CC BY
66
© Рудь Ю. П., "Майстренко М. I., Безусий О. Л, "Бучацький Л. П
УДК 576. 858
Рудь Ю. П., Майстренко М. I., Безусий О. Л, Бучацький Л. П
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ 1НФ1КУВАННЯ ДОВГОПАЛОГО Р1ЧКОВОГО РАКА (Pontastacusleptodactylus) В1РУСОМ 1НФЕКЦ1ЙНОГО ПАНКРЕАТИЧНОГО НЕКРОЗУ
1нститут рибного господарства НААН Укра'ши (м. КиГв) 'КиГвський нацiональний унiверситет iMeHi Тараса Шевченка
(м. КиГв)
Робота виконана в рамках НДР «Збереження бю-рiзноманiття та комплексне дослщження стратегiй адаптацiI фiто-, зоо- та вiробiоти Укра1ни з викорис-таннямбЫнформацмних технологiй», № держ. рее-страцп 11БФ 036-02.
Вступ. Вiрус iнфекцiйного панкреатичного некрозу (IPNV) належить до роду Aquabirnavirus роди-ни Birnaviridae i викликае гостре висококонтапозне захворювання у риб [4]. Найбтыш вразливими до вiрусу е мальки атлантичного лосося (Salmo salar), райдужно! форелi (Onchorhynchus mykiss) та голыця (Salvelinus fontinalis). Смертнiсты цих об'екпв аква-кулытури сягае понад 70 % [10]. 1нфекцмний панкре-атичний некроз дiагностуетыся здебiлышого у пред-ставникiв лососевих та деяких шших прiсноводних видiв риб. Але як свщчаты останнi лiтературнi данг збудник цыого захворювання був iдентифiкований й у морсыких видiв риб, як в природа так i в умовах аквакулытури [12]. IPNV характеризуемся високою стiйкiстю у водному середовищ^ а це забезпечуе зберiгання шфекцмного титру вiрусу та його тран-спортування у водоймах на значн вiдстанi вiд епг центру етзоотп [6,9]. До того ж, перехворiвши, риба залишаетыся носiем iнфекцiI, яка збертаетыся в ор-ганiзмi в латентному станг Механiзм передачi вiру-су - вертикалыний та горизонталыний, переносники (вектори) - не встановленг
Окрiм риб, IPNV був видтений вiд водних без-хребетних тварин, таких як двостулковi молюски хамаг7р1 Meretrix lusoria [7], мiдiя ю^вна Mytilus edulis i морсыкий гребЫецы Pecten maximus [8], та представниюв ракоподiбних - широкопалого рака A. astacus [8] i японсыко! тигрово! креветки Penaeus japonicus [3]. 1дентифкаци IPNV у безхребетних тварин передувала дiагностика вiрусу у водойм^ що в свою чергу супроводжувалосы локалiзацiею меж по-ширення вiрусу вiд джерела iнфекцiй - рибогоспо-дарсыких пiдприемств. Слiд зазначити, що у деяких випадках титр вiрусу в органiзмi безхребетних був вищим нiж у водi, а це може свщчити про репродук-щю вiрусу.
Разом з тим, на вщмшу вiд переважно! бiлышостi кра!н Захщно! бвропи в астакофаунi Укра'ши най-бiлы поширеними е представники роду Pontastacus, i, зокрема Р. leptodactylus [1]. Слщ зауважити, що представники даного роду вiдрiзняютыся вщ A. Astacus значно бтышою еврiбiонтнiстю, екологiчною
пластичн1стю та резистентнютю щодо ряду спе-циф1чних хвороб раюв. I оск1льки саме довгопалий рак може бути потенцмним переносником Bipycy на б1льшост1 територiI Укра!ни, передусiм викликае ш-терес доотдження можливостi репродукцiI вiрусу в його оргаызмг
Контроль iнфекцiйного панкреатичного некрозу мае велике значення для рибогосподарських пщ-приемств. В останн роки через розширення та ди-версифкацю аквакультури багато зусиль було по-кладено у вивчення бiологiчних властивостей IPNV та патогенезу захворювання [2]. Не виключенням е i дослщження способiв передачi вiрусу та його пе-реносникiв. Деякi воднi безхребетн тварини вияви-лись чутливими господарями, в яких можливо вщбу-ваеться вiрусна репродукцiя.
Метою дослiдження було дослщити репродук-цiю iзоляту IPNV "Карпати", видiленого вiд райдужно! форелi O. mykiss з рiчки Сiрет, ЧернiвецькоI об-ластi Укра'ши [11] в органiзмi довгопалого рака P. leptodactylus, як потенцмного переносника вiрусу.
Об'ект i методи дослщження. Для накопи-чення вiрусу шфекцмного панкреатичного некрозу iзоляту «Карпати» в умовах in vitro використовували культуру клггин RTG-2 (Rainbow Trout Gonad Tissue), культура отримана з тканини гонад райдужно! фо-релi O. mykiss. Культуру клггин RTG-2 культивували на поживному середови!^ MEM з додаванням 10 % шактивовано! ембрюнально! телячо! сироватки (ЕТС) FBS Gold (РРА, Австрiя) та антибютику гента-мiцину. Клiтини культивували у виглядi моношаро-вих культур у пластикових флаконах площею 25 см2 за температури 20°C з iнтервалом субкультивування 6-7 днiв. Перед iнфiкуванням, з флакоыв зливали поживне середовище, моношар клiтин промивали розчином Хенкса та додавали вiрусовмiсний мате-рiал. Адсорб^ю вiрусу проводили упродовж двох годин за температури 20°C. Пiсля адсорбци зливали вiрусовмiсний матерiал та додавали поживне середовище для пщтримки, у d<T^i якого було 2 % ЕТС. Упродовж експерименту проводили щоденну перевiрку стану дослiдних та контрольних флакоыв з метою виявлення цитопатично! дiI (ЦПД) вiрусу на кттини. Стан культури клiтин за морфолопчними ознаками та визначення шфекцмного титру вiрусу проводили на швертованому мiкроскопi.
Для експериментального ¡нф1кування довгопа-лого рака використовували культуральну рщину ¡н-фковано'У кштинно'У лш1'У RTG-2. Перед ¡нфкуванням ¡нокулят фтьтрували через шприцевий фтьтр з flia-метром пор 0,22 мкм (Sarstedt, ЬНмеччина) для вщо-кремлення клп"инних уламюв та бактерм. 3 ¡нокупя-ту робили 10-ти кратнп розведення для досягнення ¡нфекцмного титру Bipycy 103 0 Щ50/мл1. Для ¡н'екцй' використовували 0,2 мл BipycoBMicHoro матер1алу. Контрольну трупу тварин ¡нокулювали стерильним поживним середовищем. Ктьюсть особин довго-палого рака для ¡нфкування становила двадцять екземпляр1в, п'ятнадцять дослщних та п'ять контр-ольних. Раки утримувались по п'ять особин на аква-piyM. В aKBapiyMi мютилось 40 л води та аератор для пщтримування кисневого режиму. Тривалють доош-ду становила 35 дыв. Кожы 7 дшв з трьох дослщних раюв прижиттсво вщбирали зразки гемол1мфи для ¡дентифкаци Bipycy та визначення його ¡нфекцмно-го титру.
Для ¡дентифкаци Bipycy упродовж дослщу використовували метод зворотньоУ транскрипцй' та по-л1меразно'| ланцюгово'У реакцй' (ЗТ-ПЛР). РНК Bipycy видтяли як з гемол1мфи раюв, так i з купьтурально'У рщини кштин RTG-2 для пор1вняння ¡нфекцмного титру. Для видтення РНК IPNV використовували Haöip GenJet™ RNA Purification Kit (Thermo Scientific). Для синтезу кДНК з отриманих препарате РНК використовували Haöip RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). ЗТ-ПЛР здмснювали з використанням двох пар олконуклеотидних праймер1в, специф1чних до гену VP2 IPNV. Послщовнють праймер1в була такою: WB1 5'-CCGCAACTTACTTGAGATCCATTATGC-3\ WB2 5'-CGTCTGGTTCAGATTCCACCTGTAGTG-3', PrA1 5' - G AG АТСС ATTATGCTTCC AG А - 3', PrA2 5'-GACAG-GATCATCTTGGCATAGT-3'. Пару олконуклеотид1в WB використовували для iдентифiкацií Bipycy в орга-Hi3Mi pакiв, осктьки цi праймери характеризуються високою чутливютю [11]. Праймери PrA фланкують повноpозмipний вipycний ген VP2, що кодуе капсид-ний бiпок. Кiпькicть котй повноpозмipного гену VP2 cвiдчить про цтюнють сегменту А геному вipycy, а отже i про повноцкний вipiон. Тому саме олконукле-отиди PrA бупи використаш для визначення концен-тpацií вipycy в оргашзмах pакiв та кyпьтypапьнiй pi-диш iнфiкованих кпiтин RTG-2 з метою встановлення кфекцмного титру.
Амппiфiкацiю проводили на теpмоцикпеpi "96 Universal Gradient PEQ STAR" (PEQLAB, Нiмеччина). До складу pеакцiйноí cyмiшi входили наступи ком-поненти: 12,5 мкл DreamTaq™ Green PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific), олiгонyклеотиднi праймери (Metabion, Ымеччина) по 1 мкл кожного (20 пмоль/ мкл), 2 мкл кДНК та стерильна деюшзована вода до загального об'ему 25 мкл. Амплiфiкацiя складалась з 1 циклу Ыкубацп при 500С 15 хвилин, циклу попере-дньоí денатypацií при 940С (3 хвилини) та 35 цикшв денатypацií при 940С (30 секунд), вщпалу прайме-piв при темпеpатypi 600С (30 секунд), синтезу при 720С (1 хвилина) та додаткового останнього циклу
■ Дослщ ■ Контроль
Рис. 1. Смертшсть довгопалого рака P. leptodactylus, ¡нфшованого укра'Гнським ¡золятом IPNV "Карпати".
синтезу при 72°С (7 хвилин). П1сля ПЛР продукти анал1зували у 2%-му агарозному гел1 в ТАЕ-буфер1 (40 мМ TRIS-HCI, 20 мМ оцтова кислота, 1 мМ ЕДТА). Результати електрофорезу спостеркали пщупьтра-фюлетовим транстюмшатором. Анал1з електрофо-реграм та щтьнють продуючв ПЛР проводили за до-помогою програмного забезпечення TotalLab TL120 v2008.
Результати дослщжень та Ух обговорення.
При ¡нф1куваны BipycoM ¡нфекцмного панкреатич-ного некрозу довгопалого рака характеры ознаки захворювання не спостеркались упродовж всього експерименту. Раки були досить активними, реагу-вали на дотик. На 17-19 день теля ¡нфкування (д. п. i.) ктька особин довгопалого рака перестали реагу-вати на зовшшне подразнення, у них спостеркалась летарпя, a pyx KiHuiBOK провокувався ттьки пщнят-тям т\ла з води. Загибель ¡нфкованих особин довгопалого рака вщбувалась в перюд з 21-го по 23 д. п. i. Загинули чотири з п'ятнадцяти раюв у трьох дослщних групах. У контрольна rpyni Bci особини за-лишись живими. У контрольному варiантi раки були активним упродовж всього дослiду. Таким чином смертшсть довгопалого рака при експерименталь-ному iнфiкуваннi украУнським iзолятом IPNV "Карпати" з урахуванням загальноУ юлькост особин становила 26,6 ± 6,6 % (рис. 1).
Як показали результати наших дослщжень, украУнський iзолят вiрусу iнфекцiйного панкреа-тичного некрозу "Карпати" був щентифкований в органiзмi довгопалого рака методом ЗТ-ПЛР Ус експериментально iнфiкованi особини були позитивы на IPNV "Карпати", а от в контрольна грут вiрус не дiагностувався (рис. 2). Присутнiсть вiрусу в органiзмi рака вiдмiчалась як на 7 д. п. i., так i на кiнець дослщу (35 д. п. i.). Це свщчить про можливiсть вiрусу значний перюд часу акумулю-ватись в органiзмi рака та знаходитись в стан1 персистен^'У. Такий перебiг подм вiрусноУ iнфекцiУ нiяк не вплинув на стан бтьшост пiддослiдних тварин. По заюнченню експерименту дослщш раки, так як i контрольна продовжували активно рухатись,
12 3 4 S 6 ~> M 8 9 И K1 И 11 12 13
ЮОПф SOObp
Рис. 2. Iдентифiкацiя Bipycy iнфекцiйного панкреа-тичного некрозу iзолят "Карпати" в opraHi3Mi довго-палого рака P. leptodactylus методом ЗТ-ПЛР: 1-10 -зразки з експериментально шфшованих рaкiв; 11-13 - контрольна група нешфшованих рaкiв; К1 - контроль реакцм (Bci компоненти реакцм окрiм кДНК); К2 -позитивний контроль, культуральна рiдинa кштинноТ лшпRTG-2, шф^ованоГIPNV "Карпати".
Рис. 3. Визначення чутливост ПЛР для iдентифiкaцГГ повнорозм;рного гену VP2 IPNV "Карпати" в культу-рaльнiй рщиш кштин RTG-2.
Таблиця
Динамка шфекцшного титру IPNV "Карпати" в оргaнiзмi довгопалого рака P. leptodactylus
День пюля шф^вання 0 7 14 21 28 35
!нфекцмний титр, 1Д50/мл-1 103 103 103 103 102 102
реагувати на мехашчш подразнення та не проявляти будь-яких ознак захворювання.
3 метою встановлення ¡нфекцмного титру 1РЫ\/ "Карпати" в оргашзм1 довгопалого рака упродовж дослщу кожш 7 дшв вщбиралась гемол1мфа. Для пщрахунку ¡нфекцмного титру 1РЫ\/ "Карпати" ви-значали титр в1русу як в культур! кштин ЯТС-2, так \ в гемол1мф1 тддослщних раюв за допомогою деся-тикратних розведень препарат1в кДНК. На початку експерименту доза ¡нф1кування становила 103 1Д /
Результати наших дослiджень показали, що упродовж експерименту iнфекцiйний титр вiрусу в органiзмi довгопалого рака був сталим i коливався в межах 102-103 1Д50/мл-1 (табл.). Таю результати свщчать про довготривалу персистенцю вiрусу в органiзмi довгопалих раюв. Також, з огляду на ста-бшьнють iнфекцiйного титру упродовж експерименту можна стверджувати i про можливу репродукцiю вiрусу. Потрапивши в оргашзм, вiрус зустрiчаeться з захисними мехашзмами i його iнфекцiйний титр мае зменшуватись. Натомiсть, результати свщчать про стабшьнють iнфекцiйного титру на рiвнi 103 1Д50/мл-1. Щоправда такий низький рiвень вiрусного титру може свщчити i про лiмiтованiсть чутливих юштин, в яких можуть формуватись зр^ вiрiони.
Вiрус iнфекцiйного панкреатичного некрозу при-зводить до суттевих економiчних втрат при культи-вуванш лососевих видiв риб у всьому свт. Спалахи захворювань, спричинених !РЫУ, вiдбуваються на-вiть в краТнах з добре розвинутим лососiвництвом I цей факт, скорше за все пов'язаний з iмпортом риби та II iкри. В умовах сучасноТ аквакультури необхiдно проводити постiйний мошторинг популяцiй чутливих до вiрусу видiв риб та водойми, в яких вони культиву-ються. Контролю мае пщпягати й iмпортована риба та кра. Бiльш того, як показали результати наших дослщжень !РЫУ здатний збер^ати свою шфекцм-нiсть в оргашзмах iнших видiв тварин, зокрема без-хребетних, таких як довгопалий рак. Вживаючи в Тжу шфковану рибу, довгопалий рак може акумулювати вiрус в своему органiзмi та переносити його в межах ареалу свого юнування.
Висновки. При експериментальному шф^ванш смертшсть довгопалого рака становила 26,6 ± 6,6 %, при чому бшьшють пщдослщних тварин по заюнчен-ню дослiду продовжували активно рухатись, реагувати на мехашчш подразнення i не проявляти будь-яких ознакзахворювання.
Вiрус шфекцмного панкреатичного некрозу iзо-лят "Карпати" зберкае iнфекцiйний титр в оргашзм1 довгопалого рака A. astacus понад 35 дшв, що свщ-чить про потенцмну можливiсть цих тварин бути пе-реносниками !РЫУ.
Перспективи подальших дослiджень. Для встановлення внутрiшньоклiтинноТ локалiзацiТ вiру-су, а отже i для доведення його репродукцп в орга-нiзмi довгопалого рака P. leptodactylus, необхщно виконати електронно-мкроскотчне дослiдження ультратонких зрiзiв чутливих тканин. Цей метод дозволить диференцювати таю процеси, як акуму-ля^я, персистенцiя та репродукцiя вiрусу. Це буде предметом наших подальших дослщжень.
мл-1. Титр Bipycy в культуральшй рщиш ¡нфкованих кл1тин RTG-2 становив 1070 1Д50/мл 1. Такий в1русний титр в культуральшй рщиш визначався в розведенш 10 6 препарату kAHKIPNV "Карпати" (рис. 3). Тобто, десятикратш розведеня гемол1мфи довгопалого рака прямопропорц1йно вщображали в1русний титр в орган1змах шфкованих рак1в.
Лiтерaтyрa
1. Бродський С. Я. Piчковi раки // Фауна Укра!ни. - 1981. - Т. 26, Вип. 3. - Ки!в : Наукова думка. - 210 с.
2. Bandin I. Host range, host specificity and hypothesized host shift events among viruses of lower vertebrates / I. Bandin C. P. Dopazo // Veterinary Research. - 2011. - Vol. 42. - P. 67-83.
3. Bovo. G. Isolation of an IPN-like virus from adult kuruma shrimp (Penaeus japonicus) / G. Bovo, G. Cescha, G. Giogetti M. Vanelli // Bulletin of the European Association of Fish Pathologists. - 1984. - Vol. 4 (2). - P. 21-25.
4. Dixon P. F. Proposal for a fourth aquabirnavirus serogroup / P. F. Dixon, G. -H. Ngoh, D. M. Stone [et al.] // Archeves of Virol ogy. - 2008. - Vol. 153. - P. 1937-1941.
5. Haider M. Freshwater crayfish - a vector for infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) // M. Haider, W. Ahne // Diseases of aquatic organisms. - 1988. Vol 4. - P. 205-209.
6. Isshiki T. Infectivity of aquabirnavirus strains to various marine fish species / T. Isshiki, T. Nagano, S. Suzuki // Diseases of aquatic organisms. - 2001. - Vol. 46. - P. 109-114.
7. Lo C -F. The characteristics of the virus isolated from the gill Meterixlusoria / C -F. Lo, Y -W. Hong, S. -Y. Huang, C. -H. Wang // Fish Pathology. - 1988. - Vol. 23 (3). - P. 147-154.
8. Mortensen S. H. Persistence of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in scallops Pecten maximus / S. H. Mortensen. E. Bachere, G. L. Gall, E. Mialhe // Diseases of aquatic organisms. - 1992. - Vol. 12. - P. 221-227.
9. Robert M. B. Detection and quantitation of infectious pancreatic necrosis virus by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction using lethal and non-lethal tissue sampling / M. B. Robert, E. L. Scott, K. D. Arun // Journal of Virological Methods. - 2008. - Vol. 147. - P. 226-234.
10. Rodriguez S. J. Infectious pancreatic necrosis virus: biology, pathogenesis, and diagnostic methods. S. J. Rodriguez, J. J. Borrego, S. I. Perez-Prieto // Advanced in Virus Research. - 2003. - Vol. 62. - P. 113-165.
11. Rud Yu. P. Isolation of infectious pancreatic necrosis virus from wild-life rainbow trout onchorhynchus mykiss in western ukraine / Yu. P. Rud, M. I. Maistrenko, L. P. Buchatsky // Bulletin of Taras Shevchenko National University of Kyiv. Biology. -2013. - Vol. 64. - P. 63-65.
12. Zhe Z. Isolation, characterization and genome sequence of a birnavirus strain from flounder Paralichthys olivaceus in China / Z. Zhe, K. Fei, L. Zhengqiu [et al.] // Archives of Virology. - 2008. - Vol. 153. - P. 1143-1148.
УДК 576. 858
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ 1НФ1КУВАННЯ ДОВГОПАЛОГО Р1ЧКОВОГО РАКА (Pontastacus leptodactylus) В1РУСОМ 1НФЕКЦ1ЙНОГО ПАНКРЕАТИЧНОГО НЕКРОЗУ
Рудь Ю. П., Майстренко М. I., Безусий О. Л, Бучацький Л. П.
Резюме. В робот представлено результати експериментального шфкування довгопалого рiчкового рака Pontastacus leptodactylus вiрусом шфекцмного панкреатичного некрозу (украУнський iзолят "Карпати"), видтеного вщ райдужноУ форелi Onchorhynchus mykiss. Встановлено, що смертнють довгопалого рака ста-новила 26,6 ± 6,6 %, при чому бтьшють тддослщних тварин по заюнченню дослщу не проявляли будь-яких ознак захворювання. Вiрус збер^ае свою Ыфекцмнють в оргаызмм раюв P. leptodactylus понад 35 дыв, що свщчить про потенцмну можливють цих тварин бути переносниками IPNV
Ключовi слова: IPNV iзолят "Карпати", експериментальне Ыфкування, довгопалий рак.
УДК 576. 858
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИНФИЦИРОВАНИЕ ДЛИННОПАЛОГО РЕЧНОГО РАКА (Pontastacus leptodactylus) ВИРУСОМ ИНФЕКЦИОННОГО ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО НЕКРОЗА
Рудь Ю. П., Майстренко М. И., Безусый А. Л, Бучацкий Л. П.
Резюме. В работе представлены результаты экспериментального инфицирования длиннопалого речного рака Pontastacus leptodactylus вирусом инфекционного панкреатического некроза (украинский изолят "Карпаты"), выделенного от радужной форели Onchorhynchus mykiss. Установлено, что смертность длиннопалого рака составляла 26,6 ± 6,6 %, при чем большинство подопытных животных по окончанию опыта не проявляли никаких признаков заболевания. Вирус хранит свою инфекционность в организме раков P. leptodactylus свыше 35 дней, что свидетельствует о потенциальной возможности этих животных быть переносчиками IPNV
Ключевые слова: IPNV изолят "Карпаты", экспериментальное инфицирование, длиннопалый рак.
UDC 576. 858
Experimental Infection of Freshwater Crayfish (Pontastacus leptodactylus) with Infectious Pancreatic Necrosis Virus
Rud Yu. P., Maistrenko M. I., Bezusiy O. L., Buchatskiy L. P.
Abstract. Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) belongs to the family Birnaviridae and is an agent of an acute, contagious fish disease causing high mortality not only in juvenile salmonids but also in non-salmonid fishes. IPNV causes high mortalities followed by a life-long, chronic infection in the survivors. Persistently infected fish are asymptomatic that have virus in many visceral organs and can shed live virions.
The mechanism of transmission and the spread of fish viruses are not fully understood, it is known that fish acutely or chronically infected with IPNV excrete the virus via faeces and sexual products. Horizontal transmission of IPNV occurs via contaminated water or cannibalism, whereas vertical transmission takes place via eggs. Atypical host fishes and bloodsucking ectoparasites, as well as other aquatic organisms and fishery equipment, must also be regarded as sources of virus infections. Nothing is known about interactions between the freshwater crayfish and viruses pathogenic for fish. Therefore, we wondered whether freshwater crayfish could play a role in the epizootiol-ogy of IPN.
The reproduction of the Ukrainian isolate IPNV "Karpaty" was carried out in fish continuous cell cultures RTG-2. Infectious titer of IPNV in RTG-2 cell line was 1069-74 TCID50/ml. Freshwater crayfish P. leptodactylus were
experimentally infected with IPNV isolate "Karpaty" by injection of 0,2 ml with infective dose of 1030 TCID50/ml. Total amount of experimentally infected crayfish was fifteen. Genomic viral RNA was extracted from cell culture supernatant and crayfish organs and haemolymph using GeneJET™ RNA Purification Kit. The cDNA synthesis was conducted using RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit following the manufacturer's instructions. Then cDNA was subjected for PCR amplification.
IPNV was found in crayfish organs and haemolymph up to 35 days after infection (d. a. i.). The death of crayfish was noted in period of 21-23 d. a. i. The cumulative mortality of experimentally infected freshwater crayfish was 26,6 ± 6,6 %. The crayfish excreted IPNV into the water continuously that proved by PCR assay. By the method of RT-PCR the virus infectious titer was determined comparatively in RTG-2 cell culture supernatant with the highest virus titer and the haemolymph of crayfish during whole experiment using 10-fold dilutions assay. Our results showed that virus titer was continuously permanent in organisms of freshwater crayfish. The infective doses of IPNV in crayfish haemolymph before and after experiment did not differ impressively. Thus the results of our research indicate that freshwater crayfish could play a role in the epizootiology of IPN by means of accumulation the virus during feed the died IPNV-infected fish, and consequently favor the virus transmission. Also for demonstration of introcellular localization of IPNV and its reproduction in crayfish internal organs and haemolymph the electron mi-croscopt observation is needed and such study aspect will be preemptive in our future research.
Since salmonids breeding is mainly located in the west region of Ukraine the IPNV is an economically important fish pathogen for national trout farms. The ways of transmission and potential virus sources are very burning items in disease prophilaxis, so rapid diagnostic of IPNV should be provided overall including all susceptible and non- susceptible fish species, other aquatic organisms and fishery equipment. Only complete monitoring of IPNV in Ukraine has to result in total data of virus distribution in Ukraine and also to identify another strains which are widespread in Europe.
Keywords: IPNV isolate "Karpaty", experimental infection, freshwater crayfish P. leptodactylus.
Рецензент - проф. ДубНН С. I.
Стаття надшшла 1. 08. 2014 р.
