CC BY
39
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОЗДАНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ПИРРОЛСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ
С. С. Зыкова1, Н.М. Игидов2, М.А. Киселев2, С.В. Бойчук3, А.Р. Галембикова3, Д.В. Загулова4
1ФКОУВО «Пермский институт ФСИНРоссии», Пермь, Россия
2ФГОУВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия», Пермь, Россия ЪФГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия 4Балтийская Международная академия, Рига, Латвия
Аннотация. Статья посвящена изучению механизмов цитотоксической активности ряда пирролсодержащих гете-роциклов. Установлено и подтверждено статистическими данными, что соединения, оказывающие прогипоксиче-ский эффект (усиливают действие гипоксии, укорачивая время жизни по отношению к контролю на модели нор-мобарической гипоксиии с гиперкапнией) обладают выраженной цитотоксической активностью по отношению к различным опухолевым клеткам in vitro.
Ключевые слова: пирролсодержащие гетероциклы, прогипоксическая активность, цитотоксическая активность.
Для пирролсодержащих гетероциклов характерна биологическая и физиологическая плейо-тропность [1]. Обнаружено, что соединения, имеющие в своем составе пиррольный гетероцикл, обладают разнообразными видами биологической активности: противомикробной [2], ноотропной [3], противовоспалительной, противоопухолевой [4], а также влияют на рост и развитие растений [5].
В работе исследовалась возможность использования пирролсодержащих гетероциклов в качестве эффективных и безопасных противоопухолевых средств.
Для изучения биологической активности в ряду пирролсодержащих гетероциклических соединений прежде всего исследовали антиоксидантную активность на культуре клеток Escherichia coli и фотоколориметрическим определением способности соединений связывать стабильные хромоген-радикалы дифенилпикрилгидразила (ДФПГ) [6; 7].
Затем определили антигипоксантную активность пивалоилзамещенных 2-пирролонов (рис. 1) [8].
о О
а) б)
Рис. 1. Общая формула пивалоилзамещенных 2-пирролонов (а), а также арил(гетерил, этил)-2-амино-1-бензоиламино-5-(2-оксо-2-арилэтилиден)-4-оксо-пирролидин-3-карбоксилатов, R = Het, Ar, EtO (б)
Целью настоящей работы явилось изучение цитотоксической активности in vitro ряда пирролсодержащих гетероциклов, которые стали бы химической основой для дальнейшего поиска новых эффективных и безопасных противоопухолевых средств. Для этого на культурах клеток нормальных фибробластов и линий опухолевых клеток лейомиосаркомы SK-LMS-1, аденокарцинома шейки матки HeLa S3, остеосаркомы U2-OS, немелко-клеточного рака легкого H1299 и гастроинтести-
----—
нальных стромальных опухолей (ГИСТ) была изучена цитотоксическая активность ряда пивало-илзамещенных пирролсодержащих гетероциклов, а также возможный молекулярный механизм их действия. Обнаруженный нами цитотоксический эффект вышеуказанных соединений был значительно более выражен в отношение опухолевых клеток по сравнению с нетрансформированными (фибробласты). Механизм противоопухолевой активности пирролсодержащих гетероциклов был обусловлен их способностью вызывать нарушения регуляции клеточного цикла в опухолевых клетках и индуцировать их арест в М-фазе посредством нарушений процессов полимеризации тубулина, что в последующем приводило к гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза [9—11; 16].
В пользу гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза под действием пирролсодержащих гетероциклов свидетельствовали многочисленные факты: а) увеличение содержания гиподиплоид-ных клеток, определяемой методом проточной ци-тометрии; б) повышение уровней экспрессии расщепленных форм каспазы-3 и поли-АДФ(рибо-за)-полимеразы (ПАРП-1), определяемое методом иммуноблоттинга; в) значительное повышение количеств апоптотических телец и ТиКЕЬ-позитив-
ных клеток, определяемых методом иммуноф-люоресценции и др. [16].
При изучении взаимосвязи между различными видами биологической активности у различных моно-, би- и трициклических гетероциклов была выявлена закономерность между их цитотоксично-стью и способностью оказывать влияние на клеточный редокс-потенциал.
Известно, что гипоксия является важным фактором, влияющим на различные физиологические процессы (энергетический метаболизм, ау-тофагию, подвижность клеток, ангиогенез и др.). Гипоксия также считается одним из важнейших регуляторов пролиферации клеток. Молекулярные механизмы данного феномена до конца не изучены. Тем не менее показано, что способность гипоксии подавлять клеточную пролиферацию в значительной степени обусловлена продукцией в клетках так называемых гипоксий-индуцирующих факторов (HIF-1 и HIF-2, от англ. hypoxia induced factor 1 и 2) [12].
Нами была выявлена определенная закономерность между прогипоксическими и цитоток-сическими свойствами гетероциклических систем (12 классов соединений, обозначенных римскими цифрами в табл. 1).
Таблица 1
Взаимосвязь между прогипоксической и цитотоксической активностью и структуры гетероциклов
Соединение Уменьшение Структура 1/ Цитотоксичность, качественный
времени жизни, % структура 2* микроскопический анализ**
I г 5,99 1 1
II б 2,0 1 1
III д -17,0 1 2
IV а -11,3 1 1
IV ж -19,1 1 2
IV м -12,7 1 1
IV о -14,3 1 2
V в 1,1 2 0
VI н 8,5 2 0
VII д 8,4 2 0
VIII к -11,5 2 1
IX г -3,1 2 0
IX л -4,7 2 1
IX п -3,9 2 0
IX р -1,4 2 0
X г 0,2 2 0
Примечания. *Структура 1 — соединения имеют в составе гетероцикл пиррол; структура 2 — соединения имеют в составе другие гетероциклы. ** Качественный показатель микроскопии: 0 — соединения не обладают цитотоксической активностью, 1 — соединения обладают цитотоксической активностью в незначительной степени, 2 — соединения обладают значительной цитотоксической активностью.
----—-
Установлено, что соединения, оказывающие прогипоксический эффект (усиливают действие гипоксии, укорачивая время жизни по отношению к контролю на модели нормобарической гипоксиии с гиперкапнией) обладают цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам in vitro (согласно данным световой микроскопии).
Для сравнения средних значений уменьшения времени жизни в 3-х группах цитотоксичности использовали метод ANOVA (см. табл. 1).
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что снижение жизнеспособности опухолевых клеток in vitro при их инкубации с вышеуказанными соединениями статистически значимо меньше в группе 2, чем в группе 1 (р = 0.002), при этом средние значения показателя активности, соответствующие 1-й и 2-й, а также 1-й и 0-й группам, статистически значимо не различаются.
В целом зависимость между уменьшением времени жизни и цитотоксичности оказалась значимой, р = 0,003, F = 9,53 (табл. 2).
Для сравнения цитотоксической активности пирролов и других соединений использовали U-тест Манна—Уитни. Согласно полученным данным уровень цитотоксической активности пиррол-содержащих гетероциклических соединений I, II, III и IV статистически значимо выше, чем у других моно-, би- и трициклических гетероциклов, p = = 0,002 (рис. 1).
Таким образом, прогипоксическая активность соединений на модели нормобарической гипоксии с гиперкапнией может рассматриваться как один из факторов, способных определять перспективы проведения скрининга соединений на предмет их противоопухолевой активности.
Таблица 2
Значения уровнейр апостериорного НЕБ* теста Тьюки для неравных выборок, средних значений и стандартных отклонений
Средние значения ± стандартное отклонение
уменьшения времени жизни
1,40 ± 5,12 -5,37 ± 7,88 -16,80 ± 2,41
Группы цитотоксичности 0 1 2
0 0,150 0,002
1 0,150 0,090
2 0,002 0,090
Примечание: *тест HSD (honest significant difference) — тест достоверно значимой разности.
-10 -12
я -14
-16 -18
-20 -22
Цитотоксичность, микроскопия
Рис. 2. Средние значения (■), ошибка среднего (□) и стандартное отклонение (|) уменьшения времени жизни в 3-х группах определения цитотоксичности по результатам световой микроскопии
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 123 ~
8
6
4
2
0
2
----—
Не исключено, что помимо нарушений процессов полимеризации тубулина в опухолевых клетках под действием пирролсодержащих гетероцик-лов I, II, III и IV, механизм их действия может быть также обусловлен активацией в опухолевых клетках белка HIF-1a и других белков этого семейства, обладающих, как известно, выраженной анти-про-лиферативной и про-апоптотической активностью.
Для подтверждения правомочности данной гипотезы о механизме действия вышеназванных пирролсодержащих гетероциклов требуется проведение дальнейших исследований.
Проведен сравнительный анализ прогноза цитотоксической активности при помощи компьютерной программы PASS online (табл. 3).
Таблица 3
Сравнительный анализ прогноза цитотоксической активности моно-, би- и трициклических соединений
Класс Формула № R1 R2 Прогноз активности, Ps ЦТА
I г 4- CH3C6H4 4^NC6H4 0,2971 «+»
II "Ур. б 4-Ш2С6Н4 4-СН3С6Н4 0,2331 «-»
III д 4-BrC6H4CONH C6H5 0,2761 «+»
IV X 0 а тиазол-2-ил 4-QC6H4 0,2651 «-»
ж тиазол-2-ил 4-BrC6H4 0,4681 «+»
м пиридин-2-ил 2-CH3C6H4 0,5171
о 2-(5-СН3 пиридил) 2-IC6H4 0,5041
V в 4-СЮ6Щ 4-аС6Н4 0,2772 «-»
VI н 4-СЮ6Щ 4-QC6H4 0,3161 «-»
VII д 4-СНзC6H4 0,3881 «-»
VIII •Ä к 2-нафтил 2-нафтил 0,3271 «-»
----—-
Окончание таблицы 3
Сравнительный анализ прогноза цитотоксической активности моно-, би- и трициклических соединений
Класс Формула № R1 R2 Прогноз активности, Ра ЦТА
IX 10?' г С(СНз)з NO2 0,58G1 «-»
л 2,4-(СНз)2СбНз Н 0,46G1
п 4-СН3С6Н4 NO2 0,4711
р 2-нафтил NO2 0,4631
X O^s^^COR2 г Tos Tos 0,1711
Примечания: 1 Antineoplastic (Антинеопластическая активность); 2 Cytoprotectant (Цитопротекгант); 3 Cytotoxic (Цитотоксическая активность); 4 Су^айс (Цитостатическая активность).
Согласно сопоставления результатов прогноза и полученных экспериментальным путем данные не всегда совпадают, что диктует необходимость совершенствования подходов к скринингу противоопухолевых средств.
Важно отметить, что нами определена острая токсичность LD50 у 6 наиболее активных пиррол-содержащих гетероциклов составляла от 1870— 2260 мг/кг, что значительно выше, чем у ряда известных химиопрепаратов, в частности, паклитак-села и этопозида. Данный факт также свидетельствует в пользу перспективности поиска новых эффективных и безопасных противоопухолевых средств на базе пирролсодержащих гетероциклов.
Благодарность. Исследования по изучению цитотоксической активности пиррол-содержа-щих гетероциклический соединений проводились на кафедре общей патологии Казанского государственного медицинского университета за счет средств гранта РФФИ 16-34-01005 Мол-а.
ЛИТЕРАТУРА
1. ^^tan^^dou M., Gkermani A., Hadjipavlou-Litina D. Synthesis and Pharmacochemistry of New Pleio-tropic Pyrrolyl Derivatives // Molecules. 2015. 20(9). P. 16354—16374.
2. Гейн В.Л., Гейн Л.Ф., Замараев И.А. Синтез и противомикробная активность 4-арил(гетерил)-3-ме-тил(фенил)-5-пропил-1Я-4,6-дигидро-пирроло-[3,4с]-пиразол-6-онов // Бутлеровские сообщения. 2009. Т. 16. № 3. С. 24—29.
3. Патент РФ № 2421446. C 07 D 207 38, A 61 K 31 4015. 4-Ацетил-5-(4-бромфенил)-3-гидроксипропил-3-
пирролин-2-он, проявляющий ноотропную активность / В.Л. Гейн, Л.Ф. Гейн, И.А. Кылосова и др. // Заявка № 2008119883/04 от 19.05.2008.
4. Синтез и фармакологическая активность 3-гид-рокси-1, 5 -диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирроло-нов / В.О. Козьминых, Н.М. Игидов, С.С. Зыкова,
B.Э. Колла, Н.С. Шуклина, Т.Ф. Одегова // Хим.-фарм. журн. 2002. Т. 36. № 4. С. 23—26.
5. Зыкова С.С., Лейних П.А., Красилова И.В. Исследование продуктов нуклеофильных реакций 1,3,4-трикарбонильных соединений с арилиденариламинами в качестве перспективных стимуляторов роста // Меж-дунар. журн. эксперим. образования. 2013. № 11-1.
C. 187—189.
6. Зыкова С.С. Антиоксидантная и противовоспалительная активность 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов // Медицина в ХХ1 веке: тенденции и перспективы: Матер. III Всерос. науч. интер-нет-конф. с междунар. участ. Сервис виртуальных конференций Pax Grid: ИП Синяев Д.Н. 2014. С. 84—88.
7. Зыкова С.С., Одегова Т.Ф. Синтез, противовоспалительная и антиоксидантная активность некоторых замещенных 3 -гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-ди-гидро-2-пирролонов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2014. Т. 12. № 7. С. 4—8.
8. Зыкова С.С. Перспективы применения 3-гид-рокси-1,5-диарил-замещенных 4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов как антигипоксантов // Современная медицина: актуальные вопросы. Материалы L междунар. науч. конф. Новосибирск, 2015. № 50. С. 112—117.
9. Зыкова С.С., Бойчук С.В. Противоопухолевая активность in vitro 3-гидрокси-4-пивалоил-5,6-дигидро-2-пирролонов // ХУШ Международная научная конференция: «Онкология — XXI век», г. Брюссель, Бельгия, 2013. С. 75—78.
10. 3-Гидрокси-1, 5-диарил-4 -пивалоил-2, 5 -дигидро-2-пирролоны нарушают процессы митоза и рост опухолевых клеток in vitro / С.С. Зыкова, С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова, Б.Р. Рамазанов и др. // Цитология. 2014. Т. 56. № 6. С. 439—442.
11. Галембикова А.Р., Зыкова С.С., Бойчук С.В. 4-Пивалоил-2-пирролоны вызывают нарушения митоза и индукцию опухолевых клеток in vivo // ХХ Всерос. конф. по фундам. онкологии «Петровские чтения — 2014». НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова. СПб., 2014. С. 21.
12. Н^Ы M.E., Semenza G.L. Regulation of cell proliferation by hypoxia-inducible factors // Amer. Journal of Physiology Cell Physiology. 2015. 309 (12). P. 775—782. DOI: 10.1152/ajpcell. 00279.2015.
13. Суханов В.А., Саприн Н.А., Пирузян Л.А. Фармакогенетические проблемы противоопухолевой терапии (обзор) // Хим.-фарм. журнал. 2004. Т. 38. № 7. С. 3—9.
14. Ying W. Roles of NAD(+), PARP-1 and sirtuins in Cell Death, Ischemic Brain Injury and Synchrotron Radiation X-Ray Induced Tissue Injury // Scientifica (Cairo), 2013. 691251.
15. Бойчук С.В., Галембикова А.Р., Зыкова С.С., Хуснутдинов Р.Р. Нарушения регуляции клеточного цикла и репараций повреждений ДНК в опухолевых клетках под действием замещенного этилового эфира 2-амино-Ш-пиррол-3-карбоновой кислоты // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 5; URL: http://www.science-education.ru/128-21902 (дата обращения: 30.06.2016).
16. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates are novel potent anticancer agents that affect tubulin polymerization, induce G2/M cell-cycle arrest, and effectively inhibit soft tissue cancer cell growth in vitro / S. Boichuk, A. Ga-lembikova, S. Zykova, B. Ramazanov, R. Khusnutdinov, P. Dunaev, S. Khaibullina, V. Lombardi // Anti-Cancer Drugs. 27(7). Р. 620—634. DOI: 10.1097/ CAD.0000000000000372.
EXPERIMENTAL STUDY ON THE DEVELOPMENT OF ANTICANCER AGENTS BASED ON PYRROLE CONTAINING HETEROCYCLES
S.S. Zykova1, N.M. Igidov2, M.A. Kiselev2, S.V. Boychuk3, A.R. Hlimbekova3, D. V. Zagulova4
'Perm Institute of the Federal penitentiary service of Russia
2Perm state pharmaceutical Academy, Perm, Russia 3Kazan state medical University, Kazan, Russia
4Baltic international Academy, Riga, Latvia
Annotation. The manuscript describes the mechanisms of the cytotoxic activities of the heterocyclic pyrroles. We found that substances with hypoxic activities (e.g. decrease the survival rates during the hypoxia with hypercapnia) provide the potent cytotoxic activities against various types of the tumor cells in vitro.
Key words: heterocyclic pyrroles, hypoxic activity, сytotoxic activity.
REFERENCES
1. ^^ta^^dou M., Gkermani A., Hadjipavlou-Litina D. Synthesis and Pharmacochemistry of New Pleio-tropic Pyrrolyl Derivatives. Molecules, 2015, 20(9), pp. 16354—16374.
2. Gein V.L., Gein L.F., Zamaraev I.A. Sintez i protivomikrobnaya aktivnost' 4-aril(geteril)-3-me-til(fenil)-5-propil-1N-4,6-digidro-pirrolo-[3,4s]-pirazol-6-onov. Butlerovskie soobshcheniya, 2009, vol. 16, no. 3, pp. 24—29.
3. Gein V.L., Gein L.F., Kylosova I.A. et al. Patent RFno. 2421446. C 07 D 207 38, A 61 K 31 4015. 4-Atsetil-5-(4-bromfenil)-3-gidroksipropil-3-pirrolin-2-on, proyavlya-yushchii nootropnuyu aktivnost'. Zayavka no. 2008119883/04 ot 19.05.2008.
4. Koz'minykh V.O., Igidov N.M., Zykova S.S., Kolla V.E., Shuklina N.S., Odegova T.F. Sintez i farma-kologicheskaya aktivnost' 3-gid-roksi-1,5-diaril-4-pivaloil-2,5-di-gidro-2-pirrolonov. Khim.-farm. zhurn, 2002, vol. 36, no. 4, pp. 23—26.
5. Zykova S.S., Leinikh P.A., Krasilova I.V. Issledo-vanie produktov nukleoffl'nykh reaktsii 1,3,4-trikarbonil'-nykh soedinenii s arilidenarilamina-mi v kachestve per-spektivnykh stimulyatorov rosta. Mezhdunar. zhurn. ekspe-rim. obrazovaniya, 2013, no. 11-1, pp. 187—189.
6. Zykova S.S. Antioksidantnaya i protivovospa-litel'naya aktivnost' 3-gidroksi-1,5-diaril-4-pivaloil-2,5-di-gidro-2-pirrolonov. Meditsina v XXI veke: tendentsii i per-spektivy: Mater. III Vseros. nauch. internet-konf. s mezhdunar. uchast. Servis virtual'nykh konferentsii Pax Grid: IP Sinyaev D.N. 2014. P. 84—88.
7. Zykova S.S., Odegova T.F. Sintez, protivovos-palitel'naya i antioksidantnaya aktivnost' nekotorykh zame-shchennykh 3-gidroksi-1,5-diaril-4-pivaloil-2,5-digidro-2-pirrolonov. Voprosy biologicheskoi, meditsinskoi i far-matsevticheskoi khimii, 2014, vol. 12, no. 7, pp. 4—8.
8. Zykova S.S. Perspektivy primeneniya 3-gid-roksi-1,5-diaril-zameshchennykh 4-pivaloil-2,5-digidro-2-pirrolonov kak antigipoksantov. Sovremennaya meditsina: aktual'nye voprosy. Materialy L mezhdunar. nauch. konf. Novosibirsk, 2015. No. 50. P. 112—117.
9. Zykova S.S., Boichuk S.V. Protivoopukhole-vaya aktivnost' in vitro 3-gidroksi-4-pivaloil-5,6-digidro-2-pirrolonov. XVIII Mezhdunarodnaya nauchnaya konferen-tsiya: «Onkologiya — XXIvek», g. Bryussel', Bel'giya, 2013. P. 75—78.
10. Zykova S.S., Boichuk S.V., Galembikova A.R., Ramazanov B.R. et al. 3-Gidroksi-1,5-diaril-4-pivaloil-2,5-digidro-2-pirrolony narushayut protsessy mitoza i rost opu-kholevykh kletok in vitro. Tsitologiya, 2014, vol. 56, no. 6, pp. 439—442.
11. Galembikova A.R., Zykova S.S., Boichuk S.V. 4-Pivaloil-2-pirrolony vyzyvayut narusheniya mitoza i in-duktsiyu opukholevykh kletok in vivo. XX Vseros. konf. po fundam. onkologii «Petrovskie chteniya — 2014». NII onkologii im. N.N. Petrova. St. Petersburg, 2014. P. 21.
12. №bbi M.E., Semenza G.L. Regulation of cell proliferation by hypoxia-inducible factors. Amer. Journal of Physiology Cell Physiology, 2015, 309 (12), pp. 775—782. DOI: 10.1152/ajpcell. 00279.2015.
13. Sukhanov V.A., Saprin N.A., Piruzyan L.A. Far-makogeneticheskie problemy protivoopukholevoi terapii (obzor). Khim.-farm. zhurnal, 2004, vol. 38, .no7, pp. 3—9.
14. Ying W. Roles of NAD(+), PARP-1 and sirtuins in Cell Death, Ischemic Brain Injury and Synchrotron Radiation X-Ray Induced Tissue Injury. Scientifica (Cairo), 2013, 691251.
15. Boichuk S.V., Galembikova A.R., Zykova S.S., Khusnutdinov R.R. Narusheniya regulyatsii kletochno-go tsikla i reparatsii povrezhdenii DNK v opukhole-vykh kletkakh pod deistviem zameshchennogo etilovogo efira 2-amino-1N-pirrol-3-karbonovoi kisloty. Sovremen-nye problemy nauki i obrazovaniya, 2015, .no 5; URL: http://www.science-education.ru/128-21902 (data obra-shcheniya: 30.06.2016).
16. Boichuk S., Galembikova A., Zykova S., Ramazanov B., Khusnutdinov R., Dunaev P., Khaibullina S., Lom-bardi V. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates are novel potent anticancer agents that affect tubulin polymerization, induce G2/M cell-cycle arrest, and effectively inhibit soft tissue cancer cell growth in vitro. Anti-Cancer Drugs, 27(7), pp. 620—634. DOI: 10.1097/ CAD.0000000000000372.
