CC BY
96
Экспериментальная пневмония, ассоциированная с новым видом РаетЬасШиэ эр. VI400, выделенным у пациентов с онкогематологическими заболеваниями
Г.В. Тец, М.Ф. Вечерковская, В.В. Тец
В представленном исследовании изучена патогенность и чувствительность к антибиотикам нового, ранее неизвестного вида спорообразующих бактерий рода РавтЪасШив, выделенных от больных с онкогематологическими заболеваниями. В геноме выявлены также гены резистентности ко многим, в том числе противоопухолевым, антибиотикам (туникамицин и блеомицин), используемым для лечения онкогематологических заболеваний. На примере животной модели показана способность этих бактерий вызывать пневмонию. Установлено, что изученный штамм представляет серьезную угрозу для пациентов с иммуносупрессией и может быть причиной развития фатальной пневмонии у млекопитающих.
Ключевые слова: неизвестные ранее бактерии, споры, РавтЪасШив, онкогематология, пневмония.
Лейкозы - группа заболеваний, ежегодно приводящих к гибели более 250 000 человек в мире [1]. Основной причиной смерти пациентов с онкогематологическими заболеваниями служат оппортунистические инфекции, которые развиваются на фоне иммуносупрессии. Одним из наиболее частых вариантов развития оппортунистических процессов является аспирация содержимого ротовой полости с последующим развитием пневмонии.
Таким образом, изучение микробного состава микрофлоры ротовой полости при различной патологии, особенно у пациентов с гематологическими заболеваниями, представляет важную задачу современной медицины. Молекулярно-генетические методы, основанные на идентификации микроорганизмов по сиквенсу 16S рибо-сомной РНК, позволили выявить в микробиоте ротовой полости более 700 различных видов микроорганизмов. В то же время известно, что эти
ГБОУ ВПО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" МЗ РФ.
Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, ст. науч. сотр.
лаборатории иммунологии Научно-исследовательского центра.
Мария Федоровна Вечерковская - канд. мед. наук, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.
Виктор Вениаминович Тец - профессор, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии.
методы обладают существенными недостатками, в связи с чем очевидно, что видовое разнообразие микроорганизмов полости рта на самом деле значительно выше. Одна из наименее изученных групп в составе микробиоты человека - споро-образующие бактерии.
Бактериальные споры устойчивы в окружающей среде и сохраняются при действии таких неблагоприятных факторов, как химические агенты, антибиотики, высокая температура, радиация и др. Таким образом, споры способствуют персистенции инфекции, а также обеспечивают длительное сохранение и перераспределение между микроорганизмами генетической информации, в том числе генов антибиотикоустойчи-вости.
В настоящей работе на модели пневмонии мы изучали особенности и патогенные свойства у нового вида Paenibacillus spp., получившего название Paenibacillus sp. VT 400, выделенного у детей с лимфобластными лейкозами [2].
Материал и методы
Штамм Paenibacillus sp. VT 400 был изолирован из слюны детей с онкогематологическими заболеваниями, проходивших лечение в НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой (Санкт-Петербург). Бактерии культивировали на колумбийском агаре с добавлением 5% эритроцитов барана (bioMerieux,
http://atm-press.ru
Практическая пульмонология | 2015 | № 3
71
Микробиология
Таблица 1. Основные гены антибиотикоустойчивости в геноме Paenibacillus sp. VT 400
CDS No. Устойчивость/функции CDS No. Устойчивость/функции
WP 047841924.1 WP_047840904.1 Фосмидомицин WP_047840788.1 Блеомицин
WP_047840644.1 Ванкомицин KLU53454.1 Аминогликозид/фосфотрансфераза
WP_047842579.1 Туникамицин KLU58081.1 Хлорамфеникол/ацетилтрансфераза
WP_047840788.1 Блеомицин WP 047844301.1 WP 047843841.1 WP_047843528.1 ß-лактамазы
WP_036615192.1 Транспортер макролидов WP_047840666.1 Цефалоспорин/гидролаза
KLU56813.1 D-аланин-D-аланин-лигаза WP_047841635.1 Тетрациклин
Обозначения: CDS - coding DNA sequence (кодирующая последовательность ДНК).
Франция) при температуре 37°C в течение 48 ч. Для приготовления инокулята для заражения мышей суспензию бактерий готовили в изотоническом фосфатном буфере (0,15 M, pH 7,2), определяя оптическую плотность по Мак-Фарланду.
Изучение генома проводили с помощью сервера RAST (Rapid Annotations using Subsystems Technology. BMC Genomics) [3] и программы Geneious R8 (Biomatters Ltd., США).
Чувствительность к антибиотикам определяли дискодиффузионным методом согласно критериям CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).
В качестве животной модели использовались мыши C57BL/6. Животных в исследуемой группе заражали 5,0 х 107; 5,0 х 108 или 5,0 х х 109 КОЕ/мышь, в контрольной группе использовали стерильный фосфатный буфер. Затем в течение 7 дней отслеживали состояние мышей и уровень смертности в каждой группе.
Результаты и обсуждение
Нами впервые был изолирован и описан новый вид бактерий Paenibacillus sp. VT 400, выделенный из слюны детей с лимфобластными лейкозами. Paenibacillus sp. VT 400 представляет собой грамположительную аэробную подвижную спорообразующую бактерию. В предыдущих исследованиях этот микроорганизм был изучен с использованием биохимической и протеом-ной идентификации, а также полногеномного сиквенса. Данные сиквенса размещены в базе нуклеотидных последовательностей GenBank под номером LELF01000000, а сам штамм депонирован в международной коллекции Института Лейбница "Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур" (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Германия) с присвоением номера DSM 100755 [2].
В ходе изучения генома у этих бактерий выявлено значительное число генов, кодирующих факторы патогенности - гемолизин D, протеа-
зы, хитиназы, фосфолипазы, ОБ4+-Т-клеточно-стимулирующий антиген, который характеризуется возможностью индукции токсического шока. Также обнаружены гены, кодирующие такие факторы вирулентности, как адгезины и компоненты жгутика.
Также мы выявили в геноме Paenibacillus sp. VT 400 значительное число генов антибиотикоустойчивости (табл. 1). Среди обнаруженных нами генов 96 принадлежат к суперсемейству MFS (major facilitator superfamily -суперсемейст во мембранных транспортеров), 18 - кодируют АТФ-зависимые транспортеры (АТФ - аденозинтрифосфат), 8 - кодируют белки-переносчики семейства MATE (multidrug and toxin extrusion protein - белки множественной устойчивости и выведения токсинов), 2 - относятся к семейству белков SMR (small multidrug resistance - множественной лекарственной устойчивости). Эти мембранные транспортеры контролируют и ограничивают поступление и выведение различных продуктов, опасных для микроорганизмов, в том числе антибиотиков.
Важно отметить, что белки, относящиеся к семейству SMR, характерны для микроорганизмов, вызывающих нозокомиальные инфекции, но ранее никогда не были идентифицированы у бактерий рода Paenibacillus. Мы также обнаружили гены устойчивости к ванкомицину (vanZ), фосфомицину (FosB), тетрациклину (TetA), три-метоприму, хлорамфениколу, циклосерину и бактериоцинам. Кроме того, в геноме выявлены гены резистентности к противоопухолевым антибиотикам, используемым для лечения онкоге-матологических заболеваний, - туникамицину и блео мицину.
При помощи дискодиффузионного метода мы проверили экспрессию генов антибиотико-устойчивости и установили, что на фенотипичес-ком уровне Paenibacillus sp. VT 400 устойчив к макро лидам (азитромицину и эритромицину), хлорамфениколу и триметоприму, что значи-
72
Практическая пульмонология | 2015 | № 3
http://atm-press.ru
Микробиология
тельно меньше числа генов антибиотикоустой-чивости, обнаруженных в геноме (табл. 2).
Это соответствует представлениям, что не все имеющиеся гены антибиотикоустойчивости экс-прессируются микроорганизмами. В то же время, учитывая тот факт, что РаетЬасШиэ эр. VT 400 является спорообразующей бактерией, обладающей значительным геномом (более 7 млн. пар ну-клеотидов), можно утверждать, что присутствие подобных микроорганизмов способствует сохранению значительного числа генов антибиотико-устойчивости в микробиоте.
Бактерии, колонизирующие ротовую полость, играют важную роль в развитии оппортунистических инфекций, в том числе пневмоний, у пациентов с иммунодефицитом [4].
Учитывая значительное количество обнаруженных нами в геноме РаетЬасШиэ эр. VT 400 факторов патогенности, мы провели исследование по оценке возможности данного микроорганизма вызывать пневмонии у млекопитающих. С этой целью мышам интраназально вдували от 5,0 х 107 до 5,0 х 109 КОЕ РаетЬасШив эр. VT 400 и оценивали выживаемость животных в течение 7 дней. Через 24 ч после введения микроорганизмов у всех животных отмечались признаки интоксикации, проявлявшиеся в гипертермии, учащенном дыхании, двигательном возбуждении, пилоэрекции, отрицательной динамике изменения массы тела, у некоторых животных было отмечено сужение глазной щели.
Выживаемость животных и выраженность интоксикации находились в прямой зависимости от количества введенных микроорганизмов. Гибель животных была зарегистрирована в группах, получивших 5,0 х 108 и 5,0 х 109 КОЕ РаетЬасШиэ эр. VT 400, и отсутствовала при меньшей микробной нагрузке.
Таблица 2. Чувствительность к антибиотикам Paenibacillus sp. VT 400
Антибиотик Чувствительность
Амоксиклав S
Ампициллин S
Пенициллин S
Ванкомицин S
Цефотаксим S
Эритромицин I
Хлорамфеникол R
Азитромицин I
Гентамицин S
Амикацин S
Канамицин S
Клиндамицин S
Ципрофлоксацин S
Неомицин S
Тетрациклин S
Триметоприм/сульфаметоксазол R
Обозначения: S - чувствителен; R - устойчив; I - промежуточная чувствительность.
Таким образом, идентифицированный нами новый вид микроорганизмов, получивший название Paenibacillus sp. VT 400, представляет серьезную угрозу для пациентов с иммуносупрес-сией, в том числе страдающих онкогематологи-ческими заболеваниями. Как было продемонстрировано на животной модели, Paenibacillus sp. VT 400 может быть причиной развития фатальной пневмонии у млекопитающих.
Список литературы
1. Jemal A. et al. // CA Cancer J. Clin. 2011. V. 61. № 2. P. 69.
2. Tetz G. et al. // Genome Announc. 2015. V. 3. № 4. pii: e00894-15.
3. Aziz R.K. et al. // BMC Genomics. 2008. V. 9. P. 75.
4. Salavert M., Calabuig E. // Med. Clin. (Barc.). 2010. V. 135. Suppl. 3. P. 36.
Продолжается подписка на научно-працтичесций журнал
"Лечебное дело" -
ПЕРИОДИЧЕСКОЕ УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ РНИМУ ИМ. Н.И. ПИРОГОВД
Журнал входит в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.
Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства "Роспечать" - 480 руб., на один номер - 240 руб. Подписной индекс 20832.
Подписку можно оформить в любом отделении связи России и СНГ. Редакционную подписку на любой журнал издательства "Атмосфера" можно оформить на сайте http://atm-press.ru или по телефону: (495) 730-63-51
V
г
73
