CC BY
53
УДК: 615.361.38.013.014.413:616.379-008.64
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦІЇ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ КУЛЬТУР МІКРОФРАГМЕНТІВ ОСТРІВЦЕВОЇ ТКАНИНИ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ПРИ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ
О.М. Побеленський
Дорожна клінічна лікарня станції Харків Південної залізниці РЕЗЮМЕ
У роботі було проведено експериментальне дослідження впливу трансплантації під капсулу нирки кріоконсервованих мікрофрагментів підшлункової залози новонароджених поросят на рівень глікемії та показники перекисного окислення ліпідів у щурів з алоксановим діабетом.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: цукровий діабет, перекисне окислення ліпідів, мікрофрагменти підшлункової залози, глікемія
Постановка проблеми у загальному вигляді. Лікування цукрового діабету і його ускладнень залишається однією з найбільш актуальних проблем сучасної медицини. Доцільність застосування методу трансплантації острівцевої тканини підшлункової залози (ОТПЗ) вже має експериментальні і клінічні підтвердження в Україні і за кордоном. Для успішної трансплантації може бути використаний матеріал підшлункової залози (ізольовані р-клітини, острівці, мікрофрагменти тканини) плодів людини і тварин або новонароджених тварин - свиней, кроликів, великої рогатої худоби [4, 6, 7, 8]. При цьому важливі функціональна повноцінність матеріалу, що трансплантується, і створення умов для достатньо тривалого функціонування його в організмі реципієнта, а також наявність запасів матеріалу для клінічних цілей.
Зв'язок проблеми із важливими науковими та практичними завданнями. Робота виконана в межах комплексної науково-дослідної роботи кафедри хірургічних хвороб Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна “Експериментальний цукровий діабет і його хірургічна корекція”.
Аналіз останніх досліджень і публікацій. Істотним є обґрунтований вибір місця введення трансплантаційного матеріалу в організм реципієнта, техніка проведення операції [9]. Для оптимізації умов підготовки тканинного матеріалу до трансплантації, пом'якшення можливого імунного конфлікту після операції використовуються різні підходи, серед яких культивування і кокультивування р-клітин з іншими видами клітин, обробка антиоксидантами, інкапсуляція, кріоконсер-вування і т.д. [5].
Визначення невирішених раніше частин загальної проблеми. Нами не знайдено робіт, присвячених дослідженню перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) у щурів з алоксановим
діабетом. При цьому найпереконливішими є дані ефективності операції in vivo.
Метою даного дослідження було вивчення впливу імплантації під капсулу нирки кріоконсервованих мікрофрагментів підшлункової залози (МФПЗ) новонароджених поросят на рівень глікемії і показники ПОЛ у щурів з алоксановим діабетом.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У роботі було використано 60 статевозрілих щурів-самців лінії Вістар масою 180-210 г, з них 10 тварин були контрольними. Алок-сан-моногідрат (ICN Biomedical Inc.) вводили під шкіру одноразово в дозі 130 мг/кг ма -си тварини після попереднього 24-годинного голодування при вільному доступі до води [14]. Рівень летальності складав 45%. Щури (36 тварин), у яких на 7-у добу розвинулася стійка гіперглікемія (не менш 12 ммоль/л), були розділені на дві групи. Перша група лікування не отримувала. Тваринам другої групи на 7-му добу під капсулу нирки були одноразово імплантовані МФПЗ новонароджених поросят в дозі 0,5 г на тварину (інсу-лін-продукція дози - не менш 600 мкЕ/добу). Технологія виготовлення препарату МФЗП новонароджених поросят для імплантації [5] включає, серед інших, етапи культивування нативної тканини та кріоконсервування, які сприяють зменшенню антигенності тканини.
Ступінь глікемії і інтенсивності ПОЛ в сироватці крові та печінці визначали на 7, 15 і 30 добу після початку введення препаратів. Кров брали з хвостової вени, а декапітували тварин під легким ефірним наркозом. Рівень глюкози визначали натще в сироватці крові хромооксигеназним методом.
Рівень ПОЛ визначали за початковим рівнем продуктів, що реагують з тіобарбітуро-вою кислотою (ТБКАП) в сиров атці крові, за початковим, спонтанним, 5^10"3 М Fe +- і ас-корбатіндукованим рівнем ТБКАП в гомоге-
наті печінки спектрофотометричним методом (на спектрофотометрі СФ-46) [1]. Інтенсивність вільнорадикального окислення ліпідів сироватки крові і гомогената печінки визначали також за величиною хемілюмінесценції (ХЛ) з допомогою хемілюмінометра, в режимі рахування фотонів. До ячейки хемі-люмінометра, що містила 1 мл фізіологічного розчину і 100 мкл сироватки крові або гомогенату печінки, додавали 100 мкл розчину двовалентного заліза в кінцевій концентрації 5^10"2 М. Реєстрували інтенсивність світіння (світлосуму) протягом 1 хв, результат виражали в умовних одиницях і у вигляді нормованих значень, а саме як відношення експериментального значення до контрольного [1].
Для визначення стійкості тканини до пе-рекисного окислення в ячейку хемілюміно-метра, крім 1 мл фізіологічного розчину, 100 мкл гомогената тканини, додавали 100 мкл 5% розчину перекису водню і протягом 1 хв реєстрували інтенсивність світіння, яку визначали в умовних одиницях.
У роботі використовувались реактиви марки ХЧ і ЧДА. Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Протягом місяця після введення кріокон-сервованої ОТПЗ тваринам з алоксановим діабетом відзначили низьку смертність (близько 5%) у групі оперованих тварин у порівнянні з групою неоперованих щурів (30%).
У тварин з ЦД, які не отримували препарату МФПЗ, рівень глюкози в сироватці крові натще на 7-у добу перевищував норму в 2,2 рази, а на 15-у добу в 3,6 рази. На 30-у добу спостереження рівень глюкози в крові дещо зменшувався, але залишався значно вищим норми (табл.1). У тварин, яким були
введені МФПЗ, цей показник залишався незмінним до 15-ї доби і зменшувався на 30-у.
Як відомо, підвищений рівень глюкози в крові при ЦД пов’язаний, в першу чергу, з порушенням надходження глюкози в клітини, а це призводить до збою звичайних механізмів енергозабезпечення. При цьому в метаболізм більш активно включаються жирні кислоти. Недоокислені ненасичені жирні кислоти можуть бути джерелом вільних радикалів, які призводять до розвитку ланцюгової реакції ПОЛ, а іони Ге , які знаходяться в клітині, викликають розгалуження цих ланцюгів [3]. У результаті ЦД супроводжується активацією перекисних процесів і накопиченням в тканинах і крові ТБКАП.
У випадку, коли ЦД не лікувався, максимальна концентрація ТБКАП в сироватці крові спостерігалась на 15-у добу експерименту з деяким зниженням на 30-у (табл. 1). Максимум концентрації на 15-у добу відмічено і при лікуванні тварин з допомогою МФПЗ, але при цьому концентрація ТБКАП на 30-у добу достовірно менша, ніж у тварин, що не отримували лікування. Тут слід зауважити, що підвищений вміст ТБКАП і динаміка його змін у сироватці крові щурів з алоксановим діабетом, незалежно від введення МФПЗ, можуть пояснюватися особливостями самої експериментальної моделі. Припускається, що механізм дії алоксана пов'язаний з порушенням мембранного апарату клітин через активацію вільнорадика-льних процесів. Відомо, що алоксан не має строгої специфічності до р-клітин інсуляр-ного апарату. Токсичні зміни, що не пов'язані з порушеннями в панкреатичних |3-кліти-нах і розвитком діабету, спостерігаються і в інших органах. Можливо, через місяць після введення алоксана починає також проявлятися дія деяких компенсаторних механізмів організму антиоксидантної спрямованості.
Таблиця 1
Рівень глюкози та концентрація ТБКАП в сироватці крові щурів з ЦД
Показник Умови експерименту Термін спостереження, доби
7 15 30
Рівень глюкози (в % від контролю) ЦД 223 360 290
ЦД+МФПЗ 218 215 160
Концентрація ТБКАП (нмоль/мл) Контроль 3,1 ± 0,2 3,2 ± 0,3 3,4 ± 0,2
ЦД 5,6 ± 0,4 7,8 ± 0,5 6,1 ± 0,4
ЦД+МФПЗ 5,4 ± 0,4 7,0 ± 0,5 4,4 ± 0,2’2
Примітки: 1 - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з контролем, р>0,05; 2 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з ЦД, р<0,05.
Якщо рівень ТБКАП дає інформацію про кількість кінцевих продуктів ПОЛ, то інтенсивність ХЛ, індукованої Ге2+, пропорційна кількості вільних радикалів в біологічному об’ єкті і, таким чином, дає інформацію про початковий етап активації процесів ПОЛ. ХЛ, індукована Н2О2, дозволяє оцінити стій-
кість біологічного об’єкту до перекисного окислення, яка залежить від багатьох факторів, але в першу чергу від потужності антиоксидантних систем, що знешкоджують перекиси [1].
Як видно з табл. 2, показники ХЛ сироватки крові, як індукованої Ре2+, так і Н202,
змінюються в значно більшій мірі, ніж рівень ТБКАП, і у щурів з ЦД на 15-30-у добу перевищують контрольні значення більше ніж в 3-4 рази. На 15-у добу обидва показни-
ки при всіх способах лікування нижчі, ніж у тварин, що не отримували лікування, але до норми повертається тільки один показник.
Таблиця 2
Інтенсивність хемілюмінесценції (умовн.од.) сироватки крові щурів
Умови експерименту Індуктор ХЛ Термін спостереження, доби
7 15 30
Контроль Fe2+ 11S і 11 127 і 10 109 і 9
Н2О2 572 і 49 533 і 57 595 і 51
ЦД Fe2+ 321 і 27 411 і 35 375 і 39
Н2О2 2215 і 213 2399 і 227 2423 і 251
ЦД+МФПЗ Fe2+ 335 і 23 371 і 29 229 і212
Н2О2 2275 і 205 223Sі 194 1479 і 1182
Н2О2 240S і 213 1S75 і 1752’3 653 і 611’2’3
Примітки: 1 - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з контролем, р >0,05;
2 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з ЦД, р < 0,05;
3 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з ЦД+МФПЗ, р <0,05.
Однією з причин високого рівня як початкових, так і кінцевих продуктів ПОЛ в плазмі крові можуть бути виснаження і порушення в роботі антиоксидантних систем. Так було показано, що при експериментальному ЦД спостерігається значне зниження активності каталази та супероксидісмутази еритроцитів. До того ж деякі антиоксидантні системи, наприклад 8И-глутатіонпероксидаза, є енергозалежними. А при ЦД в першу чергу порушується забезпечення клітин і тканин енергією, до того ж на тлі активації процесів ПОЛ. Таким чином, виникає позитивний зворотній зв’язок, який виражається в тому, що порушення в механізмі утилізації глюкози призводить до інтенсифікації ПОЛ, що, в свою чергу, збільшує порушення в механізмах метаболізму. Ці порушення проявляються не тільки в нераціональному витрачанні неетерифікованих жирних кислот. При патологічних рівнях ПОЛ змінюється спектр не-насичених ліпідів в мембранах клітин, зменшується в’ язкість мембран, а це призводить до зміни фізико-хімічних характеристик мік-рооточення ферментів, які вбудовані в мем-
Рівень накопичення ТБКАП в гомогенаті
брану, і до зменшення їх активності. Крім того, можливе безпосереднє пошкодження молекул білка, в тому числі ферментів, а та -кож антиоксидантів ліпідними радикалами [3]. Таким чином, зменшення інтенсивності ПОЛ при ЦД є актуальною задачею, і, як видно з представлених результатів, використані препарати сприяють нормалізації рівня ПОЛ в крові.
При цій патології підвищений рівень ПОЛ характерний не тільки для сироватки крові, але і для других тканин і органів, зокрема для печінки (табл. 3). У тому випадку, коли ЦД не лікували, початковий, спонтанний та Ре2+ -індукований рівень ТБКАП в гомогенаті печінки під час всього періоду спостереження перевищує контрольний рівень в 1,4-1,6 рази. Аскорбат-індукований рівень на 7-у добу перевищує контроль в 2,2 рази, а на 30-у добу дещо зменшується і перевищує контроль в 1,9 рази. Введення препарату призводить до достовірного зниження на 30-ту добу спостереження показників ПОЛ відносно нелікованих тварин.
Таблиця 3
печінки щурів з ЦД і при уведенні МФПЗ
Рівень ТБКАП, нмоль/мг тканини Термін спостереження, доби Умови експерименту
Контроль ЦД ЦД+МФПЗ
Початковий 7 3,9 і 0,3 5,4 і 0,4 5,1 і 0,3
30 3,8 і 0,2 5,2 і 0,3 4,8 і 0,З03
Спонтанний 7 4,7 і 0,3 6,7 і 0,5 6,7 і 0,4
30 4,4 і 0,2 6,5 і 0,4 5,1 і 0,31АЗ
F e2+-iндyко-ваний 7 5,4 і 0,4 8,7 і 0,7 8,8 і 0,5
30 5,8 і 0,5 8,1 і 0,4 7,3 і 0,5
Аскорбат- індукований 7 9,2 і 0,6 20,1 і 1,8 20,7 і 1,1
30 9,4 і 0,7 18,4 і 1,1 14,9 і 0,92’3
Примітки: 1 - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з контролем, р >0,05;
2 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з 7-ю добою, р < 0,05;
3 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з тим же строком ЦД, р < 0,05.
Характер різних моментів процесу ПОЛ в печінці, досліджених методом ХЛ (табл. 4), вказує на те, що при ЦД активується утворення вільних радикалів в тканині органа (ХЛ, стимульована Ре2+), зменшується стій-
кість до перекисного окислення (ХЛ, стимульована Н202). Спостерігається також значне збільшення світлосуми ХЛ після попередньої інкубації гомогенату з Ре2+ та аскорба-том (неферментативнв активація процесів
ПОЛ) - в 6,6 та 4,1 рази відповідно. Таким печінки. МФПЗ в більшій або меншій мірі чином, при даній патології страждають всі сприяють зменшенню всіх показників, що вивчені ланки антиоксидантного захисту та характеризують початкові етапи ПОЛ. механізмів регуляції рівня ПОЛ в тканині
Таблиця 4
Світлосума ХЛ (умовні одинииці та нормативні значення) гомогенату печінки щурів з ЦД та при різних способах його лікування
Умови експерименту Термін спостереження, діб Індуктор ХЛ
Fe2+ Н2О2 2+ Fe після 15 хв інкубації з Fe2+ Fe2+ після 15 хв інкубації з аскор-батом
Контроль 7 2491 і 218 241045 і 21413 13427 і1412 5229 і 427
30 2783 і 231 225189 і 20837 10132 і 927 5899 і 422
ЦД 7 35419 і 3219 983237 і 95817 88273 і 7921 21239 і 2433
норм. знач. 14,2 4,1 6,6 4,1
30 21150 і 2035 672281 і 29486 67236 і 5129 17187 і 1429
норм. знач. 7,6 2,3 6,6 2,9
ЦД+МФПЗ 7 33891і3020 968813 і 81241 86179 і 7353 22075 і 1890
норм. знач. 13,6 4,0 6,4 4,2
30 10175 і9732 413127 і372132 25921 і 21172 12139 і 10942
норм. знач. 3,7 1,8 2,6 2,1
Примітки: 1 - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з контролем, р>0,05; 2 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з ЦД, р< 0,05.
Наведені дані дозволяють зробити висновок, що трансплантація мікрофрагментів підшлункової залози новонароджених поросят щурам з алоксановим діабетом сприяє зменшенню рівня глюкози в крові протягом вже першого місяця після операції, а також зменшують рівень ПОЛ в сироватці крові та пе-
ЛІТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
чінці.
Перспективи подальших розвідок у даному напрямку. Подальша розробка в даній області хірургії полягає у використовуванні лапароскопічної трансплантації острівцевих клітин підшлункової залози у хворих на ЦД.
Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. // Метод. реком.-СПб.:ИКФ Фолиант. 2000. 104 с. Демин Ю.А. // Проблемы криобиологии. 2000. № 2. С. 94-101.
Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения.-СПб.1999. 12 с. Ковальська I. О. // Трансплантолопя. 2000. Т. 1. № 1. С. 140-142.
Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., и др..// Проблемы криобиологии. 2000. № 2. С. 76-80.
Турчин 1.С. // Ендокрионолопя. 1996. Т. 1. № 2. С. 6-13.
Federlin K., Pozza G. // J. Mol. Med. 1999. Vol.77. № 1. P. 148-152.
Fiorina P., Folli F., Bertuzzi F. е! al. // Diabetes Care. 2003 . Vol. 26. № 4. P. 1129-1136.
Movahedi B., Keymeulen B., Lauwers M.H. et al. // Transpl. Int. 2003. Vol. 16. № 3. P. 186-190.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КУЛЬТУР МИКРОФРАГМЕНТОВ ОСТРОВКОВОЙ ТКАНИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ
О.Н. Побеленский
Дорожная клиническая больница станции Харьков Южной железной дороги РЕЗЮМЕ
В работе проведены экспериментальные исследования влияния трансплантации под капсулу почки криоконсервированных микрофрагментов поджелудочной железы новорожденных поросят на уровень гликемии и показатели перекисного окисления липидов у крыс с аллоксановым диабетом
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сахарный диабет, перекисное окисление липидов, микрофрагменты поджелудочной железы, гликемия
EXPERIMENTAL SUBSTANTIATION FOR XENOTRANSPLANTATION EFFICIENCY OF CRYOPRESERVED CULTURES OF THE PANCREAS ISLET TISSUE MICROFRAGMENTS AT DIABETES MELLITUS
O.N. Pobelensky
Railway Clinical Hospital st. Kharkov South Railway SUMMARY
Experimental investigations of transplantation effect under the capsule of kidney of the newborn piglet’s pancreas cryopreserved microfragments on glycemia level and the indices of lipid peroxidation in rats with alloxan diabetes were carried-out in the work.
KEY WORDS: diabetes mellitus, lipid peroxidation, microfragments of pancreas, glycemia
