CC BY
42
УДК 617.735-007
Темнов А.А.1, Белый Ю.А. 2, Миргородская С.А. 3, Семенов А.Д. 3, Ревищин А.В. 4, Павлова Г.В. 4, Куст Н.Н. 4
Жаучно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента
здравоохранения города Москвы, Москва 2Калужский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова
Минздрава России
3МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Министерства здравоохранения
Российской Федерации, Москва 4Институт Биологии гена Российской Академии Наук, Москва
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛОКАЛЬНОГО СУБРЕТИНАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ КСЕНОГЕННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, МЕЧЕННЫХ МАГНИТНЫМИ ЧАСТИЦАМИ
Разработана методика локального субретинального введения ксеногенных стволовых клеток, меченных магнитными частицами, и экспериментально обоснована ее эффективность. Опытная группа: к склере подшивали комплекс полимерного эластичного магнитного имплантата (ПЭМИ) с лазерным зондом, производили срединную витрэктомию и вводили под сетчатку линию стволовых клеток, меченную магнитными частицами. В группе контроля ПЭМИ не фиксировали. По данным морфологического исследования доказано, что в опытной группе клетки располагаются в субретинальном пространстве в сроки до 14 суток, а в группе контроля только до 3 суток. Разработанный хирургический способ дает возможность контролировать введение клеток в субретинальное пространство.
Ключевые слова: стволовые клетки, магнитные частицы, субретинальное введение.
Актаульность
Методы клеточной трансплантации в настоящее время открывают широкие возможности возмещения отсутствующих клонов специализированных клеток в поврежденных органах и тканях. Стволовые клетки также способствуют активизации в сохранившихся клетках поврежденного органа собственного резерва регенерации и пролиферации [4], [9].
В экспериментальной офтальмологии, в работах по трансплантации эмбриональных частей сетчатки в сетчатку взрослого млекопитающего было показано, что имплантированная ткань интегрируется с сетчаткой реципиента, и даже могут устанавливаться морфологические контакты с первичными зрительными центрами [8]. Также проводились исследования возможности встраивания стволовых клеток в слои сетчатки и дифференцировки их в фоторецепторы [17], [18]. Было показано, что стволовые клетки, введенные интравитреаль-но, если не погибают в течение нескольких суток после трансплантации, то мигрируют, встраиваются в слои сетчатки и формируют многочисленные отростки, идентичные нормальным аксонам, а в отдельных случаях аксоны введенных клеток прорастают в зрительный нерв и остаются жизнеспособными сроком до 30 дней [10], [20].
Применение стволовых клеток из мезенхи-мальной ткани является перспективным за счет возможности получения материала от самого реципиента. В ряде работ было показано, что мезенхимальные стволовые клетки эффективны в лечении повреждений роговицы [12], [14], [16], способствуют повышению выживаемости ганглиозных клеток при глаукоме [11]. Отмечается способность стволовых клеток ингиби-ровать апоптоз клеток сетчатки, уменьшать воспаление, вызванное лазерным воздействием, и ограничивать зону распространения лазерного повреждения [13].
В исследованиях по влиянию стволовых клеток на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений в сетчатке у крыс линии Campbell [6] при токсическом поражении зрительного нерва [3], при лечении частичной атрофии зрительного нерва [5] было показано, что стволовые клетки оказывают выраженное стабилизирующее влияние на процессы дегенерации и на органические изменения: происходило краткосрочное улучшение функций сетчатки, подтвержденное методами ЭРГ. Однако все авторы указывают на кратковременность эффекта в связи с трудностями фиксации клеток в месте введения и их миграцией в другие отделы глаза.
Предложены различные способы введения стволовых клеток при патологии сетчатки и зрительного нерва: внутривенное, субконъюнкти-вальное, субтеноновое, парабульбарное, интра-витреальное, супрахориоидальное, введение в канал, образованный после радиальной оптической нейротомии. Преимущественным является метод субретинального введения в связи с возможностью максимального приближения к месту повреждения. Но, к сожалению, субретинальный способ введения клеток является достаточно травматичным и также не исключает миграции клеток.
В настоящее время популярным направлением становится использование магнитных технологий с целью фиксации стволовых клеток в месте их введения. Впервые с этой целью стволовые клетки с магнитными наночастицами были использованы для доставки стволовых клеток к области печени. Для этого крысам в области печени размещали внешний магнит, который «притягивал» введенные внутривенно клетки, где они в итоге и депонировались [7], [19]. Также стволовые клетки с введенными в них магнитными наночастицами применяли для доставки к месту повреждения сосудов и сердца [15].
До настоящего времени магнитные технологии для фиксации клеточного материала в офтальмологии не использовали.
Цель
Разработать методику локального субрети-нального введения ксеногенных стволовых клеток, меченных магнитными частицами, и экспериментально обосновать ее эффективность.
Материал и методы
В работе использовалась линия стволовых клеток НЕК-293 GFP (human embryonic kidneys), полученная из клеток почки эмбриона человека, выращенная в культуре ткани, и трансфецированная GFP плазмидой.
Для культивирования НЕК-293 применялась среда DMEM (ПанЭко, Россия) при добавлении 10% фетальной сыворотки крови (Perbio HyClone, США), L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 4% гентамицина (ПанЭко, Россия). Культура клеток инкубировалась при 370С в СО2 инкубаторе. Клетки росли на площади 25 см2 во флаконах («Costar»). По мере нарастания культуры клеток почек эмбриона человека НЕК-293 до концентрации 1,5х105 клеток мл-1 клетки подверга-
лись трансфекции полученными конструкциями: EGFP-N1 («Clontech»). Трансфекция осуществлялась с помощью реагента ExGene 500 (Fermentas, R0511) согласно протоколу. Селекция клонов, несущих встроенную конструкцию, проводилась с помощью реагента гиницитина (G418, Invitrogen # 15750045) в течение десяти дней. После селекции с использованием антибиотика клоны, устойчивые к G418, были использованы для анализа с помощью микроскопа (Olympus). Все колонии были GFP позитивные. Клетки были рассеяны на чашки Петри («Corning») в количестве около 300 тысяч. Через 24 часа были добавлены магнитные частицы («Invitrogen»; H54700), в соотношении 1:100. Магнитные частицы были предварительно обработаны поверхностно активными веществами для создания условий проникновения в цитоплазму клетки. Комбинация клеток НЕК/GFP с магнитными частицами культивировалась 24 часа при температуре 370С в СО2 инкубаторе. Через 24 часа трансгенная культура по гену GFP с магнитными частицами была пятикратно промыта раствором Хенкса (ПанЭко, Россия) и обработана раствором трипсина (ПанЭко, Россия). Коллекцию клеток осуществляли в 1,5 мл эппен-дорф фирмы Corning. Клетки были осаждены на центрифуге фирмы Eppendorf в течение 3 минут при 2,5 тысяч оборотов в минуту. По достижении 80-90% конфлюентности к культуре НЕК-293 добавляли суспензию магнитных частиц. Клетки инкубировали с частицами 24 ч в СО2-инку-баторе. После инкубации культуральную среду меняли и клетки 5-кратно отмывали от свободных магнитных частиц раствором Хенкса. Производилась оценка влияния магнитных частиц на пролиферативную активность стволовых клеток костного мозга методом МТТ теста, на функциональную активность стволовых клеток костного мозга и жизнеспособность с использованием флуоресцентных красителей.
Исследование in vivo проведено на 84 глазах 42 кроликов породы шиншилла в возрасте 6 месяцев весом от 2,5 до 3,5 кг. Все правые глаза были опытными (42 глаза), а левые (42 глаза) -контрольными. Всем кроликам в оба глаза за 30 минут до операции в конъюнктивальную полость инсталлировали 1-2 капли 1% раствора атропина и 10% мезатона для достижения медикаментозного мидриаза. Всем кроликам в качестве анестезии выполняли общий наркоз, кото-
рый осуществляли внутримышечным введением 1% раствора гексенала из расчета 0,5 мл на 1 кг веса животного. Общее обезболивание дополняли трехкратной инстилляцией в конъюн-ктивальную полость 0,4% раствора инокаина. Перед операцией всем кроликам проводили промывание конъюнктивальной полости раствором фурациллина 1:5000. Иммобилизация животных производилась путем тугого бинтования.
В опытной группе (42 глаза) после установки блефаростата, отступя 3 мм от лимба, с помощью конъюнктивальных ножниц в нижнем сегменте производился разрез конъюнктивы и те-ноновой оболочки протяженностью 10 мм. Далее выделяли нижнюю прямую мышцу, брали ее на шов-держалку. Затем в 7-ми мм от лимба подшивали комплекс полимерного эластичного магнитного имплантата (ПЭМИ) толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм, с многополюсным реверсивным намагничиванием с напряженностью магнитного поля 5,0 мТл с лазерным зондом. В 3-х мм от лимба в верхнем и верхне-наружном сегменте устанавливали три порта 25G в проекции плоской части цилиарного тела, фиксировали инфузионную систему, световод, витреотом, производили срединную витрэктомию. Суспензию объемом 0,02 мл, содержащую стволовые клетки (n ~ 6000), меченные магнитными частицами, вводили субретинально при помощи разработанного устройства для дозирования с иглой 25G, на конце которой расположена изогнутая канюля 41G с заточенным нижнем краем. Для предотвращения выхождения клеток через ре-тинотомическое отверстие сразу после их введения витреальную полость заполняли газо-воз-душной смесью. По завершению эксперимента лазерный зонд обрезался на уровне полимерного эластичного магнитного имплантата. На скле-ротомические отверстия и конъюнктиву накладывался шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon).
В группе контроля (42 глаза) хирургическое введение стволовых клеток субретинально производили без фиксации полимерного эластичного магнитного имплантата с лазерным зондом.
Всем экспериментальным животным в послеоперационном периоде через 3 часа, 1, 3, 5, 7, 10, 14 суток, 1 месяц проводили биомикроскопию, офтальмоскопию глазного дна с фотографированием, ультразвуковое офтальмоскани-рование, оптическую когерентную томографию
(ОКТ), компьютерную томографию (КТ), морфологическое исследование (крио-гистологи-ческие срезы).
Результаты
По результатам эксперимента in vitro было показано, что проникновение магнитных частиц внутрь стволовых клеток незначительно снижает пролиферативную активность (до 5% через 72 часа инкубации). Это говорит о том, что жизнеспособность клеток при данной технологии составляет до 95%.
При добавлении к культуре клеток акридинового желтого красителя соотношение зеленой (ДНК) и красной (РНК) люминесценции было увеличено, что говорит о функциональной активности стволовых клеток, содержащих магнитные частицы.
Также при добавлении акридинового желтого красителя и эпидия бромида к культуре стволовых клеток, содержащих магнитные частицы, соотношение живых клеток к некротическим показало жизнеспособность клеток до 95%
По результатам клинических исследований при биомикроскопии в сроки наблюдения 1-3 суток в обеих группах отмечалась инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, которая проходила к 5-м суткам. На всех сроках наблюдения швы конъюнктивы и склеротомических отверстий были адаптированы, оптические среды прозрачны, воспалительных явлений не наблюдалось.
По результатам офтальмоскопии на 1-е сутки во всех глазах опытной и контрольной групп визуализировалась локальная отслойка сетчатки в зоне введения клеток, дефект сетчатки и сосудистой оболочки. К 3-м суткам отслойка сетчатки не визуализировалась, но дефект сетчатки и сосудистой оболочки сохранялся. В дальнейшие сроки наблюдения было сложно визуализировать место локального введения клеток.
По данным ультразвукового исследования во всех глазах опытной и контрольной групп на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки высотой 1,0-1,4 мм, которая к 3-м суткам уменьшилась до 0,4-0,7 мм, а к 5-м суткам не визуализировалась. Во все сроки наблюдения в обеих группах визуализировалась мелкодисперсная взвесь в стекловидном теле, а в опытной группе - эхо-тень от магнита.
По данным КТ во всех случаях выявлено расположение ПЭМИ в правом ретробульбар-ном пространстве в нижне-латеральном квадранте, левые орбиты были интактны, патологических очагов выявлено не было.
По данным флюоресцентной микроскопии криосрезов энуклеированных глазных яблок в 1-е сутки во всех 6-ти глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались в месте их введения под сетчаткой, в стекловидном теле и других структурах глаза обнаружены не были (рис. 1, цветная вкладка). Во всех глазах группы контроля были обнаружены единичные клетки или группы клеток НЕК-293 GFP в полости стекловидного тела, не связанные с другими структурами глаза (рис. 2, цветная вкладка).
На 3-и сутки во всех глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались также в месте введения под сетчаткой. При добавлении на срезы красителя бисбензимида, окрашивающего ядра живых клеток, доказано, что клетки, находящиеся под сетчаткой, являются живыми. В группе контроля в 3-х глазах из 6-ти в полости стекловидного тела были обнаружены скопления клеток НЕК-293 GFP, не связанные с другими структурами глаза, в остальных 3-х глазах клетки НЕК-293 GFP обнаружены не были (рис. 3, цветная вкладка).
В сроки наблюдения 5, 7, 10, 14 суток в опытной группе клетки НЕК-293 GFP также располагались в месте их введения, но количество клеток снижалось на каждом последующем сроке наблюдения. К сроку 1 месяц клетки обнаружить не удалось ни в одном случае, но во всех 6-ти глазах наблюдалась присклеральная флюоресценция в зоне подшивания ПЭМИ (рис. 4, цветная вкладка). В группе контроля в сроки наблюдения 5, 7, 10, 14 суток и 1 месяц клетки не визуализировались.
Обсуждение
В настоящее время клеточные технологии выступают наиболее перспективным направлением для восстановления поврежденных органов и тканей [4]. В офтальмологических экспериментальных работах трансплантация стволовых клеток также доказала свою эффективность при травматических и дегенеративных заболеваниях сетчатки и зрительного нерва [3], [5], [6], [13]. Однако исследователи столкнулись с проблемой кратковременности эффекта в свя-
зи с выраженной миграцией трансплантированного материала в другие отделы глаза и травматизацией окружающих тканей при проведении хирургических вмешательств. Поэтому актуальным вопросом является разработка технологии фиксации клеточного материала в зоне его локальной трансплантации с наименьшей травматизацией тканей во время операции.
В предыдущих своих работах нами была доказана безопасность и эффективность разработанной технологии культивирования мезен-химальных стволовых клеток с магнитными частицами [1], [2]. В данном исследовании мы использовали клеточную линию HEK-293 в связи с доступностью материала, легкостью культивирования и возможностью провести трансфекцию GFP-плазмидой, что давало неоспоримое преимущество при проведении флюоресцентной микроскопии криогистологичес-ких срезов в эксперименте in vivo.
Для введения клеточной суспензии в субре-тинальное пространство нами было разработано специальное устройство, которое обеспечивало деликатное введение клеток с минимальной травматизацией окружающих тканей с возможностью точного дозирования вводимой суспензии.
Для интраоперационной диафаноскопии с целью точного определения места и последующего контролируемого локального введения стволовых клеток мы применяли ПЭМИ с лазерным зондом оригинальной конструкции. Мы также модифицировали хирургический способ введения стволовых клеток субретинально, проводя срединную витрэктомию и заполняя вит-реальную полость газо-воздушной смесью после введения клеток, что позволило избежать выхода клеток из субретинального пространства в полость стекловидного тела.
В результате проведенных исследований доказано, что предложенная методика является микроинвазивной: в сроки от 3-х до 5-ти суток послеоперационного периода локальной отслойки сетчатки в месте введения клеток уже не наблюдалось, воспалительных явлений и инт-раоперационных осложнений ни в одном случае выявлено не было. Данные морфологического исследования демонстрируют, что предложенная методика позволяет осуществить фиксацию клеточного материала в месте их локального введения сроком до 14 дней и дает возможность прогнозирования их движения. Отсут-
ствие клеток в зоне введения через 1 месяца мы связываем с иммунным ответом на ксеногенные стволовые клетки.
Заключение
Предложенная оригинальная методика локального субретинального введения стволовых клеток, меченных магнитными частицами, является эффективным способом фиксации мате-
риала в зоне введения. Данная технология может стать основой для изучения механизмов воздействия стволовых клеток на очаг повреждения, разработки новых перспективных стратегий в офтальмологии, а также открыть новые возможности применения стволовых клеток в качестве средств нейропротекции или альтернативных терапевтических приемов при лечении различной патологии.
19.09.2014
Список литературы:
1. Белый, Ю.А. Разработка технологии культивирования мезенхимальных стволовых клеток с магнитными частицами для субретинального введения / Ю.А. Белый, А.А. Темнов, С.А. Миргородская // Вестник ОГУ. - 2013. - 4(153). - С. 40-43.
2. Мезенхимальные стволовые клетки с магнитными частицами для субретинального введения в офтальмологии / Ю.А. Белый [и др.] // Научно-медицинский журнал Офтальмология. - 2013. - 10(3). - С. 72-74.
3. Беляковский, П.В. Применение эмбриональных стволовых клеток и факторов роста стволовых клеток (stem cell factor, lif) при токсическом поражении зрительного нерва у кроликов / П.В. Беляковский, Н.И. Позняк, Е.С. Лобанок // Рецепт. -2009. - 12. - С. 156-161.
4. Онищенко, Н.А. Клеточная трансплантация - перспективное направление регенерационной медицины / Н.А. Онищенко, М.Е. Крашенинников // Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. - М.: 2009.
5. Ромащенко, А.Д. Способ лечения атрофии зрительного нерва посредством трансплантации аутологичных стволовых клеток / А.Д. Ромащенко, А.В. Ковалев // Официальный бюллетень Российского агентства по патентам и товарным знакам. - 2009. - 26. - С. 8.
6. Влияние стволовых/прогениторных клеток на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Campbell / Х.П. Тахчиди [и др.] // Офтальмохирургия. - 2010. - 3. - С. 33-38.
7. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells / A.S. Arbab [et al.] // Hum Gene Ther. - 2004. -15(4). - P. 351-360.
8. Transplantation of ocular stem cells: the role of injury in incorporation and differentiation of grafted cells in the retina / D.M. Chacko [et al.] // Vision Res. - 2003. - 43(8). - P. 937-946.
9. The possible use of stem cells in regenerative medicine: dream or reality? / S. Ehnert [et al.] // Langenbecks Arch Surg. - 2009. -394. - P. 985-997.
10. Embryonic stem cells are capable of generating a neuronal network in the adult mouse retina / A. Hara [et al.] // Brain Res. -2004. - 999(2). - P. 216-221.
11. Bone marrow mesenchymal stem cells protect against retinal ganglion cell loss in aged rats with glaucoma / Y. Hu [et al.] // Clin. Interv. Aging. - 2013. - 8. - P. 1467-1470.
12. Reconstruction of the corneal epithelium with induced marrow mesenchymal stem cells in rats / T.S. Jiang [et al.] // Mol. Vis.
- 2010. - 16. - P. 1304-1316.
13. Therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on laser-induced retinal injury in mice / Y. Jiang [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2014. - 15(6). - P. 9372-9385.
14. Joe, A.W. Mesenchymal stem cells and potential applications in treating ocular disease / A.W. Joe, K. Gregory-Evans // Curr. Eye. Res. - 2010. - 35(11). - P. 941-952.
15. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury / P. Kyrtatos [et al.] //JACC Cardiovasc Interv.
- 2009. - 2(8). - P. 794-802.
16. Liu, X.W. Transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells for the treatment of corneal endothelium damages in rabbits / X.W. Liu, J.L. Zhao // Zhonghua Yan. Ke. Za. Zhi. - 2007. - 43(6). - P. 540-545.
17. Nrl is required for rod photoreceptor development / A. Mears [et al.] // Nature Genet. - 2001. - 29. - P. 447-452.
18. Silvermann, M.S. Photoreceptor transplantation in inherited and environmentally induced retinal degeneration: anatomy, immunohistochemistry and function / M.S. Silvermann, S.E. Hughes // Prog. Clin. Biol. Res. - 1989. - 314. - P. 687-704.
19. Using a neodymium magnet to target delivery of ferumoxide-labeled human neural stem cells in a rat model of focal cerebral ischemia / M. Song [et al.] // Hum. Gene Ther. - 2010. - 21(5). - P. 603-610.
20. Widespread integration and survival of adult-derived neural progenitor cells in the developing optic retina / M. Takahashi [et al.] // Mol. Cell Neurosci. - 1998. - 12(6). - P. 340-348.
Сведения об авторах:
Темнов Андрей Александрович, заведующий лабораторией клеточных и физико-химических медицинских технологий НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, доктор медицинских наук,
e-mail: [email protected]
Белый Юрий Александрович, заместитель директора по науке Калужского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Министерства здравоохранения Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор, е-mail: [email protected]
Миргородская Светлана Александровна, очный аспирант МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва,
e-mail: [email protected]
Семенов Александр Дмитриевич, главный научный консультант МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Министерства здравоохранения Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор
Ревищин Александр Владимирович, старший научный сотрудник группы нейрогенетики и генетики развития отдела геномики и клеточных технологий Института биологии гена Российской академии наук, кандидат биологических наук, е-mail: [email protected]
Павлова Галина Валерьевна, руководитель группы нейрогенетики и генетики развития отдела геномики и клеточных технологий Института биологии гена Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор; е-mail: [email protected]
Куст Надежда Николаевна, старший лаборант-исследователь группы нейрогенетики и генетики развития отдела геномики и клеточных технологий Института биологии гена Российской академии наук; е-mail: [email protected]
