CC BY
31
УДК 616.932:615/.372
А.В.Комиссаров, С.А.Еремин, Ю.А.Алешина, Ю.Г.Васин, О.Д.Клокова, Н.И.Белякова
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ ПО ПРИНЦИПУ «КРОСС-ФЛОУ» ДЛЯ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ О-АНТИГЕНА В ПРОИЗВОДСТВЕ ХОЛЕРНОЙ БИВАЛЕНТНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ
ФГУЗ « Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Показана возможность применения метода ультрафильтрации по принципу «кросс-флоу» для концентрирования О-антигена штамма холерного вибриона М-41 Огава из безмикробного центрифугата. Проведена оптимизация технологического процесса концентрирования. Отработаны режимы консервации и очистки ультрафильтра-ционной установки. Определены перспективы внедрения метода ультрафильтрации по принципу «кросс-флоу» в технологию производства холерной бивалентной химической вакцины.
Ключевые слова: вакцина холерная, О-антиген, концентрирование «кросс-флоу».
A.V.Komissarov, S.A.Eremin, Yu.A.Aleshina, Yu.G.Vasin, O.D.Klokova, N.LBeliakova
Experimental Evaluation of Application of “Cross-Flow” Ultrafiltarion Method for O Antigen Concentrating in Cholera Chemical Bivalent Vaccine Production
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Demonstrated is possibility to apply “cross-flow” ultrafiltration method for O antigen of Vibrio cholerae M-41 Ogawa concentrating from germ-free centrifugate. Technological process of concentrating was optimized. Worked out were the regimes of conservation and cleaning of the ultrafiltration device. The prospects of “cross-flow” ultrafiltration method introduction in technology of cholera chemical bivalent vaccine production were determined.
Key words: cholera vaccine, O antigen, “cross-flow” concentrating.
В связи с распространением холеры в мире в последние годы, особенно в развивающихся странах, ВОЗ рекомендует разработку и использование вакцинных препаратов орального применения. В настоящее время в Российской Федерации для вакцинации и ревакцинации населения по эпидемическим показаниям используют вакцину холерную бивалетную химическую таблетированную [1]. Отечественная химическая вакцина, состоящая из смеси холерогена-анатоксина и О-антигена холерного вибриона сероваров Инаба и Огава, не уступает по эффективности оральной химической вакцине WC-rBS, состоящей из убитых вирулентных клеток Vibrio cholerae О1 (классического биовара и Эль Тор; сероваров Инаба и Огава) и очищенной рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина [2].
Одним из недостатков существующей технологии производства отечественной холерной бивалентной химической вакцины являются многоступенчатые и затратные этапы выделения нативных антигенов. Данный недостаток частично был устранен разработкой масштабируемой технологии получения компонента холерных химических вакцин - О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах УВА-ПС-20-1040 [3]. Однако в настоящее время производство модулей УВА прекращено. Из всего многообразия современных ультрафильтра-ционных технологий наше внимание привлек метод концентрирования антигенов ультрафильтрацией по принципу «кросс-флоу». Данный метод успешно ис-
пользовался для концентрирования антигенов, выделенных из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus [4], протективного антигена сибиреязвенного микроба [5]. Использование мембранных модулей с разным размером пор позволяет концентрировать антигены с различной молекулярной массой. Все это определяет актуальность исследований, направленных на внедрение в производственный процесс новой технологии концентрирования антигенных компонентов холерной химической вакцины ультрафильтрацией по принципу «кросс-флоу».
Целью исследования было определение условий концентрирования ультрафильтрацией по принципу «кросс-флоу» О-АГ холерного вибриона серовара Огава из безмикробного центрифугата и оценка возможности использования этого метода в производстве холерной химической вакцины.
Материалы и методы
В работе использовали сухие фракции О-анти-гена и безмикробные центрифугаты, полученные при производственном выращивании штамма V. cholerae М-41 Огава. Серологическую активность О-антигена холерного вибриона определяли в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) по Оухтерлони и реакции непрямой агллютинации (РНГА) с О1-сывороткой. Определение формальдегида, перекиси водорода, величины рН и мутности проводили в соответствии с методами, изложенными в нормативной докумен-
S3
тации (Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96, 1998). Для концентрирования О-антигена применяли установку для микро- и ультрафильтрации на базе фильтродержателя АСФ-009 фирмы Владисарт, снаряженной мембранными модулями из триацетата целлюлозы с номинальной отсечкой по молекулярной массе 20 кДа, с площадью фильтрации равной 0,1 и 0,2 м2.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований определили скорость отведения фильтрата дистиллированной воды на не бывшем в эксплуатации мембранном модуле с площадью фильтрации равной 0,1 м2, которая составила (16,50±0,05) дм3 в час при давлении на входе и выходе фильтрационной установки - ФУ (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно.
Для оценки возможности концентрирования нативного О-антигена холерного вибриона, содержащегося в центрифугате после удаления клеточной биомассы, была выбрана следующая модель безмикроб-ного центрифугата: 5 г сухой фракции О-антигена, полученного при производстве вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, растворяли в 7 дм3 ферментативного казеинового гидролизата (0,2 % аминного азота, 0,5 % хлорида натрия и 0,05 % двузамещенного фосфата натрия), рН 7,6, что соответствовало содержанию О-антигена в без-микробном центрифугате, и добавляли формалин до конечной концентрации 0,2 %, что также соответствовало показателям качества безмикробного цен-трифугата, получаемого при производстве холерной химической вакцины. Критерием окончания процесса выбрали уменьшение объема смоделированного безмикробного центрифугата в 10 раз. Удаление примесей с молекулярной массой менее 20 кДа на первоначальном этапе проводили при давлении на входе и выходе фильтрационной установки (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно. Содержание О-анти-гена в смоделированном безмикробном центрифуга-те в РИД с О1-сывороткой составляло 1:8. Процесс концентрирования прошел за 5 ч. Полученный по-
луфабрикат имел следующие показатели качества: рН (7,5±0,1), титр О-антигена в РИД с О1-сывороткой 1:64. В фильтрате О-антиген не обнаружен.
С целью интенсификации процесса мембранного концентрирования О-антигена была проведена процедура «сканирования давления», заключающаяся в выборе оптимального соотношения давления на входе и выходе фильтрационной установки. Проведенные исследования показали, что оптимальными параметрами для концентрирования О-антигена являются: давление на входе (2,5±0,1) и на выходе (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно. Установленные параметры позволили сократить время концентрирования с 5 до 3 ч, при сохранении показателей качества определенных ранее. Для определения возможной сорбции О-антигена внутри пор мембранного модуля провели его отмывку через установку путем рециркуляции дистиллированной водой объемом 0,5 дм3. В концентрате О-антиген не обнаружен, это дает основания предполагать, что О-антиген не сорбируется на мембранном модуле.
Далее было необходимо отработать процесс очистки и консервации мембранных модулей и в целом установки для хранения между производственными циклами. Для очистки мембранных модулей после завершения процесса концентрирования использовали (5,5±0,5) % раствор перекиси водорода. Установлено, что обработка установки способом рециркуляции данным раствором продолжительностью 30-40 мин, с последующей отмывкой системы дистиллированной водой объемом 5 дм3 при давлении на входе и выходе фильтрационной установки (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно, не оказывает влияния на скорость отведения фильтрата и составляет по дистиллированной воде (16,50±0,05) дм3 в час. В пробах после промывки установки перекиси водорода не обнаружено. В качестве консерванта использовали (2,5±0,5) % раствор формальдегида. В ходе экспериментов установлено, что химическая обработка установки способом рециркуляции одного из указанных веществ продолжительностью (35±5) мин, с последующей отмывкой системы перед пуском в эксплуатацию дистиллиро-
Таблица 1
Характеристики концентрированных О-антигенов, полученных по экспериментальной и регламентной технологии
Реактор № 17 Реактор № 18
Показатель БМЦ концентрат фильтрат БМЦ концентрат фильтрат
Р Э Н Р Э Н Р Э Н Р Э Н Р Э Н Р Э Н
Содержание О-антигена в РИД с О1- 8 8 8 64 64 0 0 0 8 8 8 64 64 0 0 0
сывороткой, обратный титр Мутность (ОД) ,3 0, 0,3 0,55 0,05 0,06 0,04±0,02 0,31 0,31 0,49 0,06 0,06 0,04±0,02
рН 7,26 7,26 7,0±0,3 7,3 7,23 7,0±0,3 7,2 7,26 7,0±0,3 7,3 7,3 7,0±0,3 7,3 7,22 7,0±0,3 7,1 7,2 7,0±0,3
Примечание. БМЦ - безмикробный центрифугат, Р - значение показателя, полученного по регламентной технологии, Э - значение показателя, полученного в эксперименте, Н - нормируемое значение показателя в соответствии с регламентом производства, прочерк - требования отсутствуют.
Таблица 2
Характеристики сухих препаратов О-антигена, полученных по экспериментальной и регламентной технологии
Показатель Реактор № 17 Реактор № 18 H
Р Э Р Э
Активность О-антигена в РНГА с О1-сывороткой, обратный титр 112 256 224 256 >100
Объем диализованного препарата, мл 4320 220 4000 220 -
Вес сухого препарата, г 71 5 60 7 -
Примечание. Р - значение показателя, полученного по регламентной технологии, Э - значение показателя, полученного по экспериментальной технологии, Н - нормируемое значение показателя в соответствии с регламентом производства, прочерк - требования отсутствуют.
ванной водой объемом 5 дм3 при давлении на входе и выходе фильтрационной установки (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно, является оптимальным режимом консервации мембранных модулей и в целом установки. Остаточное содержание формалина в системе составляло от 0,001 до 0,007 %.
№ следующем этапе было проведено концентрирование безмикробных центрифугатов, полученных при производственном выращивании в ферментере холерного вибриона штамма V cholerae М-41 Огава. Технологические режимы концентрирования соответствовали определенным при процедуре «сканирования давления». Объем безмикробного центрифугата составлял 7 дм3. Концентрирование до 0,7 дм3 прошло за 3 ч, что соответствует данным, полученным ранее при концентрировании модельного безмикроб-ного центрифугата. Показатели качества препаратов О-антигена, определенные при проведении данного эксперимента, представлены в табл. 1. Их значения соответствуют нормируемым и не отличаются от полученных по регламентной технологии.
Далее концентрированные препараты О-антигена, полученные по традиционной и экспериментальной технологиям, были диализованы, простерилизованы и лиофильно высушены. Характеристики сухих препаратов О-антигена представлены в табл. 2, из данных которой можно сделать выводы, что значения показателей экспериментальных сухих препаратов О-антигена соответствуют нормируемым, а активность и выход (по соотношению веса сухого полуфабриката к объему диализованного препарата) превышают значения показателей препаратов О-антигена, полученных по регламентной технологии.
Известно, что концентрирование ультрафильтрацией по принципу «кросс-флоу» является линейно-масштабируемым процессом (по площади фильтрации) [6]. Использование ФУ с общей площадью фильтрации 0,2 м2 позволило нам сконцентрировать безмикробный центрифугат с 7 до 0,7 дм3 за 1,5 ч, что подтвердило данные литературы. Произведен расчет необходимой площади фильтрации для концентрирования 500 дм3 безмикробного центрифугата (количество продукта, полученного за один цикл выращивания штамма продуцента О-АГ холерного вибриона на двух производственных ферментерах) в 10 раз за 6 ч. Для концентрирования указанного объема
необходима установка с площадью фильтрации 4 м2.
Таким образом, определены условия концентрирования ультрафильтрацией по принципу «кросс-флоу» О-антигена холерного вибриона серовара Ога-ва из безмикробного центрифугата и показана принципиальная возможность внедрения этого метода в промышленную технологию производства холерной бивалентной химической вакцины.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. МедунщшН.В. Вакцинология. М.: Триада-Х; 2004. 448 с.
2. КутыревВ.В., Девдаршт З.Л., Саятна Л.В. Современное состояние научных исследований в области профилактики особо опасных инфекционных бактериальных инфекций. Пробл. особо опасных инф. 2006; 2(92):18-24.
3. Дятлов И.А., Hижегоpодцев С.А., Громова О.В. и др. Разработка ультрафильтрационной технологии получения О-антигена холерного вибриона для производства вакцин. Пробл. особо опасных инф. 2001; 2(82):133-9.
4. Егорова Н.Б., Семенов Б.Ф., Курбатова Е.А. и др. Поликомпонентная вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами. Патент РФ 2209081. Опубл. 27.07.2003.
5. Шевцов А.Н., Боpовcкuй Д.В., Дармов И.В. и др. Усовершенствование технологии получения сибиреязвенного протективного антигена. Биотехнология. 2009; 6:68-71.
6. Черкатв А.Н., Паcечнuк В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. Л.: Химия; 1991. 239 с.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1.MedunitsynN.V. [Vaccinology]. M.: Triada-X; 2004. 448 p.
2. Kutyrev V.V., Devdariani Z.L., Sayapina L.V. [Present status of the researches in the sphere of vaccine prophylaxis of particularly dangerous bacterial infections]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2006; 2(92):18-24.
3. Dyatlov I.A., Nizhegorodtsev S.A., Gromova O.V., Vasin Yu.G., Butov A.S., Kolova O.D., Beliakova N.I. [Development of ultrafiltration technology of cholera vibrio O antigen obtaining for vaccine production]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2001; 2(82):133-9.
4. Egorova N.B., Semenov B.F., Kurbatova E.A., Efremova V.N., Kaverina K.G., Mikhailova N.A. [Polycomponent vaccine for immunopro-phylaxis and immunotherapy of diseases caused by opportunistic microorganisms] RF Patent 2209081. 27.07.2003.
5. Shevtsov A.N., Borovskii D.V., Darmov I.V et al. [Improvement of technology of the anthrax protective antigen production]. Biotekhologia. 2009; 6:68-71.
6. Cherkasov A.N., Pasechnik V.A. [Membranes and Sorbents in Biotechnology]. L.: Khimia; 1991. 239 p.
Authors:
Komissarov A.V., Eremin S.A., Aleshina Yu.A., Vasin Yu.G., Klokova O.D., Beliakova N.I. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: microbe@san.ru
Об авторах:
Комиссаров А.В., Еремин С.А., АлешинаЮ.А., Васин Ю.Г., Клокова О.Д., Белякова Н.И. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru.
Поступила 03.02.10.
