CC BY
18Токсикологический вестник №б (117)
УДК 577.12 : 615.91
Экспериментальное исследование острой токсичности генистеина в опытах на мелких лабораторных животных
Проведена экспериментальная оценка острой токсичности отечественного синтетического изофлавоноида генистеина при различных путях введения самцам и самкам белых нелинейных мышей, а также самцам-гибридам F1 линии (СВА х С57В1). Установлено, что исследуемый препарат относится к III классу токсичности - вещества умеренно токсичные.
Ключевые слова: генистеин, изофлавоноиды, острая ток-
Гребенюк А.Н.1, Башарин В.А.1, Тарумов Р.А.1, Назаров В.Б.2,. Ковтун В.Ю2, Чикунов И.Е.2
'Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, г. Санкт-Петербург
2Научно-производственный центр «Фармзащита» Федерального медико-биологического агентства, г Химки Московской области
сичность, лабораторные животные (мыши).
Введение. Генистеин (4,5,7-тригидроксиизофлавоноид, CAS № 446-72-0) является одним из самых известных изофла-воноидов. Его высокие показатели эффективности при лечении ряда заболеваний отражены в многочисленных иностранных публикациях. В частности, было показано, что генистеин проявляет антиканцерогенные свойства [6,11], успешно применяется в период постменопаузы у женщин [9,12], в лечении ряда заболеваний кардиологического профиля [10], а также эффективен при профилактике остеопороза [12]. Кроме того, генистеин представляется перспективным кандидатом в качестве радиопротектора при остром или пролонгированном ионизирующем облучении [4,8,14].
Следует особо подчеркнуть, что изофлавоноид генистеин обладает выраженной антиоксидантной активностью [5,7]. Это свойство препарата позволяет найти ему применение в токсикологии.
В Научно-производственном центре «Фармзащита» Федерального медико-биологического агентства (г. Химки, Московская область) был синтезирован 4,5,7-тригидроксии-зофлавоноид (генистеин), производство которого на порядок дешевле иностранного аналога. Однако токсикологическая безопасность и специфическая эффективность отечественного генистеина пока не изучены, что и явилось основанием для проведения настоящей работы.
Целью исследования явилось изучение острой токсичности генистеина в опытах на мелких лабораторных животных.
Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на 352 белых нелинейных мышах (240 самцах и 112 самках) и 100 самцах мышей гибридов F1 линии (CBA x C57B1) разведения питомника РАМН «Рапполово» (пос. Рап-полово Ленинградская область). Исследования проводились в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н).
Мыши содержались в стандартных условиях вивария, рекомендуемых для содержания грызунов [13]. В исследование отбирали мышей массой 18-24 г. Перед проведением каждого эксперимента животные находились под наблюдением (в карантине), длительность которого составляла 14 сут.
Используемый в эксперименте синтетический препарат — генистеин, синтезированный в НПЦ «Фармзащита» ФМБА России, представлял собой кристаллический порошок светло-желтого цвета. В связи с этим, перед введением лабораторным животным генистеин предварительно растворяли в 50 % растворе ПЭГ-400 при нагревании и одновременном размешивании. Растворы генистеина готовили непосредственно перед их введением мышам. Препарат вводили животным в дозах 500, 1000 и 1500 мг/кг. Объем вводимого животным раствора генистеина составлял 0,2 мл на 10 г массы тела животного. Живот-
ным контрольной группы тем же способом и в том же объеме вводили растворитель.
В соответствии с [3] проводили оценку острой токсичности генистеина при различных путях введения, а также в зависимости от гендерной и линейной чувствительности. Исследование предусматривало оценку токсичности изучаемого вещества при поступлении в организм путями, адекватными реальным условиям применения у человека: внутрижелудоч-но (в/ж) через зонд, подкожно (п/к) в основании складки области пояса передних конечностей и внутрибрюшинно (в/б). Препарат лабораторным животным при всех способах введения вводили однократно, но в ходе отдельного эксперимента было произведено повторное (с интервалом 3 ч) двукратное введение препарата.
Полученные в ходе экспериментальных исследований данные подвергали стандартной статистической обработке на персональном компьютере с использованием программы «NCSS 2007» для операционной среды «Windows». На основании данных по выживаемости мышей методом пробит-ана-лиза по Финни [2] определяли LD16, LD50 и LD84. Результаты расчета показателей острой токсичности представляли в виде X ± mx, где Х - средняя, mx - ошибка среднего.
Результаты и обсуждение. В ходе исследования были получены дозозависимые показатели летальности экспериментальных животных, которые отражены в табл. 1.
Стоит отметить, что гибель животных при различных путях введения раствора генистеина в высоких дозах (начиная с 500 мг/кг) наблюдалась в основном в течение 1-2 сут. Клиника интоксикации характеризовалась быстрым развитием заторможенности и одышки, у животных появлялась атаксия при передвижении. Затем следовало резкое ухудшение состояния - отмечалась адинамия, животные слабо реагировали на внешние раздражители (звук, прикосновение), появлялся тремор хвоста и конечностей. При нарастании интоксикации развивались приступы судорог. Выраженные тонико-клониче-ские судороги наблюдались у 20 % мышей, получавших генистеин в дозе 1500 мг/кг. Непосредственно перед наступлением летального исхода у животных наблюдалась арефлексия, дыхание становилось редким, поверхностным и аритмичным, затем наступало апноэ, а через несколько минут происходила остановка сердца. У некоторых животных гибель наступала на фоне опистотонуса.
Клиника интоксикации среди животных, погибших после введения высоких доз генистеина, не имела гендерных отличий. Гибель самцов и самок белых нелинейных мышей, так же как и самцов мышей гибридов F1 линии (CBA x C57B1) после введения летальных доз генистеина наблюдалась в 1-2 сут.
При наружном осмотре животных, умерших в первые часы
после введения генистеина, отмечался цианоз слизистых оболочек ротовой полости и языка. При вскрытии погибших мышей наблюдались признаки нарастающего отека мозга, внутренние органы были полнокровны.
У большинства переживших интоксикацию животных в течение 1 сут наблюдалась выраженная гиподинамия и снижение потребления корма и воды. Начиная со 2-х сут поведение мышей, получавших генистеин, не отличалось от интактных животных. Масса тела животных всех экспериментальных групп в течение всего эксперимента не отличалась от животных контрольной группы и интактных мышей. Кроме того, в течение 14 сут наблюдения не было выявлено значимых различий по поведению, клиническим проявлениям и массе тела у выживших животных, получавших генистеин, в зависимости от пола или линии мышей.
На основании полученных данных по выживаемости (табл. 1) расчетным методом [2] были найдены показатели летальных доз LD16, LD50 и LD84 для животных, получавших генистеин. В таблице 2 приведены значения показателей острой токсичности генистеина в зависимости от способа введения препарата, линейной принадлежности и пола исследуемых мышей.
Как видно из приведенных в табл. 2 данных, значимых различий по показателю среднелетальной дозы при однократном введении между белыми нелинейными мышами обоего пола, а также среди самцов-гибридов F1 линии (СВА х С57В1) экспериментальных животных не выявлено. Кроме того, установлено, что способ и кратность введения препарата также не оказывают существенного влияния на показатели острой ток-
сичности.
В соответствии с [1] для малотоксичных веществ LD50 превышает 5000 мг/кг, для умеренно токсичных соединений сред-нелетальная доза лежит в интервале от 151-5000 мг/кг, значения LD50 от 15 до 150 мг/кг характерны для высокотоксичных соединений, а классу чрезвычайно токсичных веществ соответствуют дозы ниже, чем 15 мг/кг. Учитывая, что при вну-трижелудочном введении LD50 генистеина для экспериментальных животных составила от 2210 ± 1053 до 2525 ± 1560 мг/кг, по степени токсичности исследуемое соединение можно отнести к III классу - вещества умеренно токсичные.
Выводы: 1. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что изученный синтетический отечественный генистеин относится к классу умеренно токсичных веществ.
2. В ходе экспериментального исследования острой токсичности генистеина гендерных различий у экспериментальных животных не обнаружено.
Таблица 1
Показатели летальности мышей при различных путях введения генистеина
Схема введения Вид и пол животных контроль (растворитель) Доза препарата, мг/кг
500 1000 1500
Внутрибрюшинно Самцы белых нелинейных мышей 1/12 (8,3) 3/12 (25,0) 2/12 (16,6) 8/12 (66,6)
однократно Самки белых нелинейных мышей 0/6 (0,0) 1/6 (16,6) 1/6 (16,6) 4/12 (33,3)
Подкожно Самцы белых нелинейных мышей 1/12 (8,3) 1/12 (8,3) 2/12 (16,6) 6/12 (50,0)
однократно Самки белых беспородных мышей 1/6 (16,6) 1/6 (16,6) 1/6 (16,6) 2/6 (33,3)
Самцы белых нелинейных мышей 0/12 (0,0) 0/12 (0,0) 2/12 (16,6) 4/12 (33,3)
Внутрижелудочно однократно Самки белых нелинейных мышей 0/6 (0,0) 1/10 (10,0) 2/12 (16,6) 4/6 (66,6)
Самцы гибридов F1 линии (СВА х С57В1) 1/12 (8,3) 2/12 (16,6) 2/12 (16,6) 6/12 (50,0)
Внутрижелудочно повторное введение Самцы белых нелинейных мышей 1/12 (8,3) 1/12 (8,3) 2/12 (16,6) 2/12 (16,6)
Примечание: в числителе - количество погибших животных, в знаменателе - общее число особей в группе, в скобках - летальность, %
Токсикологический вестник №б (117)
Таблица 2
Показатели острой токсичности генистеина для мышей при различных путях введения
Схема введения Вид и пол животных Летальные дозы, мг/кг
^50 LD84
Внутрибрюшинно однократно Самцы белых нелинейных мышей 562 ± 130 1473 ± 1288 3860 ± 1605
Самки белых нелинейных мышей 607 ± 250 1361±442 3052 ± 2283
Подкожно однократно Самцы белых нелинейных мышей 894 ± 128 1581±323 2797± 1104
Самки белых нелинейных мышей 902±106 1612±204 2834±1205
Внутрижелудочно однократно Самцы белых нелинейных мышей 878 ± 192 2267± 1162 5858±5951
Самки белых нелинейных мышей 907± 212 2525 ± 1560 7029±8521
Самцы гибридов F1 линии (СВА х С57В1) 653 ± 179 2210± 1053 7478±7461
Внутрижелудочно повторное введение Самцы белых нелинейных мышей 1181±277 2982±921 8907 ± 6074
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ГОСТ 12.1.007-76 «Межгосударственный стандарт. Система стандартной безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности». - М.: ИПК «Стандарт», 1999. - 4 с.
2. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. - М.: Издательство РАМН, 2000. - 52 с.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У Хабриева - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.
4. Bhata A.L. Radiation protection by an isoflavone, genistein: a study on the survivability of mice / A.L. Bhata, A. Gaur, A. Sharma // Nucl. Technol. Radiat. Protection. - 2007. - № 1. - P. 34-39
5. Burda S. Antioxidant and antiradical activities of flavonoids / S. Burda, W. Oleszek // J. Agric. Food Chem. - 2001. - V 49. - P. 2774-2779.
6. Hussain M. Soy isoflavones in treatment of prostate cancer / M. Hussain, F. Sarkaf, Z. Djuric // J. Nutr. - 2002. - V 132. - P. 575-576.
7. Kim N.Y. Antioxidant and antigenotoxic activities of Korean fermented soybean / N.Y. Kim, E.J. Song, D.Y. Kwon et al. // Food Chem. Toxicol. - 2008. - V 46. - P. 1184-1189.
8. Landauer M.R. Protection against lethal irradiation by genistein / M.R. Landauer, S.V. Srinivasan, A. Shapiro et al. // Int. J. Toxicol. - 2000. - V 19. - P. 37-43.
9. Persky VW Effect of soy protein on endogenous hormones in postmenopausal women / VW. Persky, M.E. Turyk, L. Wanget et al. //Am. J. Clin. Nutr. - 2002. - V 75. - P. 145-153.
10. Rishi R.K. Phytoestrogens in health and illness // Ind. J. Pharmacol. - 2002. - V 34. - P. 311-320.
11. Shim H.Y. Genistein-induced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells involves calpain-caspase and apoptosis signaling kinase 1-p38 mitogen-activated protein kinase activation cascades / H.Y. Shim, J.H. Park, H.D. Paik et al. // Anticancer Drugs. - 2007. - V 18. - P. 649-657.
12. Squadrito F. Effect of genistein on endothelial function in postmenopausal women: a randomized, double-blind, controlled study / F. Squadrito, D. Altavila, A. Crisafulli et al. // Am. J. Med. - 2003. - V 114. - P. 470-476.
13. The guide for care and use of laboratory animals. - Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. - 140 p.
14. Zhou Y. Genistein stimulates hematopciesis and increased survival in irradiated mice / Y. Zhou, M. Mi // Radiat. Res. - 2005. - V 46. - P. 425-433.
Grebenyuk A.N.1, Basharin V.A. 1, Tarumov R.A. 1, Nazarov V.B. 2, Kovtun V.Yu. 2, Chikunov I,Ye.2 Experimental studies of genistein acute toxicity on small laboratory animals
'S.M. Kirov Military Medical Academy, St.Petersburg
2Scientific and Production Center «Farmzashchita», Federal Medico-Biological Agency, town Khimki, Moscow region
An experimental evaluation of acute toxicity of domestic synthetic isoflavonoid genistein was conducted in males and females of outbred white mice and F1 mice -hybrid males, strain ( CBA x C57B1) at various routes of administration. It was established that the preparation under investigation refers to hazard class III- moderately toxic substances.
Материал поступил в редакцию 21.02.2012 г.
УДК 615.9:591.11
Влияние низких доз цианида калия на активность ферментов в нейтрофилах периферической крови крыс
Долгушин М.В.1, Хомуев Г.Д. 2
'НИИ биофизики ГУВПО Ангарской государственной технической академии Федерального агентства по образованию РФ
2Ангарский филиал УРАМН ВСНЦ ЭЧ СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека
П
ероральное введение цианида калия (КС^ в течение Ключевые слова: калия цианид, нейтрофилы, миелоперок-
месяца в ежедневных дозах 1,30 мг/кг (1/10 LD) и 0,65 сидаза, гидролазы, цитохимия.
мг/кг (1/20 LD50) индуцировало устойчивое ингибиро-вание миелопероксидазы при параллельной стимуляции кислой фосфатазы, а также фазовые дозозависимые изменения в активности щелочной фосфатазы и неспецифической эстера-зы. Дозозависимые различия в реакции гидролаз наблюдались и в восстановительный период, через 10 дней после прекращения воздействия.
Введение. Неорганические цианистые соединения применяются в различных отраслях промышленности: в производстве резины, пластмасс, красителей, в гальванопластике, извлечении драгоценных металлов из руд, а также в качестве средств очистки металлов [10]. В связи с этим по-прежнему представляют интерес как экспериментальные, так и натурные исследования по выявлению ранних морфофункцио-нальных изменений в системе крови при продолжительном воздействии цианидов на организм в относительно низких (сублетальных) дозах и концентрациях [11, 17, 18].
К перспективным способам оценки влияний токсикантов в производственных и экспериментальных условиях, вклю-
чающих относительно слабую интенсивность экспозиции, относится цитохимический анализ активности ферментов в ней-трофилах периферической крови [9, 12]. В случае с цианидами следует, прежде всего, учитывать возможность ингибирую-щих (специфических) сдвигов исходя из присущей циан-иону способности к образованию прочных комплексов с биогенными металлами — кофакторами и активаторами ферментов [6]. Кроме того, цитохимическая оценка гидролаз, локализованных в различных типах гранул, обладающих дифференцированной способностью к функциональной мобилизации, играет существенную роль в выявлении неспецифических метаболических изменений в нейтрофильных лейкоцитах [1, 2].
