CC BY
25
«Вестник хирургии»*2010
ВОПРОСЫ ОБЩЕЙ И ЧАСТНОЙ ХИРУРГИИ
© Коллектив авторов, 2010 УДК 616.33/.34-089.819.843-092.9
О.В.Галимов, А.Ж.Гильманов, В.О.Ханов, Е.Н.Бирюкова, Т.Р.Ибрагимов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ АНАСТОМОЗОВ ПОЛЫХ ОРГАНОВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ПРЕПАРАТА «ЭНТЕРОСАН»
Кафедра хирургических болезней и новых технологий (зав. — проф. О.В.Галимов) ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» (ректор — чл.-кор. РАМН, проф. В.М.Тимербулатов), г Уфа
Ключевые слова: анастомоз, энтеросан, регенерация, гликозаминогликаны.
Введение. Одним из тяжелейших осложнений в раннем послеоперационном периоде после резекций и реконструктивных операций на полых органах брюшной полости является несостоятельность швов анастомоза. Согласно литературным данным, несостоятельность анастомоза развивается в 0,4-8% случаев [1, 4, 8], и приводит к развитию гнойно-септических процессов в брюшной полости при операциях на желудке и двенадцатиперстной кишке в 1,5-3% случаев, при операциях на тонкой — в 2,8-8,7% и на толстой кишке — в 4-32% [1, 4, 8, 9]. Многочисленные исследования, посвященные различным способам и методам профилактики несостоятельности анастомозов полых органов, основное внимание уделяют техническим аспектам формирования анастомозов полых органов [4, 6, 9, 11]. Вопросы регенерации и восстановления биопотенциала анастомозируе-мых органов и тканей изучены недостаточно [6, 8, 10]. Ранее исследовалось воздействие препарата «Энтеросан» (ВФС № 42-3412-99) в качестве средства для лечения билиарного слад-жа, гастрита, колита, синдрома мальабсорбции и других заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [3]. Действие энтеросана при хирургических вмешательствах не изучалось. Энтеросан относится к группе ферментов и антиферментов, оказывает комплексное действие на ЖКТ и его микрофлору. С помощью гликозаминогликанов, входящих в состав препарата, он активизирует течение окислительно-восстановительных процессов, связанных с внутриклеточным, пристеночным, внутриполостным пищеварением; адсорбирует патогенные микроорганизмы и их токсины, соли тяжелых металлов. За счет наличия панкреатических ферментов и желчи
способствует расщеплению белков и жиров, нормализует энтерогепатическую циркуляцию желчных кислот, оказывает бактериостатическое действие на кишечную флору и предупреждает развитие гнилостных процессов, нормализует моторику кишечника, снижает диспепсические явления, диарею. Сиаломуцины, как составные компоненты, оказывают энтеропротективное действие, восстанавливают преэпителиальный барьер, защищают от воздействия повреждающих факторов. Аминокислоты, входящие в состав энтеросана, являются источником биоактивности препарата, как стимулятора биохимических и иммунологических процессов, выражающихся в индукции биосинтеза ферментов аминокислотного обмена и иммунокорригирующих эффектов, усиления метаболических процессов в организме [2, 3].
Цель работы — изучить процессы заживления анастомозов полых органов желудочно-кишечного тракта при применении препарата «Энтеросан».
Материал и методы. С целью изучения процессов заживления анастомозов полых органов с применением энтеросана нами были проведены экспериментальные исследования на белых крысах линии Вистар породы Яийий norvegicus в возрасте 3-4 мес обоих полов. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с международными принципами Хельсинской декларации от 2000 г. о гуманном отношении к животным и приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г. Всего были прооперированы 90 крыс, 16 крыс пали на 1-3-и сутки после операций. Остальные 74 животных были разделены на 4 группы: 1-я группа — интактные — 6 крыс; 2-я группа — (контрольная группа) оперированные, которым внутрижелудочно вводили дистиллированную воду в эквивалентном энтеросану объеме — 32 крысы; 3-я группа — (опытная группа) оперированные 32 крысы, которым вводили энтеросан в дозе, согласно массе животного; 4-я группа (операционный фон) — оперированные (выведены из эксперимента через 5 ч после операции) — 4 крысы. Под наркозом у животных наложены однорядные анастомозы
Концентрация, мг/г
200
Сутки
-JO б?
Концентрация, мкмоль/г
8,1 8,2
_норма_
Сутки
/V
^ ¡9°
S? 1-е 2-е 3-и 5-е 7-е 10-е 15-е 20-е
б
Концентрация, мкг/мг
14
12
10
2
Сутки
^ 1-е 2-е 3-и 5-е 7-е 10-е 15-е 20-
Контрольная группа
Опытная группа
Динамика содержания белка (а), ГАГ (б) и РНК (в) в ткани кишки после наложения анастомоза «конец в конец».
«конец в конец» в области двенадцатиперстной кишки. Через 12 ч после операции животным по зонду внутрижелу-дочно вводили энтеросан в виде взвеси по 0,5 мл три раза в сутки в течение 20 дней. Энтеросан ежедневно готовили на дистиллированной воде. Выбранная доза соответствовала среднесуточной дозе взрослого человека с массой тела 70 кг. Суточную дозу пересчитывали согласно массе животного.
Известно, что воспалительные процессы, развивающиеся в ране, вызывают повышение содержания белка и гликозами-ногликанов (ГАГ) и понижение содержания рибонуклеиновой кислоты (РНК) [5, 7]. Для определения уровня ГАГ, РНК и белка брали кишечный анастомоз от каждой крысы. На гистологическое исследование были взяты животные из 2-й и 3-й группы на 3-, 7-, 15-е сутки после операции. Для морфологического исследования участки кишки с анастомозами фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по общепринятой методике. Для обзорного изучения анастомозов полых органов срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. Препараты просматривали под световым микроскопом при увеличении в 120 раз. Срезы готовили на микротоме LKB толщиной 5-7 мкм. Для определения РНК измельчённую на холоде навеску ткани (100-200 мг) помещали в центрифужную пробирку с 10 мл охлаждённого 0,2 н. раствора хлорной кислоты, тщательно перемешивали, и осадок отделяли центрифугированием на холоде. Центрифугат выливали, осадок промывали повторно хлорной кислотой, затем 5-10 мл охлаждённого спирта для удаления кислоты и два раза смесью спирта с эфиром (1:1) при комнатной температуре для удаления липидов и пигментов. Далее осадок обрабатывали эфиром и оставляли в вакуум-эксикаторе. Раздельное определение РНК в ткани проводили по методу Шмидта—Таннгаузера. Все операции проводили быстро и на холоде, чтобы избежать энзиматической и кислотной деструкции РНК. К высушенному материалу добавляли 0,75 н. раствор калия гидроксида (КОН) из расчёта 1 мл щёлочи на 100 мг сухого материала и проводили гидролиз при 37 °С в течение 18 ч. После гидролиза суспензию охлаждали до 0 °С и нейтрализовали хлорной кислотой (HClO4). К нейтрализованной смеси добавляли концентрированную HClO4 до конечной концентрации 1-2% и после интенсивного перемешивания смесь центрифугировали на холоде. После отделения супернатанта, содержащего рибомононуклеотиды, осадок дважды промывали 1 мл 2% раствора HClO4. Центрифугаты объединяли, нейтрализовали 40% раствором КОН по бромфеноловому синему и оставляли в холодильнике на 1-4 ч. Выпавший осадок перхлората калия (КС104) отделяли центрифугированием и удаляли, центрифугат использовали для определения общего содержания РНК спектрофотометрически. Общее содержание РНК определяли на спектрофотометре при 270 и 290 нм против контрольного раствора — 0,5 н. раствора HClO4. Содержание фосфора РНК в 1 мл исследуемого раствора рассчитывали по данным спектрофотометрии. Для определения содержания ГАГ в пробирку с образцом ткани доливали 2 мл 0,5 н. гидроксида натрия, перемешивали, нагревали на водяной бане при 100 °С 20 мин, охлаждали и нейтрализовали 2 н. соляной кислотой до рН 7. Осаждали белковые молекулы центрифугированием. В центрифужную пробирку наливали 0,5 мл исследуемой биологической жидкости и 2 мл охлажденного до 1-5 °С реактива 94% этанол, содержащий 9,8 г/л ацетата калия и 10,2 г/л уксусной кислоты. Осадок эмульгировали в 3 мл трихлоруксусной кислоты, и полученную смесь гидролизовали в кипящей водяной бане 30 мин, пользуясь каплеуловителем. Затем пробу охлаждали до 10-22 °С и центрифугировали. В надосадке определяли
а
2
0
8
6
4
в
Том 169 • № 2
Регенерация кишечных анастомозов в эксперименте
содержание глюкуроновых кислот. В 2 пробирках (одна из них контрольная), охлаждённых в воде со льдом, при перемешивании соединяли по 1 мл полученного надосадка и 5 мл реактива (концентрированная серная кислота, в состав которой входит 9,5 г/л кристаллического тетраборнокис-лого натрия. Пробы нагревали 10 мин в кипящей водяной бане и охлаждали до 10-22 °С. В опытную пробу добавляли 0,1 мл 0,01 М раствора карбазола в 16,1 М этаноле, а в контрольную — 0,1 мл 16,1 М этанола. Содержимое пробирок перемешивали, нагревали до 120-130 °С на кипящей водяной бане. Появлялось фиолетово-розовое окрашивание. Через 10 мин пробы фотометрировали на СФМ-Specord M40, длина волны 535 нм против концентрированной серной кислоты, в состав которой входит 9,5 г/л кристаллического тетрабор-нокислого натрия. Находили разность величин оптических плотностей опытной и контрольной пробы. Содержание ГАГ выражали через глюкуроновые кислоты в микромолях на 1 г ткани и пересчитывали на 1 г белка.
Определение содержания белка проводили биуретовым методом: концентрат биуретового реагента разводили дистиллированной водой в соотношении 1:19. В пробирки с контрольной, калибровочной и опытной пробой вносили по 5 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок тщательно перемешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего измеряли величину оптической плотности калибровочной и опытных проб против контрольной пробы при длине волны 540 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм [4, 7].
Результаты и обсуждение. При
вскрытии у всех оперированных животных на 1-3-и сутки в области операции имелся кровяной сгусток. У животных, получавших энтеросан, размеры его были меньше. Со 2-х по 5-е сутки на месте операции наблюдали гиперемию кишки. Более выраженную гиперемию, отёк и инфильтрацию тканей наблюдали в контрольной группе животных. С 5-х по 10-е сутки у всех крыс, не получавших энтеросан, наблюдали гнойный экссудат внутри просвета кишки и в брюшной полости. Такое состояние кишки в группе, получавших энтеросан, наблюдали только у одного животного на 7-е сутки. Начиная с 7-х суток до конца эксперимента в контрольной группе животных наблюдали выраженный спаечный процесс. С 10-х суток у крыс опытной группы состояние кишечника нормализовалось — цвет кишечника соответствовал цвету кишечника интактных животных. На 20-е сутки в группе животных, получавших энтеросан, линия анастомоза ни визуально, ни пальпаторно не определялась. В контрольной группе наблюдали образование грубого обезображивающего шишкообразного рубца. Гистологическое исследование показало, что на 3-и сутки значительных гистологических различий в сравниваемых группах не выявлено. На 7-е сутки у крыс опытной группы на препаратах видна начальная регенерация слизистой оболочки с « наползанием» эпителия на клеточный детрит по грануляционной ткани, тогда как в контрольной группе животных в обла-
сти анастомоза — только некоторое уменьшение некротических изменений на фоне продолжающейся формироваться грануляционной ткани. На 15-е сутки в опытной группе животных наблюдается эпителизация области анастомоза, некротические изменения не обнаружены. Максимальное повышение концентрации белка в тканях анастомоза в опытной группе произошло на 2-е сутки — (252,39± 16,85) мг/г и сохранялось на высоком уровне до 10-х суток, что может свидетельствовать об активности протекающих в этой ткани репаративных процессов (см. рисунок,
а). Нормализация концентрации белка произошла на 15-е сутки (75,55±3,39) мг/г, р=0,01. В группе контроля минимальная концентрация белка достигнута также на 15-е сутки и составила (107,79±5,06) мг/г (р=0,01) без тенденции к снижению. В опытной группе животных нормализация ГАГ до (8,53±0,65) мкмоль/1 г ткани (р=0,05) произошла на 7-10-е сутки (см. рисунок,
б), что свидетельствует об интенсивном биосинтезе коллагена в грануляционно-фиброзной ткани и связано с процессом интенсивной регенерации ткани. В контрольной группе сохранялся высокий уровень ГАГ (14,67±0,73) мкм/1 г ткани (р=0,001) на протяжении всего времени эксперимента. На 15-е сутки в группе контроля произошло резкое увеличение уровня ГАГ (14,68±0,94) мкмоль/1 г ткани (р=0,001), на наш взгляд, причиной этому послужили нарушения процесса репарации на стадии организации рубца. Уровень РНК у леченых животных пришел в норму на 5-7-е сутки и составил (10,1±0,67) мкг/мг (р=0,05), тогда как в контрольной группе только на 20-е сутки уровень РНК поднялся до (8,88 ±0,47) мкг/мг (см. рисунок, в).
Выводы. 1. Препарат « Энтеросан» обладает высокой активностью как стимулятор репаратив-ной регенерации.
2. Применение энтеросана в эксперименте снижает воспалительные изменения и вызывает ускорение процессов регенерации в зоне анастомоза.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Воробьёв Г.И., Минц Я.В., Веселов В.В. и др. Комплексная оценка заживления кишечных анастомозов в раннем послеоперационном периоде // Хирургия.—1989.—№ 2.—С. 47-51.
2. Гладских Л.В., Штукарева М.Ю. Органотерапия хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта препаратом «Энтеросан» // Кремлевская мед.—2002.—№ 1.—С. 34-37.
3. Гладских Л.В. и др. Клиническая эффективность Гепатосана и Энтеросана — медикаментозных препаратов на натуральной основе // Кремлевская мед.—2000.—№ 1.—С. 34.
4. Гончаренко О.В. Причины возникновения, патогенез и комплексная профилактика несостоятельности швов кишечника // Клин. хир.—1997.—№ 9-10.—С. 24-25.
5. Зимницкий А.Н., Башкатов С.А. Гликозаминогликаны в биохимических механизмах адаптации организма к некоторым физиологическим и патологическим состояниям.—М., 2004.-208 с.
6. Островский В.К. Выбор способа анастомоза при резекции кишки по поводу острых нарушений мезентериального кровообращения // Вестн. хир.—1992.—№ 1.—С. 98-99.
7. Северин С.Е., Соловьёва Г.А. Практикум по биохимии.—М., 1989.—С. 365-420.
8. Черноусов А.Ф., Хоробых Т.В., Антонов О.Н. Профилактика недостаточности анастомозов желудочно-кишечного тракта // Хирургия.—2005.—№ 12.—С. 25-29.
9. Шуркалин Б.К., Горский В.А., Леоненко И.В. Проблема надежности кишечного шва // Consilium med.—2004.— № 6.—С. 442-446.
10. Hesp W., Hendriks T., Schillngs P. et al. Histological features of wound repair: a comparison between experimental ileal and colonic anastomoses // Br. J. Exp. Path.—1985.—Vol. 6, № 6.—P. 511-518.
11. Martines M.E., Vazques P.A., Larrocha G.M. et al. The impact of low-residue enteral feeding on the healing of colonic anastomoses // Hepatogastroenterol.-1993.-Vol. 40, № 5.-Р. 481-484.
Поступила в редакцию 24.04.2009 г.
O.V.Galimov, A.Zh.Gilmanov, V.O.Khanov, E.N.Biryukova, T.R.Ibragimov
EXPERIMENTAL ASSESSMENT OF REPARATIVE REGENERATION OF ANASTOMOSES OF HOLLOW ORGANS OF THE GASTROINTESTINAL TRACT USING PREPARATION «ENTEROSAN»
The article gives an experimental assessment of processes of healing anastomoses of hollow organs using preparation «Enterosan». «Enterosan» decreases inflammatory alterations and accelerates processes of reparative regeneration in the anastomosis zone.
