mutant // Toxicol. Pathol. 2001. Vol. 29, N 3. P. 285-291.
11. Маркин С.С. и др. Пат. РФ 2156299 от 20.09.2000. Рекомби-нантная плазмидная ДНК, кодирующая полную последовательность стафилокиназы, штамм Escherichia coli SA 9325 -продуцент рекомбинантного белка.
12. Вилькин Я.Ф., Маркин С.С., Семенов А.М. и др. Пат. РФ 2483750 от 10.06.2013 г. Способ лечения больных с острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST.
13. Маркин С.С., Семенов А.М., Арзамасцев Е.В. и др. Доклинические и клиническое исследование фибринселективного тромболитического препарата Фортелизин® // Мед. академ. журн. 2012. Т. 12, № 1. С. 80-86.
