CC BY
37
УДК 615.37:616-018.74-008.6
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ
ДИСФУНКЦИИ КАРДОСТИНОМ
© Белоус А.С.1’3, Артюшкова Е.Б.1, Трубникова Е.В.2, Лавриненко К.И.3
1 НИИ экологической медицины, 2 кафедра биологии, медицинской генетики и экологии, 3 кафедра фармакологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: a.s.belous@mail.ru
Моделирование дефицита оксида азота введением L-NAME крысам приводило к развитию артериальной гипертензии и эндотелиальной дисфункции. В условиях этой модели были выявлены выраженные эндотелио- и кардиопро-тективные свойства сверхмалых доз антител к эндотелиальной NO-синтазе (импаза) и сверхмалых доз антител к C-концевому фрагменту АТ1 рецептора ангиотензина II (кардостен), проявляющиеся в большей степени при их совместном введении (кардостин). Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать применение кардо-стина для профилактики и коррекции эндотелиальной дисфункции как основного патогенетического звена сердечнососудистых заболеваний.
Ключевые слова: импаза, кардостен, кардостин, оксид азота, L-NAME.
EXPERIMENTAL RESEARCH OF CORRECTING THE ENDOTHELIAL DYSFUNCTION WITH CARDOSTIN
Belous A.S.1’3, Artyushkova E.B.1, Trubnikova E. V.2, Lavrynenko K.I.3
1 Ecological Medicine SRI, 2 Department of Biology, Medical Genetics and Ecology, 3 Department of Pharmacology
of Kursk State Medical University, Kursk
Modeling of nitric oxide deficiency with introducing L-NAME to rats led to the development of the arterial hypertension and endothelial dysfunction. This model revealed the expressed endothelial- and cardio protective properties of minute doses of antibodies in relation to endothelial NO-sinthase (Impaza) and minute doses of antibodies in relation to C-terminal fragment of angiotensin II АТ1 receptor (Cardosten), which declared themselves better at their combined introduction (Cardostin). The results of the conducted research allow recommending the application of Cardostin for preventive maintenance and correction of endothelial dysfunction as a basic pathogenetic part of cardiovascular diseases.
Keywords: Impaza, Cardosten, Cardostin, nitric oxide, L-NAME.
В России распространенность артериальной гипертензии среди взрослого населения превышает 30%. Наша страна занимает одно из первых мест в Европе по смертности от инсультов и ИБС [1, 2]. Артериальная гипертензия является одним из основных факторов, повышающих инвалиди-зацию и смертность за счет таких грозных осложнений, как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и инсульт [3, 4, 6].
В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия [5, 12].
Клетки эндотелия секретируют вазоактивные вещества, в том числе вазодилататоры (N0, эндотелиальный гиперполяризующий фактор, проста-циклин) и вазоконстрикторы (АТ II, эндотелин, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, простагландин F2a и тромбоксан А2), причем секреция вазодилататоров и вазоконстикто-ров в норме находится в состоянии динамического равновесия [7]. Наиболее важным вазодилата-тором считается оксид азота.
В настоящее время известны эндотелиопро-текторные свойства сверхмалых доз антител к
эндотелиальной К0-синтазе [4, 11], что является важным для профилактики и лечения сосудистых осложнений. Антитела в сверхмалых дозах (потенцированные антитела) к эндогенному регулятору (антигену) не подавляют активность молекулы, а напротив, модифицируют ее. Этот феномен, открытый О.И. Эпштейном, М.Б. Штарком, воспроизведен в экспериментальных исследованиях, проведенных в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАН как на молекулярном, так и на системном уровнях с рядом антител.
Целью настоящего исследования явилось изучение эндотелио- и кардиопротективных эффектов импазы, кардостена и кардостина на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на 70 половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 250-300 г. Животные были разделены на 7 групп по 10 животных в группе: группа № 1 интактные животные; группа № 2 с введением перорально через
зонд дистиллированной воды в объеме 9 мл/кг/сут. (ежедневно в дозе 4,5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней через 30 минут после введения L-NAME); группа № 3 с моделированием дефицита оксида азота внутрибрюшинным введением раствора N-нитро^-
аргининметилового эфира (L-NAME) в дозе 12,5 мг/кг в течение 28 дней. Группа 4 с моделированием дефицита оксида азота (дозы и способ введения L-NAME аналогичные группе №3) и одновременное в течение 28 дней введение дистиллированной воды (дозы и способ введения, аналогичные группе № 2).
Группы № 5-7 с моделированием дефицита оксида азота (дозы и способ введения L-NAME аналогичные группе №3) и одновременное в течение 28 дней введение импазы, кардостена и кардостина. Импазу (сверхмалые дозы антител к эндотелиальной NO-синтазе, производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг», Россия) и кардостен (сверхмалые дозы антител к C-концевому фрагменту АТ1 рецептора ангиотензина II, производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг», Россия) вводили внутрижелудоч-но из расчета 9 мл/кг/сут. (ежедневно в дозе 4,5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней через 30 минут после введения L-NAME). Кардостин (сверхмалые дозы антител к C-концевому фрагменту АТ1 рецептора ангиотензина II, сверхмалые дозы антител к эндотелиальной NO-синтазе, производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг», Россия) вводили внутрижелудочно из расчета 18 мл/кг/сут. (ежедневно в дозе 9 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней через 30 минут после введения L-NAME). Группа с моделью дефицита NO являлась контрольной. Группы № 2, 4 -дополнительные контрольные группы для оценки выраженности эффектов плацебо и ноцебо.
На 29 день эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) на первом этапе исследования вводили катетер в левую сонную артерию и регистрировали систолическое и диастолическое артериальное давление (АД), частоту сердечных сокращений. На втором этапе исследования вводили иглу в полость левого желудочка через верхушку сердца, для регистрации максимальной скорости сокращения и расслабления. Измерения производились и обрабатывались посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP100, производства Biopac System, Inc., США.
Помимо измерения артериального давления (АД) проводили ряд функциональных тестов с последующей оценкой изменения параметров систолического и диастолического артериального давления (САД и ДАД): эндотелий зависимая ва-зодилатация в ответ на внутривенное введение
раствора ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного, а также эндотелийнезависимая вазодилатация в ответ на внутривенное введение раствора нитро-пруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг из расчета
0,1 мл на 100 г массы тела животного [4, 8].
Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД) по формуле: КЭД = SАДнп/ SАДАХ, где SАДНп - площадь треугольника над кривой восстановления АД, причем точками меньшего катета являются точка максимального падения АД и точка выхода уровня АД на плато при проведении функциональной пробы с введением нитропрус-сида, SАДАХ - площадь треугольника над кривой восстановления АД при проведении пробы с аце-тилхолином, причем за меньший из катетов принимают разность между точкой окончания бради-кардитического кардиального компонента и точкой восстановления АД. Этот показатель отражает изменение реактивности сосудистого русла при моделировании дефицита оксида азота и позволяет оценить степень коррекции эндотелиальной дисфункции [9, 10].
Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы: проба на адренореактивность (внутривенное введение адреналина гидрохлорида 1х105 моль/л, в дозе 0,1 мл/ 100 г) [4, 8], нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 с).
Для статистической оценки полученных данных использовали методы параметрической статистики. Значимость различий между группами определяли с помощью ^критерия Стьюдента для зависимых выборок. Достоверными считали различия между сравниваемыми значениями с уровнем значимости 95% (р<0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Блокада N0-синтазы при введении L-NAME вызывала развитие выраженной артериальной гипертензии. В группах животных, получавших дистиллированную воду, импазу, кардостен и кардостин, не выявлено снижение показателей исходных значений АД.
В контрольной группе на фоне введения L-NAME происходило увеличение соотношения эндотелийнезависимой к эндотелийзависимой вазодилатации, при этом КЭД составлял 3,5±0,5, в то время как у интактных крыс он составил -1,1±0,1 (таблица 1). Достоверных различий между значениями КЭД у интактных животных и у животных с введением дистиллированной воды не было. Также не было достоверных различий
Таблица 1
Показатели АД и КЭД при моделировании и коррекции L-NAME-индуцированного дефицита N0 (М±т, п=10)
Группа АД, мм рт. ст. ЧСС, уд/мин. КЭД
систолическое диастолическое
Интактные 139,2 ±5,4 104,2 ± 4,7 340±13 1,2 ± 0,1
Дистиллированная вода 137,7 ±3,7 ^ и 101,9 ± 4,3 ^ и 373±18 1,1±0,1 +, и
L-NAME (12,5 мг/кг) 28 дней 204,8 ± 10** 1б4,2 ± 5,9** 371±17* 3,5 ± 0,5**
L-NAME +дистиллированная вода 204,0 ± 8,9** 1б3,8 ± 4,8** 381±15* 3,5 ± 0,5**
L-NAME+импаза 201,1 ± б,7** 1б3,1 ± б** 377±8* 1,8 ± 0,2 +
L-NAME+кардостен 200,5 ± 9,2** 1б4,4 ± б,9** 394±10** 1,5 ± 0,2 +
L-NAME+кардостин 194,2 ± 4,9** 158,8 ± 3,7** 388±11* 1,4 ± 0,1 ^ и
Примечание: р<0,05 по сравнению с: * - интактными животными; + - контролем, и - импазой; р<0,001 по сравнению с: - интактными животными; ++ - контролем, ии - импазой.
Таблица 2
Влияние импазы, кардостена и кардостина на функциональные возможности миокарда при проведении нагрузочных проб на фоне моделирования L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции (М±т, п=10)
Группа Адренореактивность, мм рт. ст. Исчерпание миокардиального резерва, %
Интактные 199,8±9,9 93,9%
Дистиллированная вода 199,2±8,3 ++ 89,6% +^ и
L-NAME (12,5 мг/кг) 28 дней 281,1±б,5 ** 67,5 **
L-NAME+дистиллированная вода 280,2±б,9 ** 68% **
L-NAME+импаза 239,4± 13,8 + 105,6 ++
L-NAME+кардостен 237,9±9,1 + 102,1 ++
L-NAME+кардостин 219,5±11,8 + + 107,7 ++
Примечание: р<0,05 по сравнению с: * - интактными животными; + - контролем, и - импазой. р<0,001 по сравнению с: - интактными животными; ++ - контролем, ии - импазой.
между значением КЭД у животных с патологией и с коррекцией данной патологии дистиллированной водой.
В группе животных, получавших импазу, КЭД составил - 1,8 ± 0,2. Кардостен оказывал более выраженное эндотелиопротективное действие по сравнению с импазой, КЭД в этой группе оказался ниже - 1,5±0,2. Введение кардостина вызывало усиление эндотелиопротективного действия каждого из компонентов препарата, при этом КЭД в наибольшей степени приблизился к группе интактных животных - 1,4±0,1.
Полученные результаты свидетельствуют о коррекции эндотелиальной дисфункции импазой и кардостеном, при отсутствии существенного влияния на развитие артериальной гипертензии. Кардостин также не снижал АД, но оказывал более выраженное эндотелиопротективное действие.
При проведении пробы на адренореактив-ность в контрольной группе животных систолическое левожелудочковое давление оказалось значительно выше (281,1±6,5 мм рт. ст.) чем в группе интактных животных (199,8±9,9 мм рт.
ст.). Значения систолического левожелудочкового давления при проведении пробы на адренореак-тивность в группе с введением дистиллированной воды были на уровне значений группы интактных животных и достоверно не отличались от значений в данной группе. Введение дистиллированной воды на фоне введения L-NAME, при проведении данной пробы также не оказывало влияние на цифры систолического левожелудочкового давления.
Тогда как импаза снижал систолическое левожелудочковое давление до 239,4±13,8 мм рт. ст. Кардостен также предотвращал адренореак-тивность (табл. 2).
Кардостин в пробе на адренореактивность снижал абсолютные значения систолического левожелудочкового давления до уровня значений данного показателя у интактных животных -219,5±11,8 мм рт. ст.
В пробе на нагрузку сопротивлением рассчитывался показатель исчерпания миокардиального резерва, равный отношению прироста систолического левожелудочкового давления (на 5 с пережатия аорты) к приросту систолического левоже-
лудочкового давления (на 25 с пережатия аорты), выраженный в процентах.
В группе интактных животных этот показатель составил 93,9%, в контрольной группе -67,5%. В группе животных с введением дистиллированной воды данный показатель достоверно не отличался от значений группы интактных животных. Также не было достоверных различий между значениями контрольной группы и группы с дополнительным введением дистиллированной воды на фоне введения L-NAME.
У животных, получавших импазу и кардостен, данный показатель не только достоверно отличался от контрольной группы, но и превосходил значения у интактной группы на 105,6 % и 102,1% соответственно.
У животных с введением кардостина данный показатель составил 107,7%, что подтверждает более выраженное кардиотропное действие данного препарата.
Таким образом, результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие кардостина, выражающееся в снижении адренореактивности, падении систолического левожелудочкового давления при проведении пробы на нагрузку сопротивлением по сравнению с контрольными животными. В группах с дополнительным введением дистиллированной воды не выявлено кардиопротек-тивного действия.
Проведенные исследования обнаружили, что импаза, кардостен и кардостин обладают эндоте-лио- и кардиопротективными свойствами. Причем кардостин проявляет более выраженное энде-телио- и кардиопротективное действие.
Кроме того, полученные данные подтверждают концепцию патогенетически обоснованного подхода в коррекции дефицита N0, при котором учитывается фармакологическое действие на различные точки приложения на системном и органном уровнях. Коррекция дефицита N0 при введении импазы связана с активизацией по механизму обратной связи выработки контрантител к собственным антителам к еN0S для ликвидации дисбаланса при сниженном количестве еN0S. Механизм действия кардостена связан с влиянием на функциональную активность АТ1 подтипа рецепторов ангиотензина II в различных тканях за счет аллостерической модуляции связывания ангиотензина II с рецептором, уменьшая патологическое влияние ангиотензина II на сосудистый тонус.
В группах животных с введением дистиллированной воды не выявлено ее влияния на показатели функционального состояния сердечнососудистой системы, что может указывать на не-
выраженность эффектов плацебо и ноцебо в данных сериях экспериментов у крыс. В связи с тем, что эффекты плацебо и ноцебо в основном имеют психофизиологическую природу, то полученный результат вероятно связано с чистотой проведения эксперимента и отсутствием причинения страданий экспериментальным животным (крысам) при проведении всех необходимых манипуляций в течение всего эксперимента.
Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать применение кардостина для профилактики и коррекции эндотелиальной дисфункции как основного патогенетического звена сердечно-сосудистых заболеваний. Перспективным является изучение данного препарата в комбинации с классическими антигипертензив-ными препаратами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бажин М.Н. Уральская кардиологическая концепция: Новое в изучении гипертонической болезни: дайджест. - В. Пышма : МО В. Пышма, 2000. - 51 с.
2. Беленков Ю.Н., Мареев В.Ю., Агеев Ф.Т. Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента в лечении сердечно-сосудистых заболеваний (Кви-наприл и эндотелиальная дисфункция). - М. : Ин-сайт полиграфик, 2002. - 86 с.
3. Беленков Ю.Н., Чазова И.Е., Ратова Л.Г. Российское исследование по оптимальному снижению артериального давления (РОСА 2): два года наблюдения. Что в итоге? / Кардиоваскуляр. терапия и профилактика. - 2005. - № 6, ч. 1. - С. 4-14.
4. Белоус А.С., Покровский М.В., Покровская Т.Г, Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Пашин Е.Н., Жавберт Е. С. Коррекция эндотелиальной дисфункции препаратом импаза в комплексе с эналаприлом и лозартаном при моделировании дефицита оксида азота // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2009. - Прил. «Экспериментально-клиническая фармакология сверхмалых доз антител к эндогенным регуляторам функций». - С. 151-154
5. Булгак А.А., Мрочек А.Г., Гурин А.В. Вовлечение дисфункции сосудистого эндотелия в патогенез необратимых реперфузионных повреждений миокарда // Новости медико-биол. наук. - 2004. -№ 3. - С. 40-45.
6. Гогин Е.Е. Гипертоническая болезнь. - М. : Медицина, 1996. - 400 с.
7. Марко Х.М. Молекулярные механизмы дисфункции сосудистого эндотелия // Кардиология. -2005. - Т. 45, № 12. - С. 62-80.
8. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Белоус А.С., Артюшкова Е.Б., Пашин Е.Н., Дани-ленко Л.М., Корокин М.В., Корокина Л.В., Ма-лыхин В.А., Залозных Я.И., Брусник М.С., Жавберт Е. С. Сравнительное изучение потенциальных эндотелийпротекторов и препарата импаза при моделировании дефицита оксида азота // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -
2009. - Прил. «Экспериментально-клиническая фармакология сверхмалых доз антител к эндогенным регуляторам функций». - С. 154-158.
9. Покровский M.B., Кочкаров B.И., Покровская Т.Г., Гладченко М.П., Артюшкова Е.Б., Пашин Е.Н., Брусник М..B., Чулюкова Т.Н., Клявс Ю.П., Корнеев М.М., Зеленкова Т.И., Малыхин B.A., Белоус А.С., Залозных Я.И., Маяков А.И. Ыетодические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-Name-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте // Кубанский научный медицинский вестник. - 200б. - № 10 (91) - С. 72-77.
10. Способ оценки эндотелиальной дисфункции: заявка № 2005113243/14. МПК A61B 5/02 / Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Даниленко Л.М., Гладченко М.П.,
Залозных Я.И., Лазаренко Г.С., Приходько В.В., Пашин Е.Н., Железнова З.Т., Литвинов С.А., Тата-ренкова И.А., Новиков О.О., Новикова М.Ю., Ах-медзянова И.Н. - № RU 2301015; заявлено 04.05.2005 ; опубл. 20.06.2007, Бюл. № 17. - 5 с.
11. Эпштейн О.И., Штарк М.Б., Дыгай А.М., Сергеева С.А., Гольдберг Е.Д., Петров В.И, Воронина Т.А, Старостина М.В. Фармакология сверхмалых доз антител к эндогенным регуляторам функций. -М. : Издательство РАМН, 2008. - 336 с.
12. Katoh M., Egashira K., Mitsui T.Chishima S., Takeshita A., Narita H. Angiotensinconverting enzyme inhibitor prevents plasminogen activator inhibitor-1 expression in a rat model with cardiovascular remodeling induced by chronic inhibition of nitric oxide synthesis // J Mol Cell Cardiol. - 2000. - Vol. 32, N 1. - P. 73-83.
