CC BY
18
УДК 612.111.7:612.115
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ДИНАМИКИ СВЕРТЫВАНИЯ ТРОМБА В ПОТОКЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ
EXPERIMENTAL RESEARCH OF SPATIAL DYNAMICS OF THROMBUS FORMATION IN BLOOD PLASMA FLOW
О. Э. Авилов, С. Г. Григорьев O. E. Avilov, S. G. Grigoryev
ГОУВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева», г. Чебоксары
Аннотация. Исследовано формирование фибринового сгустка в потоке плазмы крови при помощи новой экспериментальной системы. Показано, что экспериментальный метод имеет диагностическую медицинскую силу, открыты новые свойства системы плазменного свертывания крови человека.
Abstract. The thrombus formation in blood plasma flow was studied with the help of new experimental system. It was shown that the experimental method has diagnostic medical abilities. New properties of the coagulation system were discovered.
Ключевые слова: поток, свертывание, плазма крови, приборостроение, диагностика.
Keywords: flow, coagulation, blood plasma, instrumentation, diagnostics.
Актуальность исследуемой проблемы. Повреждение кровеносных сосудов приводит к контакту структур эндотелия с кровью и формированию сгустка, покрывающего место повреждения и предотвращающего потерю крови. Образование тромба является сложным пространственно-временным процессом. В последние годы актуальными стали вопросы исследования биохимических реакций, ответственных за начало образования
тромба, увеличение его размеров, физических процессов (процессов диффузии и тока крови), влияющих на динамику роста тромба, а также проблемы, связанные с диагностикой патологий системы свертывания.
В настоящее время уже существует ряд экспериментальных моделей, позволяющих регистрировать образование тромбов как in vivo, так и in vitro [1], [3], [4], [5]. Все такие системы производят регистрацию растущего тромба либо из вида сверху, либо снизу на просвет, что не позволяет корректно судить о размере (т. е. о толщине) сгустка и скорости его роста как одного из ключевых параметров.
В этой связи целью работы явилось построение экспериментальной системы и исследование пространственной динамики роста тромба в потоке плазмы крови человека.
Материал и методика исследований. Для проведения экспериментов плазма приготавливалась стандартным образом из крови, взятой на антикоагулянте (3,8 % раствор цитрата Na, pH 5,5), соотношение кровь:цитрат составляло 9:1 [7]. После предварительного отделения эритроцитов плазму центрифугировали в течение 15 минут при 1600g и 10 минут при 10000g для удаления тромбоцитов. Сразу после приготовления pH в плазме стабилизировали в условиях контакта с атмосферным воздухом на уровне 7,2-7,4 путем инкубации в течение 60 мин с молочной кислотой. Перед началом эксперимента плазма рекальцифицировалась, т. е. концентрация ионов кальция в ней доводилась до физиологических значений с помощью раствора CaCl2, сделанного на основе буфера 20 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, pH 7,4.
Для уменьшения эффекта предактивации плазмы вследствие ее контакта с искусственными поверхностями в препарат плазмы добавляли ингибитор трипсина из зерен кукурузы (CTI) в конечной концентрации 0,2 мг/мл, рекальцификация плазмы проводилась «в потоке» при помощи T-образного смесителя из полиэтилена высокого давления (Fisher Scientific). Образование сгустка инициировалось искусственно выращенным на мягкой подложке слоем клеток - фибробластами, как предложено ранее [6]. В работе использовалась культура клеток из легких человека. Фибробласты на своей поверхности покрыты белком тканевым фактором, который при контакте с плазмой крови запускает свертывание. Пленка с фибробластами крепилась с внутренней стороны канала, не изменяя при этом его геометрии. Для внутренних поверхностей был выбран полистирол как один из наиболее биологически инертных материалов [6]. Для уменьшения эффекта контактной активации полистироловые компоненты камеры являлись одноразовыми. Силиконовая прокладка изготовляется из коммерчески доступного силикона (Dow Corning).
В работе использованы препараты плазмы 47 нормальных анонимных доноров, у которых не было болезней свертывания крови. Кровь забирали на Станции переливания крови (СПК) ГНЦ РАМН.
Результаты исследований и их обсуждение. Исследование роста сгустка в новой экспериментальной системе при отсутствии потока показало, что полученные результаты не только качественно, но и количественно совпадают с результатами, полученными для системы без перемешивания (скорость роста сгустка составила 47,7±7,0 мкм/мин, за 1020 мин в разных участках камеры возникали спонтанные сгустки). Было проведено около 400 экспериментов с плазмой крови нормальных доноров в условиях потока, у которых не было болезней крови. При проведении экспериментов варьировалась скорость потока, скорость сдвига при этом составляла от 0 до 3000 1/мин, поперечные размеры канала -1х1 мм, длина канала - 87 мм. При обработке первичных данных измерялись следующие параметры:
• время задержки свертывания - в мин, время от начала эксперимента до начала роста сгустка, т. е. время, когда эксперимент уже идет, но формирования сгустка не наблюдается;
• скорость роста сгустка в середине активатора, в мкм/мин;
• угол переднего фронта сгустка - в градусах, измеренный на 40-й минуте эксперимента;
• максимальная толщина сгустка - в мм от границы канала, измеренная на 40-й минуте эксперимента.
Первые же эксперименты показали, что поток кардинальным образом влияет на формирование сгустка. Белки, или факторы свертывания, находятся в крови в достаточных для работы системы свертывания концентрациях. Однако для предотвращения ложного срабатывания системы свертывания и патогенного образования тромбов в произвольных местах факторы свертывания находятся в крови в неактивном состоянии. В процессе работы каскада свертывания и полимеризации фибрина факторы переводятся из неактивного в активное состояние. Активные факторы свертывания сносятся ниже по потоку, что сказывается на форме сгустка: он вытягивается вдоль канала ниже по потоку, у сгустка образуется своеобразный «хвост». Ранее не наблюдавшаяся особенность растущего в потоке сгустка состоит в том, что интенсивность светорассеяния регистрируемого сигнала оказывается выше вблизи монослоя с фибробластами (около 200 отн. ед.) по сравнению с его хвостовой частью (около 130-150 отн. ед.), что позволяет говорить о пространственнонеоднородной структуре фибринового сгустка.
На рис. 1 показана зависимость времени задержки от скорости сдвига: видно, что поток сильно ингибирует процессы полимеризации, что приводит к нелинейному ответу системы свертывания. Данные результаты получены для свободной от тромбоцитов плазмы. Весь массив экспериментальных данных можно условно разделить на два участка. На первом из них (от 0 до 700 мин-1) - в пределах погрешности измерений роста времени - задержки не происходит (все значения укладываются в диапазон 0-12 мин). На втором, таком же по диапазону скоростей (от 700 до 1400 мин-1), система свертывания постепенно перестает сопротивляться потоку, что приводит к нелинейному росту времени задержки в 7 раз. Следует отметить, что данное нелинейное поведение системы свертывания описано впервые. При скоростях потока более 500-700 мин-1 время задержки представляет собой промежуток между началом эксперимента и инициацией свертывания. При задержке более 60 мин по физиологическим соображениям считаем, что свертывание в данном случае не начинается совсем, так как более 1 часа после начала эксперимента не начиналось формирование сгустка. Нетрудно видеть, что полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с теоретическими расчетами, выполненными А. М. Шибеко в ГНЦ РАМН [2].
Согласно полученным данным, давление потока оказывает ингибирующее влияние на каскадный процесс полимеризации, приводит к резкому (более чем на порядок) падению скорости роста сгустка, что позволяет говорить о влиянии гидродинамического фактора (а именно скорости потока) на скорость работы каскада биохимических реакций. Это для системы свертывания также является новым свойством, описанным впервые.
Скорость сдвига, 1/мин
Рис. 1. Зависимость времени задержки от скорости потока
На рис. 2 и 3 приведены зависимости угла переднего фронта сгустка и максимальной его толщины от скорости сдвига. Гиперболический характер снижения параметров говорит о том, что при увеличении скорости потока нелинейно увеличивается количество сносимых ниже по потоку от активатора активных факторов свертывания, что приводит к снижению скорости работы всего каскада свертывания - т. е. сгусток становится тоньше, более плоским, в результате чего уменьшается угол его переднего фронта. Таким образом, начиная со скоростей сдвига более 1500 мин-1 время задержки теряет свой физиологический смысл, скорость роста тромба резко падает и можно говорить об эффекте «выключения» свертывания потоком.
Конечной стадией формирования фибринового сгустка является полимеризованная сеть фибриновых волокон, которые эффективно препятствуют проникновению через повреждение не только клеток крови, но и плазмы. При скоростях сдвига более 700 мин-1 был обнаружен еще один новый для плазменного звена свертывания эффект, который заключается в росте сигнала светорассеяния внутри сгустка с течением времени после его формирования. Исследование проводилось в приактиваторной области канала. Удалось выделить три стадии в формировании сгустка: 1) отсутствие сигнала и как результат -отсутствие роста сгустка; 2) резкий подъем уровня сигнала светорассеяния - формирование тромба в исследуемой области; 3) плавный рост - плавное увеличение сигнала светорассеяния внутри сети полимеризовавшихся волокон фибрина. Поскольку сгусток является препятствием кровопотери, то неожиданным является тот факт, что приносимые с потоком факторы свертывания за счет диффузии попадают внутрь сгустка и продолжают процесс полимеризации, что, в свою очередь, приводит к монотонному росту сигнала. Данный факт является новым и, несомненно, заслуживает дальнейшего изучения.
50-
(9
I-
X
о
&
■&
о
|_
ф
X
ч
ф
&
ф
40-
30-
20
• I
• •
10-
•Г*. А'’*Г-4
250
500
750
1000 1250 1500
1750
Скорость сдвига, 1/мин
Рис. 2. Зависимость угла переднего фронта от скорости потока
3,0-
2,55
5 2,0-св
X
^ 15 § 1,5 н X < 1,0-
0,5
0,0
:г-
*. Г
А • • •
250 500 750 1000 1250
Скорость сдвига, 1/мин
—і------1------1
1500 1750
Рис. 3. Зависимость максимальной толщины сгустка от скорости потока
Резюме. Установлено, что при росте скорости потока происходит нелинейное изменение параметров системы свертывания и ингибируется формирование сгустка потоком, а с определенной скорости образование этого сгустка потоком «выключается».
0
0
0
Построенный экспериментальный комплекс позволяет получать последовательные во времени изображения растущего сгустка, информацию о динамике роста тромба, обрабатывая полученные изображения, и открывает новые возможности по исследованию тромбообразования в потоке, позволяя получать не только фундаментальные сведения о формировании сгустка, но и в перспективе использовать их в прикладном направлении. Данная система может быть использована как клинический инструмент при измерении показателей системы свертывания (скорость роста сгустка, время задержки свертывания) для определения возможных отклонений от нормы у донора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Севастьянов, В. И. Биосовместимость /В. И. Севастьянов. - М., 1999. - С. 367.
2. Balasubramanian, V. Platelets, circulating tissue factor, and fibrin colocalize in ex vivo thrombi: real-time fluorescence images of thrombus formation and propagation under defined flow conditions / V. Balasubramanian, E. Grabowski, A. Bini, Y. Nemerson // The American Society of Hematology. - 2002. - Р. 58-81.
3. Grabowski, E. F. Platelet Aggregation in Flowing Blood at a Site of Injury to an Endothelial Cell Monolayer: Quantitation and Real-Time Imaging with the TAB Monoclonal Antibody / E. F. Grabowski // The American Society of Hematology. - 1990. - Р. 46-64.
4. Ovanesov, M. V. Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth / M. V. Ovanesov, J. V. Krasotkina, L. I. Ul’yanova, K. V. Abushinova, O. P. Plyushch, S. P. Domogatskii, A. I. Vo-rob’ev, F. I. Ataullakhanov // Biochimica et Biophysica Acta. - 2002. - P. 25-49.
5. Panteleev, M. A. Spatial Propagation and Localization of Blood Coagulation Are Regulated by Intrinsic and Protein C Pathways / M. A. Panteleev, M. V. Ovanesov, D. A. Kireev, A. M. Shibeko, E. I. Sinauridze, N. M. Ananyeva, A. A. Butylin, E. L. Saenko, F. I. Ataullakhanov // Biophysical Journal. - 2006. - Vol. 90. -P. 1489-1500.
6. Shahrokh, F. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse / F. Shahrokh, P. Gross, G. Merrill-Skoloff // Nature Medicine. - 2002. - Vol. 8 - № 10. -P. 39-64.
7. Shinya, G. Propagation of Arterial Thrombi / G. Shinya // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2004. -P. 2207-2208.
