CC BY
13A-V.Lobanov1, O.N.Khokhlova1, L.A-Zakharova1, I.Yu.Zarayskaya2, A-N.Murashov1
PATTERN FOR ANALYZING NEUROTOXIC EFFECT ON THE EMBRYONIC DEVELOPMENT BASING ON SOMATOSENSORY MATURATION IN MICE
laboratory of Biological Assays, Branch of M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Institute of Biological Chemistry,
Russian Academy of Sciences, Pushchino 2Division of System Genesis, P.K.Anokhin Research Institute of Normal Physiology, Moscow
To create a pattern of lesion of the embryonic development in mice, a standard substance cytosine arabinoside (Ara-c) was used. Ara-c is an inhibitor of DNA synthesis and produces a strong cytotoxic effect on dividing cells. The substance was administrated in critical periods of the development of cerebral cortex in mice. Consequences of Ara-c administration were investigated on 12.5 and 13.5 prenatal days and on 13.5 and 14.5 prenatal days in relation to the somatosensory development in mice within the postnatal period. Fox battery was used for testing the posterity. The results showed that such a difference in the time of administration of the substance led to different neurotoxic lesions in the posterity which were found out in a number of sensomotor assays. The present pattern allows to perform a refined analysis of neurotoxic effects posed by newly developed pharmacologic preparations on the embryonic development in mice.
УДК 614.715.08
А.А.Масленников, М.М.Тобольская-Поспелова, Э.С.Ермилова
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ЗОМАНА В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЁННЫХ МЕСТ
Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии, Волгоград
Хроническое круглосуточное ингаляционное воздействие зомана в концентрации 1,0-10-6 мг/м3 сопровождается минимальными обратимыми обще -, иммуно — и гонадотоксическими проявлениями.
Предельно допустимая концентрация зомана в атмосферном воздухе населённых мест ообснована на уровне 5,0-10-7 мг/м3.
Ключевые слова: атмосферный воздух, зоман, ингаляционное поступление, хроническая интоксикация.
Введение. Выполнение конвенциальных программ химического разоружения [1] предусматривает обеспечение безопасности персонала объектов уничтожения химического оружия, населения, проживающего вблизи от них, а также исключение негативного воздействия на основные экосистемы. Однако необходимое в этой связи осуществление мониторинга производственной и природной среды возможно только при наличии соответствующих стандартов безопасности.
К настоящему времени для отравляющих веществ, подлежащих ликвидации (в том числе зомана), определены безопасные уровни их содержания в воде, почве, воздухе рабочей зоны, при загрязнении технологического оборудования и трансэпидермальном поступлении. В то же время, для вышеуказанного соединения отсутствует гигиенический норматив его содержания в атмосферном воздухе населенных мест, что и предопределило цель настоящих исследований.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служил образец О-(1,2,2-три-метилпропил)метилфторфосфоната (зомана) с
содержанием основного действующего начала 98%. Характеристика токсических проявлений соединения проведена в соответствии с действующими методическими указаниями [2].
На начальном этапе работы для оценки биологической активности вещества в условиях острых опытов определяли его основные параметры токсикометрии.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) токсиканта была установлена в ходе хронического эксперимента. При выборе уровней хронического поступления ксенобиотика в качестве максимального использовали экспериментально обоснованную величину его ПДК в воздухе рабочей зоны (1,0-10-5 мг/м3) [3]. Кроме того, с целью определения возможной зависимости концентрация-эффект вещество испытывали на уровне 1,0-10-6 мг/м3.
Минимальная величина ингаляционного поступления соединения составляла 5,0-10-7 мг/м3, в пять раз превышающая значение его ориентировочно безопасного уровня воздействия [4].
Всего в исследованиях использовано 412 белых беспородных крыс (198 самцов и 214 самок)
с исходной массой тела 180—220 г. Содержание, питание, уход за животными и их умерщвление осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).
На протяжении 3-х месяцев особи всех групп находились круглосуточно в ингаляционных камерах Курляндского с динамической подачей воздуха. В процессе всего периода поступления вещества осуществляли ежедневный осмотр животных с целью выявления клинических признаков интоксикации. С учётом особенностей токсического влияния зомана, выявленных ранее при разных путях его введения [3, 5], по окончании каждого месяца эксперимента проводили обследование крыс с применением унифицированного набора физиологических, гематологических, биохимических, патоморфологических, гистоэн-зимологических и иммунологических методов.
Кроме того, исследовали возможность развития отдалённых последствий действия вещества на организм лабораторных животных. При этом анализировали мутагенные свойства соединения с применением скрининговых тестер-ных систем, нацеленных на выявление мутаций разных типов (тест Эймса, микроядерная проба, метод доминантных леталей), а также его влияние на репродуктивную функцию обследуемых лабораторных грызунов [6].
Полученные экспериментальные данные подвергали статистической обработке с применением методов, адекватных виду эмпирического распределения изучаемых показателей [7], изменения которых считали достоверными при р < 0,05. Статистическая группа составляла не менее 8 особей.
Результаты и обсуждение. В процессе проведения острых опытов установлено практически идентичное соответствие токсичности тестируемого ксенобиотика его общеизвестным параметрам [8].
При выполнении хронического эксперимента определено, что регламентируемое соединение не вызывало у подопытных животных каких-либо видимых клинических проявлений.
Однако анализ полученных данных позволил установить статистически значимые, в сопоставлении с контролем, отклонения функциональных показателей, носивших явную зависимость концентрация-эффект (табл.).
В частности, поступление токсиканта на уровне 1,0-10-5 мг/м3 вызывало у крыс многочисленные достоверные сдвиги (25 отклонений в сравнении с контролем).
При этом, к наиболее патогенетически значимым нарушениям можно отнести снижение
суммационно-порогового показателя (СПП) после 1 и 3-х месяцев воздействия с последующим его повышением в восстановительном периоде (восст. пер.), достоверное изменение двигательной активности, содержания эритроцитов, а также относительной массы ряда внутренних органов (табл.).
При определении биохимических показателей крови у подопытных особей рассматриваемой группы выявлены отклонения, сходные с таковыми при других путях поступления ксенобиотика [3, 5].
Подтверждением вредного действия соединения в рассматриваемой концентрации, наряду с широтой негативных проявлений, является и их глубина, в частности, выход ряда показателей (5 значений) за пределы бисигмальных отклонений параллельного контроля.
Помимо этого установлено, что отдельные нарушения зачастую воспроизводились из месяца в месяц, включая восстановительный период, что свидетельствует о стойкости обнаруженной патологии.
Обширность отмеченных сдвигов, их характер и особенности динамики позволяют считать выявленный комплекс изменений патогенетически значимым, а концентрацию вещества 1,0-10-5 мг/м3 — действующей по общетоксическому эффекту
Хроническая ингаляция токсиканта на уровне 1,0-10-6 мг/м3 также приводила к ряду функциональных изменений у подопытных особей, проявившихся, однако, в несколько меньшей степени (17 показателей). При этом токсическое влияние ксенобиотика обнаруживалось на всех уровнях организации организма: от системного до молекулярного (табл.). Однако данные отклонения не сохранялись более 1 месяца, не воспроизводились по завершении периода восстановления, носили «мозаичный» характер. Кроме того, в процессе оценки состояния животных данной группы не выявлено изменений, выходивших за пределы двух сигм контрольных значений. Учитывая изложенное, концентрацию зомана 1,0-10-6 мг/м3 следует признать в качестве пороговой по хроническому общетоксическому действию.
В то же время, воздействие зомана в концентрации 5,0-10-7 мг/м3 не вызывало каких-либо нарушений в состоянии крыс на протяжении всего эксперимента, что характеризует данную величину зомана как недействующую. На основании установленных параметров токсикометрии вещество отнесено к 1-му классу опасности [9].
В процессе проведения иммунологических исследований определено, что зоман в условиях
Таблица
Достоверные изменения, обнаруженные в процессе хронического воздействия зомана
Показатель, единицы измерений Срок наблюдения Концентрации зомана, мг/м3
1,0-10-5 1,010-6 5,010-7 Контроль
Физиологические исследования
СПП, вольты 1 месяц 3 месяца восст. пер. 2,45+0,09 2,60+0,11 2,89+0,11** - - 3,08+0,12 3,10+0,15 2,14+0,08
Горизонтальная активность, усл. ед. 3 месяца восст. пер. 21,10+1,73 18,11+0,89 - - 15,22+1,38 20,40+1,65
Вертикальная активность, усл. ед. 1 месяц 11,90+1,66 9,90+1,12 - 6,80+0,76
Суммарная активность, усл. ед. 1 месяц восст. пер. 30,11+0,87 38,51+2,03 - 29,00+2,73 34,91+1,90
Гематологические исследования
Эритроциты, 1012/л 1 месяц 5,47+0,06 5,26+0,10 - 5,71+0,07
Гемоглобин, г/л 2 месяца 3 месяца - 112,94+2,97 127,38+1,67 - 126,60+4,59 119,24+2,65
Биохимические исследования
АХЭ эритроцитов, ммоль/(ч-л) 1 месяц 25,92+3,48 - - 36,77+0,84
НЭ, мкмоль/(мин-мл) 1 месяц восст. пер. 4,54+0,25** 4,89+0,37 - - 7,49+0,39 5,73+0,34
Мочевина, ммоль/л 3 месяца 4,543+0,310** 4,704+0,188 - 5,763+0,243
ПВК, мкмоль/л 3 месяца 93,30+6,83 93,60+2,08 - 73,83+4,16
Креатинин, мкмоль/л 2 месяца 3 месяца 82,06+1,29 82,31+1,33 - - 77,20+1,03 75,27+1,96
АСТ, мкмоль/(мин-л) 1 месяц 18,54+0,60 19,62+0,36 - 21,00+0,48
Глюкоза, ммоль/л 1 месяц 3 месяца 3,929+0,096** 5,006+0,107 4,974+0,114 - 5,361+0,093 5,613+0,128
Относительная масса внутренних органов
Сердце, г/кг Печень, г/кг Селезенка, г/кг Надпочечники, г/кг 1 месяц 2 месяца 3 месяца 3 месяца 1 месяц 3,68+0,10** 27,34+0,73 2,65+0,22 0,145+0,004 3,58+0,10 41,21+2,15 29,65+0,92 0,140+0,006 - 3,22+0,08 33,71+2,11 32,08+ 0,77 3,81+0,25 0,121+0,005
Иммунологические исследования
Реакция агглютинации (РПГА — О — антиген, ^ Т) Иммуноглобулины, усл. ед. Бактерицидность,% 2 месяца 3 месяца 1 месяц 3 месяца 2,93+0,04 2,50+0,01 15,52+1,92 3,00+0,13 2,41+0,06 66,12+2,20 - 3,31+0,03 2,76+0,08 22,67+2,43 81,22+3,89
Гистохимические исследования
Гликоген печени, (балл) 1 месяц 2,62 - - 4,70
Количество достоверных изменений 25 17 0
Отклонения, превышающие 2с контроля 5 0 0
Примечание: АХЭ — ацетилхолинэстераза, НЭ — неспецифические эстеразы, ПВК — пировиноградная кислота, АСТ — аспарагиновая трансаминаза, РПГА — реакция пассивной гемагглютинации, ** — достоверные сдвиги, превышающие 2 сигмы контроля
хронического круглосуточного ингаляционного поступления оказывал негативное влияние на состояние иммунного статуса подопытных особей.
Оценка полученных результатов позволила принять уровень зомана 1,0-10-6 мг/м3 в качестве порогового по иммунотоксическому эффекту
При изучении мутагенных свойств установлено, что в тесте Эймса вещество проявило генетическую активность средней степени.
Способность зомана влиять на частоту поли-хроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозгу лабораторных животных оценивали при его однократной ингаляции в субле-
тальных концентрациях на уровне 1/10 и 1/100 СТ
50*
Анализ представленных данных показал, что у самцов опытных групп отмечено увеличение численности ретикулоцитов с экстрануклеар-ными включениями, что свидетельствует о мутагенном действии химагента на соматические клетки.
При постановке метода доминантных лета-лей влияние зомана на генетические структуры гамет оценивали в рамках единого хронического эксперимента по изучению его обще — и гонадо-токсических свойств на одних и тех же крысах.
В процессе выполнения исследований установлено следующее. Показатели гибели плодов, находящихся на стадиях развития как до, так и после имплантации, не имели статистически значимых межгрупповых различий. Соответственно не выявлено значимых отклонений и при определении общей смертности эмбрионов, что свидетельствует об отсутствии у тестируемого соединения способности проявлять мутагенную активность в половых клетках самцов крыс.
Исследование репродуктивной функции самцов животных показало, что зоман на уровнях 1,0-10-5 и 1,0-10-6 мг/м3 оказывал гонадотоксиче-ское действие, имеющее прямолинейную зависимость концентрация — эффект.
В частности, при анализе спермограммы подопытных особей, проведённом по окончании периода ингаляции, установлено, что поступление вещества в наибольшей концентрации сопровождалось выраженным изменением ряда показателей не только достоверно отличавшихся от соответствующих значений в контроле, но и выходивших за пределы их бисигмальных отклонений.
О выраженности токсического эффекта при воздействии соединения на репродуктивную функцию крыс рассматриваемой группы свидетельствует и тот факт, что по завершении восстановительного периода один из значимых показателей, характеризующих функциональную активность гамет — осмотическая резистентность, по-прежнему, имел статистически значимые отличия от параллельного контроля.
Кроме того, только у самцов данной группы обнаружено изменение состояния сперматогенеза, реализованное в существенном уменьшении численности канальцев, проходивших дву-стадийный митотический цикл.
С учётом глубины и стойкости выявленных нарушений концентрация зомана 1,0-10-5 мг/м3 охарактеризована как явно действующая по го-надотоксическому эффекту.
Наряду с отмеченным, хроническое поступление зомана в организм подопытных крыс в
концентрации 1,0-10-6 мг/м3 вызывало менее выраженные, хотя и однонаправленные изменения отдельных показателей, характеризующих состояние репродуктивной функции животных. Однако выявленные отклонения не выходили за пределы двух сигм аналогичных контрольных значений и полностью нивелировались по окончании экспозиции.
Хроническая ингаляция тестируемого хемо-токсиканта на уровне 5,0-10-7 мг/м3 не сопровождалась видимыми нарушениями оцениваемой функции самцов.
С учётом изложенного, концентрация зома-на 1,0-10-6 мг/м3 принята в качестве пороговой, а 5,0-10-7мг/м3 — недействующей по гонадотокси-ческому эффекту.
Исследования состояния репродуктивной функции беременных и небеременных самок показали, что соединение в указанных выше уровнях не проявляло гонадо-, эмбриотоксической и тератогенной активности.
Выводы. 1. Зоман при ингаляционном пути поступления в организм лабораторных животных отнесен по параметрам токсикометрии к веществам 1-го класса опасности.
2. При скрининговом тестировании на мутагенность исследуемое вещество проявляет генетическую активность, зафиксированную в тесте Эймса и микроядерной пробе.
3. В условиях хронического круглосуточного ингаляционного воздействия зомана патогенетически значимыми являются обще-, гонадо- и иммунотоксические эффекты.
4. В качестве предельно допустимой концентрации зомана в атмосферном воздухе населённых мест обоснована величина 5,0-10-7 мг/м3.
Список литературы
1. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении (исправленный вариант 8 августа 1994 г.). — РТ8 РС ОРСШ, 1994. — 191 с.
2. Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест. — М., 1988. — 109 с. Утверждены заместителем Главного государственного санитарного врача СССР А.И.Зайченко от 15.07.1988. Рег. № 4681—88.
3. Калинина Н.И., Преображенская Э.Л., Михайлов Г.М. и др. Экспериментальное обоснование предельно допустимых концентраций зарина и зомана в воздухе рабочей зоны: Заключительный отчет о НИР — инв. № 54. — Волгоград: НИИГТП, 1987. — 100 с.
4. ГН 2.1.6.1372-03. Гигиенические нормативы ориентировочных безопасных уровней воздей-
ствия загрязняющих (ОБУВ) веществ в атмосферном воздухе населенных мест и зонах защитных мероприятий объектов хранения и уничтожения химического оружия // Росс. газета № 116 от 18.06.2003. — С. 15.
5. Кирюхин В.Г., Точилкина Л.П., Ходыкина Н.В. и др. Экспериментальное обоснование предельно допустимого уровня загрязнения кожи зо-маном: Заключительный отчет о НИР инв. № 586. — Волгоград: НИИГТП, 2003. — 103 с.
6. Унифицированные методические рекомендации комплексного изучения отдаленных последствий действия на организм химических веществ при их гигиеническом регламентировании / Под ред.
проф. Н.Н.Литвинова. — М.: Ин-т биофизики МЗ СССР, 1981. — 164 с.
7. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В. и др. Биометрия: Учебное пособие. — Л.: Изд. ЛГУ, 1982. — 264 с.
8. Справочник № 3(86)-4 по свойствам веществ Списка 1 Конвенции по запрещению химического оружия. — М, 1999. — С. 12-15.
9. ГОСТ 12.1.007. ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. — М.: Межгосударственный комитет по стандартам, 1982. — 5 с.
Материал поступил в редакцию 27.06.07.
A.A.Maslennikov, M.M.Tobolskaya-Pospelova, E.S.Yermilova
EXPERIMENTAL SUBSTANTIATION OF MAXIMUM ALLOWABLE CONCENTRATION OF SOMAN IN
ATMOSPHERIC AIR OF RESIDENTIAL SETTINGS
Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology, Volgograd
Chronic 24-hour inhalation exposure to soman in a concentration of 1.010-6 mg/m3 is accompanied by minimal reversible general, immune and gonadotoxic manifestations. Maximum allowable concentration of soman in atmospheric air of residential settings is set at the level of 5.0-10-7 mg/m3.
УДК 616.33-002.44-07:616.36-091.8
М.А.Шахназаров, А.М.Шахназаров, М.Т.Расулов
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ АЦЕТАТНОЙ ЯЗВЕ ЖЕЛУДКА И ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
ПЕСТИЦИДА - ХЛОРОФОСА
Дагестанская государственная медицинская академия, кафедра патологической анатомии, Махачкала
Длительное пероральное поступление хлорофоса в дозе 1 ПДК (0,05 мг/л) при наличии язвы желудка активизирует компенсаторно-приспособительные метаболические процессы в гепатоцитах и в синусоидальных ретику-лоэндотелиоцитах. Доза пестицида 10 ПДК угнетает окислительно-восстановительные ферменты митохондрий, микросом, активирует гликолиз, снижает синтез РНК. Увеличение дозы поступающего перорально хлорофоса от 50 до 100 ПДК задерживает заживление язвы желудка у 80—90 % животных, обуславливает угнетение всех дегидро-геназ (до 50 %), кислую фосфатазу и моноаминооксидазу в гепатоцитах и щелочную фосфатазу во внутридолько-вой билиарной системе.
Ключевые слова: печень, хлорофос, язва желудка, пенетрация.
Введение. По данным ВОЗ (1990) значительную долю токсических экологических факторов составляют пестициды. Остаточные количества высокотоксичных запрещенных пестицидов продолжают обнаруживать в продуктах питания [5, 8]. Политропное токсическое действие пестицидов способствует возникновению или обострению у рабочих, контактирующих с пестицида-
ми, патологии гепато-билиарной системы и желудка [1, 2, 6, 7]. Дисфункция органов пищеварения обнаружена также у 90,8 % детей и у 76,3% жителей районов, где использовали пестициды в сельском хозяйстве [3, 4]. Несмотря на имеющиеся многочисленные исследования, посвященные токсикологии пестицидов, представляет научно-практический интерес изучение осо-
