CC BY
16УДК 582.281.21:611.24:599.323.4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ МУКОРМИКОЗА ЛЁГКИХ, ОБУСЛОВЛЕННОГО LICHTHEIMIA ORNATA
Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой), Босак И.А. (с.н.с.)*, Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Выборнова И.В. (н.с.), Степанова А.А (зав. лаб.), Авдеенко Ю.Л. (с.н.с), Чилина Г.А. (зав. лаб.)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Санкт-Петербург, Россия
Увеличение числа случаев мукормикоза лёгких у пациентов с им-мунодефицитами требует углубленного изучения патогенеза этого заболевания в экспериментальных моделях на лабораторных животных. Резистентность возбудителей мукормикоза к большинству из применяемых в клинической практике антимикотических лекарственных средств диктует необходимость разработки и доклинических испытаний новых противогрибковых препаратов in vivo. В статье описаны особенности разработанной экспериментальной модели мукормикоза легких у мышей: штамм возбудителя, подготовка животных к заражению, способ заражения. Приведены данные о динамике гибели животных и результаты культуральных и гистологических исследований лёгких мышей с инвазивным мукормикозом.
Ключевые слова: мукормикоз, иммунодефицит, иммуносупрес-сия, экспериментальные модели, лабораторные животные
EXPERIMENTAL MODEL OF PULMONARY MUCORMYCOSIS CAUSED BY LICHTHEIMIA ORNATA
Vasilyeva N.V. (director of institute, head of the department), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Stepanova A.A. (head of the laboratory), Avdeenko Y.L. (senior scientific collaborator), Chilina G.A. (head of the laboratory)
North-Western State Medical University named after
I.I. Mechnikov, Kashkin Research Institute of Medical Mycology,
St. Petersburg, Russia
The increasing number of pulmonary mucormycosis cases in patients with immunodeficiencies requires enhanced research of the disease pathogenesis in experimental models on laboratory animals. Resistance of mucormycosis etiologic agents to many antifungal drugs necessitates the development and preclinical testing of new antifungal agents. The paper describes the murine pulmonary mucormycosis model: fungal strain, procedure of animals preparing to infection, route of infection. Data on mice lethality and results of cultural and histological investigations of murine lungs with invasive mucormycosis is presented.
Key words: mucormycosis, immunodeficiency, immunosuppression, experimental models, laboratory animals
Контактное лицо: Босак Илья Алексеевич, e-mail: Ilya.Bosak@szgmu.ru
Мукормикоз (зигомикоз) - инвазивный микоз, обусловленный низшими нитчатыми грибами, относящимися к порядку Mucorales. В последние десятилетия частота мукормикоза существенно возросла. По данным аутопсий, в стационарах лечебных учреждений экономически развитых стран мукормикоз выявляют в 1-5 случаях на 10 000 вскрытий. У больных с факторами риска частота этого инвазивного микоза существенно выше. Так, например, у реципиентов трансплантатов аллогенного костного мозга она возрастает до 2-3%. Мукормикоз характеризуется чрезвычайно тяжелым течением, а без раннего хирургического лечения и активной антифунгальной терапии обычно заканчивается летально [1].
Основные факторы риска развития мукормикоза: трансплантация органов и тканей, высокодозная цито-статическая и иммуносупрессивная терапия, длительное применение глюкокортикостероидов и сахарный диабет. Уникальными факторами риска являются длительное применение дифероксамина при повторных гемотрансфузиях или алюминия при гемодиализе [2].
Мукоровые грибы распространены повсеместно, обитают в почве, встречаются в гниющих растительных отходах, некоторых пищевых продуктах. Возбудители мукормикоза резистентны к используемым в клинике азолам и эхинокандинам, исключение составляет позаконазол [1-4]. При лечении мукормикоза применяют также амфотерицин В.
Для изучения патогенеза мукормикоза, а также проведения доклинических испытаний новых анти-микотических препаратов in vivo необходимо разработать отсутствующую в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств [5] экспериментальную модель инвазивного мукормикоза легких, что и явилось целью данного исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штамм гриба. Для проведения заражения животных нами был отобран штамм Lichtheimia ornata (A.K. Sarbhoy) Alastr. - Izq. & Walter РКПГ F 1507, выделенный из биоптата пазухи носа пациента с лимфолейко-зом, хранящийся в Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ). Из трехсуточной культуры на агаре Сабуро готовили взвесь спор в стерильном 0,85% растворе NaCl концентрацией 1-107 КОЕ/мл.
Подготовка животных к заражению. В качестве экспериментальных животных были выбраны самцы беспородных белых мышей с массой тела 18-20 г. Для введения животных в состояние нейтропении вну-трибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 150 мг/кг четырёхкратно (-3, 0, 4 и 8 день)[6].
Процедура заражения. Заражение животных выполняли путём интраназального введения наркотизированным животным 50 ц1 взвеси спор гриба.
Культуральное исследование ткани легких. Оценку наличия гриба в ткани лёгких зараженных животных осуществляли путем посева тканей лёгких погибших мышей на среду Сабуро агар методом отпечатков. Посевы инкубировали при 37 °С в течение 5 суток и отмечали наличие роста колоний микромицета.
Гистологическое исследование легких. Кусочки легких мышей располагали в биопсийные кассеты, затем фиксировали в течение 6 часов 10% забуферен-ным раствором формалина, после чего биопсийные
кассеты с материалом помещали в аппарат для гистологической обработки биологических тканей Tissue-Tek'VIPTM 5Jr. для проведения проводки через серию изопропанола (IsoPrep). Последующую заливку в среду Biomix осуществляли с помощью модульной системы заливки Tissue-Tek'TECTM. Срезы получали на санном микротоме Slide 2003. Для описания характера воспалительной реакции срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Г-Э), а для выявления элементов гриба - по методу PAS и Гомори-Грокотт. Окрашенные срезы заключали в заливочную среду Bio Mount. Препараты изучали и фотографировали в световом микроскопе AxioLab.Al (фирма Zeiss, Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гибель животных в экспериментальной группе наблюдали, начиная с восьмого дня после заражения, а к восемнадцатому дню эксперимента фиксировали гибель всех зараженных мышей (Рис. 1).
Рис. 1 Выживаемость в группе зараженных экспериментальных животных.
При посеве тканей лёгких погибших животных на среду Сабуро агар во всех случаях был получен рост Ь. от&а.
При гистологическом исследовании в тканях легких через восемь суток после заражения были обнаружены разные по площади участки локализации гиф гриба. Последние широкие (10-12 мкм, Рис. 2 а, б, г), редко ветвящиеся под прямым углом (Рис. 2 б, стрелка). Гифы гриба в паренхиме легкого, в основном, располагались довольно плотно и параллельно относительно друг друга (Рис. 2 а, б, г), что характерно для тканевых форм мукоромицетов [7, 8]. В сосудах (Рис. 2 в, е) легких отмечены массивные скопления плотно и хаотично ориентированных гиф мукоромицета, диаметр которых был в 2 раза меньше (5-6 мкм) аналогичных, инфицирующих собственно ткань легкого мышей. Существенное сужение диаметра гиф гриба в сосудах, вероятно, свидетельствует о деструктивных
процессах в них. Также скопления гиф гриба выявляли в просветах бронхов и интерстиции (Рис. 2 д). Воспалительный ответ на микотическую инфекцию слабо выражен, представлен скудной нейтрофильной и лим-фоцитарной инфильтрацией, преобладают процессы альтерации.
ОБСУЖДЕНИЕ
По данным зарубежных авторов, Ь. ат^а по частоте и вирулентности является одним из трех видов микромицетов, вызывающих 80% всех случаев мукор-микоза [9]. Этот вид обнаружен и среди возбудителей инвазивного мукормикоза в России. Следует заметить, что видовая идентификация этого микромице-та, являющегося сиблинговым (близкородственным) видом для известного возбудителя мукормикоза Ь. сатутЫ/ета, по морфологическим признакам затруднена. Использованный нами для заражения штамм был идентифицирован методом ДНК-секвенирования. В нашем исследовании штамм Ь. атnata РКПГБ-1507 проявил высокую вирулентность для иммуносупрес-сированных животных: основная часть зараженных мышей (87,5%) погибли в течение пяти дней, с 8-го по 13-й день после заражения.
В разработанной нами ранее экспериментальной модели аспергиллёза легких у мышей [6] была отработана схема и доза для внутрибрюшинного введения циклофосфана с целью введения экспериментальных животных в стойкое состояние нейтропении. Данная схема иммуносупрессии показала эффективность и при заражении мышей мукоромицетами.
Интраназальный способ заражения оказался эффективным для развития мукормикоза лёгких у мышей и отличается низкой травматизацией животных в состоянии нейтропении.
Данные по выживаемости зараженных животных, а также результаты лабораторных (культуральных и гистологических) исследований свидетельствуют о наличии микотического поражения лёгких у зараженных животных. Разработанная нами модель инвазивного мукормикоза легких может быть использована для дальнейших научных исследований, испытаний новых лекарственных средств и методов диагностики.
Необходимо продолжить изучение патогенности для животных других возбудителей мукормикоза, а также влияние на течение патологического процесса применяемых в клинической практике антимикотиче-ских препаратов.
Данная работа выполнена в рамках Госзадания "Изучение морфо-биологических особенностей патогенных мукоромицетов - возбудителей микозов у пациентов с иммунодефицитом" (2019-2021 гг.).
ЛИТЕРАТУРА
1. Pana Z.D., Seidel D., Skiada A., et al. Invasive mucormycosis in children: an epidemiologic study in European and non-European countries based on two registries. BMC Infectious Diseases. 2016; 16 (1): 667.
2. Климко H.H. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 3-е изд., перераб и доп. М.: Фармтек, 2017: 272 с. [ Klimko H.H. Mikozy: diagnostika i lechenie. Rukovodstvo dlya vrachej. 3-e izd., pererab i dop. M.: Farmtek, 2017: 272 s. (In Russ)].
3. Schwartze V.U., Jacobsen I.D. Mucormycoses caused by Lichtheimia species. Mycoses, 2014; 57 (3): 73-78.
4. Chander J., Kaur M., Singla N., et al. Mucormycosis: Battle with the Deadly Enemy over a Five-Year Period in India. J. Fungi. 2018; 4 (2): 46.
5. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012: 944 с. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. CHast' pervaya. M.: Grif i K, 2012: 944
Рис. 2. Скопления гиф I. ornata (РКПГР-1507) в тканях легких мышей: а, б, г - гифы в паренхиме легких, в, е - скопления гиф вблизи и в просвете сосудов, д - скопления гиф гриба в интерстиции. Условные обозначения: Гф - гифы, Сд - сосуд, Сп - септа. а, б, в - Гомори-Грокотт, г - Г-Э. а, б, г - х1000; в, д, е - х400.
s. (In Russ)].
6. Васильева Н.В., Богомолова Т.С., Степанова А.А. и др. Особенности моделирования аспергиллёза легких у мышей в зависимости от вирулентности штаммов Aspergillus fumigatus. Проблемы медицинской микологии. 2014; 16 (2): 50. [Vasil'eva N.V., Bogomolova T.S., Stepanova A.A. i dr. Osobennosti modelirovaniya aspergillyoza legkih u myshej v zavisimosti ot virulentnosti shtammov Aspergillus fumigatus. Problemy medicinskoj mikologii. 2014; 16 (2): 50 (In Russ)].
7. Степанова А.А., Хостелиди С.Н., Аравийский Р.А. и др. Электронно-микроскопическое исследование Lichtheimia spp. in vivo и in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2012; 14 (4): 55-61. [Stepanova A.A., Hostelidi S.N., Aravijskij R.A. i dr. EHlektronno-mikroskopicheskoe issledovanie Lichtheimia spp. in vivo i in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2012; 14 (4): 55-61 (In Russ)].
8. Иоакимова К.Г., Степанова А.А., Богомолова Т.С. и др. Mucor species и его ассоцианты - Aspergillus spp. и Candida spp. при диссеминированном микозе у пациента с лейкозом. Проблемы медицинской микологии. 2013; 15 (3): 73-78. [Ioakimova K.G., Stepanova A.A., Bogomolova T.S. i dr. Mucor species i ego associanty - Aspergillus spp. i Candida spp. pri disseminirovannom mikoze u pacienta s lejkozom. Problemy medicinskoj mikologii. 2013; 15 (3): 73-78 (In Russ)].
9. Schwartze V.U., Hoffmann K., Nyilasi I., et al. Lichtheimia species exhibit differences in virulence potential. PLoS ONE. 2012; 7
(7).
Поступила в редакцию журнала 18.03.2019 Рецензент: В.С. Митрофанов
