CC BY
18
УДК 535.4, 681.7
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ UVA ИЗЛУЧЕНИЯ НА ИНФЕКЦИОННЫЕ
СВОЙСТВА КОРОНАВИРУСА
И. Н. Завестовская1'2, В. А. Гущин3, М.А. Никифорова3, А. Э. Синявин3, Л. И. Руссу3, Е.А. Чешев1, А. Л. Коромыслов1, И.М. Тупицын1, А. А. Фроня1'2, М.С. Григорьева1'2
Представлены результаты экспериментальных исследований воздействия ультрафиолетового излучения в диапазоне длин волн UVA, безопасном для человека, на инфицирующие свойства в-коронавируса. Для исследований был выбран бычий коронавирус как прототип возбудителя COVID-19, (SARS-CoV-2), но не являющийся патогенным для человека. В качестве источника излучения были использованы светодиоды с длиной волны 371 нм и 401 нм. Было показано, что для обеих длин волн UVA излучения наблюдается дозозависимое снижение инфекционного титра вируса.
Ключевые слова: ультрафиолетовое излучение, коронавирусы, бычий коронавирус.
Введение. Продолжающаяся больше года пандемия, связанная с распространением вируса SARS-CoV-2, привела к активизации работ по поиску не только специфических средств профилактики и лечения, но и эффективных средств для борьбы с накоплением и распространением инфекционных агентов в окружающей среде. Одним из основных способов распространения вируса, наряду с передачей вируса воздушно-капельным путём при прямом контакте с зараженным человеком, является передача его от человека к человеку через контактные поверхности с последующим занесением на слизистые оболочки глаз, верхних дыхательных путей.
Наличие средств безопасной для человека обработки контактных поверхностей с целью инактивации вирусов и бактерий позволит в существенной степени уменьшить
1 ФИАН, 119991 Россия, Москва, Ленинский пр-т, 53; e-mail: semtch@gmail.com.
2 НИЯУ "МИФИ", 115409 Россия, Москва, Каширское ш., 31.
3 НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, 123098 Россия, Москва, ул. Гамалеи, 18.
количество патогенных микроорганизмов и снизить риск передачи вируса от человека к человеку.
За последнее десятилетие группами ученых разных стран была продемонстрирована эффективность инактивации ряда патогенных агентов под воздействием ультрафиолетового излучения в различных диапазонах длин волн - от 220 до 480 нм [1-10]. Действие излучения диапазона UVC (Л = 200 — 280 нм) с максимумом при 265 нм является наиболее эффективным методом инактивации вирусов и бактерий, поскольку оно хорошо поглощается молекулами РНК и ДНК [2, 5]. Для эффективной борьбы с патогенными агентами дезинфекция должна быть непрерывной в помещениях учреждений здравоохранения, а в период сезонных инфекций - во всех помещениях учреждений образования, промышленных предприятий, предприятий общественного питания и других мест общественного пользования, также как и в общественном транспорте. Использование UVC излучения для этих целей не применимо, т. к. запрещено для использования в присутствии людей из-за ионизирующего воздействия и вызываемых им побочных эффектов на слизистые оболочки и кожу (канцерогенез и др.). Источники UVB (Л = 280 — 315 нм) и UVA (Л = 315 — 400 нм) более безопасны для человека, и при соблюдении ограничений по дозе облучения могут быть использованы и в присутствии человека [11].
Исследования последних лет по инактивации патогенных микроорганизмов с использованием источников излучения с длинами волн в диапазоне UVA демонстрируют положительные результаты [5, 12-16], что открывает путь к новой технологии непрерывной деактивации вирусов и бактерий и позволит в существенной степени предотвратить глобальное распространение инфекционных заболеваний.
В данной работе представлены результаты экспериментальных исследований воздействия ультрафиолетового излучения в диапазоне длин волн UVA, безопасном для человека, на инфекционные свойства коронавируса. Для исследований в качестве модельного вируса был выбран бычий коронавирус, который обладает меньшей степенью патогенности по сравнению с SARS-CoV-2. В качестве источника излучения были использованы светодиоды с длиной волны 371 нм и 401 нм. Доза облучения бычьего ко-ронавируса варьировалась путем изменения длительности облучения. Было показано, что для обеих длин волн УФ-излучения наблюдается дозозависимое снижение инфекционного титра вируса.
Материалы и методы. В ФГБУ "НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи" МЗ РФ активно ведутся работы по исследованию противовирусных и противобактериальных средств,
разработан широкий спектр методов, в том числе по исследованию бактерицидных свойств различных субстанций [17, 18]. В качестве вирусных моделей в исследованиях используются различные лабораторные штаммы вирусов, включая коронавирусы животных, а также другие оболочечные вирусы. В настоящей работе исследования на вирус-клеточных системах производилось с использованием отработанных протоколов на базе референс-центра по коронавирусной инфекции НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. В работе использовался бычий коронавирус, который рассматривается как модельная среда для исследования коронавируса 8АИ,8-СоУ-2 [19, 20]. Стоки бычьего коронавируса получали в процессе острой инфекции клеток МЮВК (почка быка), которые культивировали в полной ростовой среде БМЕМ, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), Ь-глутамин (4 тМ) и смесь антибиотиков пенициллин/стрептомицин (100 МЕ/мл; 100 мкг/мл). Титр вируса до облучения составлял 105 ТСГО50/мл. Работы с патогенными микроорганизмами регламентировались правилами работ с биологическими агентами Ш-1У групп патогенности (Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.3118-13).
Определение эффективности инактивации исследуемых патогенных биологических агентов от длины волны и дозы излучения было осуществлено согласно разработанному протоколу с помощью полупроводниковых источников излучения на основе коммерчески доступных светодиодов с длиной волны 371 нм и 401 нм. Для каждого источника
Рис. 1: Спектр излучения источников UVA, длина волны 371 нм и 401 нм.
излучения были проведены измерение энергетических характеристик, проведены работы по обеспечению стабильности излучательных характеристик. Светодиод с длиной волны 371 нм (диапазон UVA) имел выходную мощность 840 мВт. Светодиод с длиной волны 401 нм (диапазон UVA) имел выходную мощность 750 мВт. На рис. 1 представлены спектры излучения используемых светодиодов с длиной волны 371 нм и 401 нм.
Вируссодержащую жидкость (ВСЖ) с бычьим коронавирусом помещали в ячейки планшета (24-луночный плоскодонный планшет с единой величиной диаметра по высоте лунки). В лунки наливали одинаковое количество (500 мкл) ВСЖ, что обеспечивало одинаковую толщину облучаемого слоя. Планшет с заполненными лунками располагался на зачернённой поверхности под источником излучения. Излучающая апертура светодиода располагалась на расстоянии 4 см от поверхности ВСЖ. Доза облучения определялась как произведение измеренной плотности мощности на поверхности ВСЖ в лунке и времени воздействия.
Лунки планшетов с ВСЖ были промаркированы. Проводилось облучение одновременно четырех лунок с ВСЖ. В качестве контроля использовался исходный необлучен-ный материал (ВСЖ). Схема облучения вируса излучением светодиодов представлена на рис. 2.
Side view Top view
| - Bovine Coronavirus in DMEM
24 well plates
••M •••• ••••
•••• ••••
24 well plates
Рис. 2: Схема облучения бычьего коронавируса в 24-луночном планшете.
В табл. 1 приведены значения доз облучения на поверхности питательного раствора с вирусом в зависимости от времени облучения.
Т а б л и ц а 1
Доза облучения на поверхности питательного раствора с вирусом в зависимости от времени облучения
Время воздействия УФ-излучения Источник 1—371 нм (UVA). Доза облучения Источник 2—401 нм (UVA). Доза облучения
0 (контроль)
10 мин 8.4 Дж/см2 7.5 Дж/см2
20 мин 16.8 Дж/см2 15 Дж/см2
40 мин 33.6 Дж/см2 30 Дж/см2
После облучения инфекционность бычьего коронавируса анализировалась по следующей методике. Облученная ВСЖ собиралась в пробирку, после чего готовились десятикратные разведения с 10-1 до 10-6. Для этого в пробирку с 0.9 мл среды DMEM добавляется 0.1 мл облученной ВСЖ, после чего производятся последовательные разведения до 10-6. За сутки до эксперимента культура клеток MDBK высеивалась в 96-луночные планшеты в концентрации 2.5 х 104 клеток/лунку. Титрование ВСЖ проводится в четырех повторах (по 200 мкл на лунку) на клетках MDBK, для чего из планшета с монослоем клеток убирается ростовая среда и вносятся приготовленные разведения ВСЖ. После этого 96-луночные планшеты инкубируются в течение 5 суток при 37 °C в атмосфере с 5% CO2 и 98% влажности. Титр вируса выражается в ТСГО50/мл, на основе вирус-индуцированного цитопатического эффекта.
Результаты экспериментов. Результаты экспериментов приведены на рис. 3.
Наиболее высокое снижение титра вируса наблюдается при обработке вируссодер-жащей жидкости светодиодом с длиной волны 371 нм в течение 40 минут. Для воздействия обеими длинами волн светодиодов (371 нм и 401 нм) наблюдается дозозависимое снижение инфекционного титра вируса, в зависимости от времени обработки.
Механизм, лежащий в основе инактивационного действия излучения диапазона UVA, пока до конца не изучен. Одним из возможных механизмов повреждения вируса можно рассматривать формирование активных форм кислорода. Например, в результате генерации синглетного кислорода может реализоваться механизм окислительного повреждения РНК вируса [21, 22]. Формирование активных форм кислорода, предположительно, происходит при поглощении излучения эндогенными сенсибилизаторами внутри системы "бычий коронавирус+DMEM". Дальнейшее развитие работ предполагает установление кинетики и механизма фотоиндуцированной инактивации молекул нуклеиновых кислот, белков, липидов вирусов при воздействии излучения в диапазоне
Рис. 3: Зависимость величины титра бычьего коронавируса от дозы облучения для длин волн 371 и 401 нм.
UVA, и определение чувствительности штаммов вирусов и бактерий и зависимости эффективности инактивации от дозы и длины волны излучения, что позволит в дальнейшем разработать эффективную технологию предотвращения распространения вирусных и бактериальных инфекций.
зЗаключение. Представлены результаты экспериментальных исследований воздействия ультрафиолетового излучения в диапазоне длин волн UVA на инфекционные свойства коронавируса. Для исследований был выбран бычий коронавирус. В качестве источника излучения использовались светодиоды с длиной волны 371 нм и 401 нм. Было обнаружено, что для обеих длин волн UVA излучения наблюдается дозозависимое снижение инфекционного титра вируса.
Полученные в ходе исследований результаты могут стать основой разработки безопасной для человека технологии дезинфекции светом, которая в перспективе может стать универсальной и, безусловно, самой биосовместимой стратегией борьбы с патогенными биологическими агентами, независимо от того, являются ли они вирусами, бактериями или грибами.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-04-60292.
ЛИТЕРАТУРА
[1] P. Luzzatto-Fegiz, F. Temprano-Coleto, F. J. Peaudecerf, et al., UVA Radiation Could Be a Significant Contributor to Sunlight Inactivation of SARS-CoV-2. bioRxiv (2020), pp. 2-9. DOI: 10.1101/2020.09.07.286666.
[2] Y. Gerchman, H. Mamane, N. Friedman, and M. Mandelboim, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 212, 112044 (2020). DOI: l0.l0l6/j.jphotobiol.2020.ll2044.
[3] R. M. Tomb, M. Maclean, J. E. Coia, et al., Food Environ. Virol. 9, 159 (2017). DOI: l0.l007/sl2560-0l6-9275-z.
[4] R. M. Tomb, M. Maclean, P. R. Herron, et al., Bacteriophage 4(3), e32l29 (2014). DOI: 10.4161/bact.32129.
[5] L. Horton, A. E. Torres, S. Narla, et al., Photochem. Photobiol. Sci. 19(10), 1262 (2020). DOI: 10.1039/D0PP00221F.
[6] О. В. Кузьмин, Н. И. Фасхутдинова, Biomed. Photonics 6(4), 37 (2017).
[7] Н. И. Фасхутдинова, О. В. Кузьмин, Медицинская физика 76(4), 37 (2017).
[8] M. G. Strakhovskaya, G. A. Meerovich, A. N. Kuskov, et al., Laser Phys. Lett. 17(9), 093001 (2020). DOI: l0.l088/l6l2-202X/ababl4.
[9] С. В. Костюченко, А. А. Ткачев, Т. Н. Фроликова, Эпидемиология и Вакцинопро-филактика 19(5), 112 (2020). DOI: 10.31631/2073-3046-2020-19-5-112-119.
[10] А. А. Смирнов, И. М. Довлатов, Вестник НГИЭИ 115(12), 49 (2020). DOI: 10.24411/2227-9407-2020-10119.
[11] O. P. Egambaram, S. Kesavan Pillai, and S. S. Ray, Photochem. Photobiol. 96(4), 779 (2020). DOI: l0.llll/php.l3208.
[12] M. E. R. Darnell, K. Subbarao, S. M. Feinstone, and D. R. Taylor, J. Virol. Methods 121(1), 85 (2004). DOI: l0.l0l6/j.jviromet.2004.06.006.
[13] K. Song, M. Mohseni, and F. Taghipour, Water Res. 163, 114875 (2019). DOI: l0.l0l6/j.watres.20l9.ll4875.
[14] C. S. Heilingloh, U. W. Aufderhorst, L. Schipper, et al., Am. J. Infect. Control 48(10), 1273 (2020). DOI: l0.l0l6/j.ajic.2020.07.03l.
[15] R. Nishisaka-Nonaka, K. Mawatari, T. Yamamoto, et al., J. Photochem. Photobiol. B Biol. 189(6), 193 (2018). DOI: l0.l0l6/j.jphotobiol.20l8.l0.0l7.
[16] R. de Santis, V. Luca, G. Faggioni, et al., medRxiv 2(6), (2020). DOI: 10.1101/2020.06.18.20134577.
[17] M. V. Fursov, R. O. Abdrakhmanova, N. P. Antonova, et al., Viruses 12(5), 545 (2020). DOI: 10.3390/v12050545.
[18] N. P. Antonova, D. V. Vasina, E. O. Rubalsky, et al., Biomolecules 10(3), 440 (2020). DOI: 10.3390/biom10030440.
[19] R. S. Joshi, S. S. Jagdale, S. B. Bansode, et al., J. Biomol. Struct. Dyn. (2020) pp. 1-16. DOI: 10.1080/07391102.2020.1760137.
[20] N. Yoshizawa, R. Ishihara, D. Omiya, et al., Viruses 12(12), 1372 (2020). DOI: 10.3390/v12121372.
[21] C. P. Sabino, A. R. Ball, M. S. Baptista, et al., J. Photochem. Photobiol. B Biol. 212, 111999 (2020). DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2020.111999.
[22] T. Kohn and K. L. Nelson, Environ. Sci. Technol. 41(1), 192 (2007). DOI: 10.1021/es061716i.
Поступила в редакцию 19 апреля 2021 г.
После доработки 16 мая 2021 г. Принята к публикации 17 мая 2021 г.
