CC BY
157
УДК 57.084.1:599.323.4-092.9:611.018.4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПРОЦЕССОВ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА
О.Л. Гребнева, МА. Ковинька, ТА. Силантьева, О.В. Дюрягина, Л.И. Сбродова, Е.И. Кузнецова, Л.В. Розова, М.В. Стогов, ЕА. Ткачук
ФГУ Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова Росмедтехнологий,
Курган E-mail: olgrebneva@bk.ru
EXPERIMENTAL MODEL FOR RESEARCH OF REPARATIVE OSTEOGENESIS PROCESSES
O.L. Grebneva, M.A. Kovinka, T.A. Silantieva, O.V. Dyuryagina, L.I. Sbrodova, E.I. Kuznetsova, L.V. Rozova, M.V. Stogov, E.A. Tkachuk
Russian Scientific Center of Restorative Traumatology and Orthopaedics n.a. acad. G.A. Ilizarov, Kurgan
Приведены экспериментальные данные морфологических, гематологических, иммунологических и биохимических исследований, характеризующие компенсаторно-адаптационные реакции белых лабораторных мышей линии СВА после моделирования травмы реберной кости. Доказано, что перелом реберной кости у животных вызывает умеренное напряжение адаптационных систем и приводит к стабильно воспроизводимой морфологической картине регенерации костной ткани. Исследования показали пригодность модели перелома реберной кости для экспериментальных исследований процессов репаративного остеогенеза и метаболического ответа на костную травму.
Ключевые слова: модель, репаративный остеогенез, лабораторные мыши.
Experimental findings of morphological, haemotological, immune and biochemical studies describing compensatory and adaptative response of lab CBA white mice following simulated rib injury have been reviewed. Rib fracture in animals has shown to cause moderate tensioning in adaptative response and results in stable reproducible morphological pattern of bone tissue regeneration. The findings have shown that the injured rib model can be applied to experimental study of reparative osteogenesis and metabolic response to osseous injury.
Key words: model, reparative osteogenesis, lab mice.
Введение августа 1977 г.).
^ Выполнение операции по моделированию перелома
Одним ш актуальных в°прос°в травматологии и ор- реберной кости у мышей. Перелом реберной кости у
топедии яктаегся тестиртганж ртмотных отошбш и мышей осуществляли под общим наркозом. Для этого
средств в жшртжнтшьк которое требует подкожно в область шеи инъецировали по 0,04 мл каж-
адекватной модели репаративного остеогенеза. Нами дого из препаратов Рометар и Золетил после их разведе-
была предложена м°дель пфегот реберной кости у ла- ния стерильной дистиллированной водой в 3 и 15 раз
б°раторных мышей. В доступной литературе нам не уда- соответственно. Готовили операционное поле в зоне ин-
лось найти описания такой хотя работы на тереса размером 1,5 см х 1,5 см, проводили разрез кож-
подобной модели цитируются [24]. Цель работы: харак- ного покрова длиной около 0,8 см по линии позвоноч-
теристика протекания репаративного остеогенеза при ного столба, после чего на расстоянии 3-4 мм от после-
моделировании перелома тела реберной костиу лабора- днего перерезали 4-е ребро. Операционную рану ушива-
т°рных мышей, а также динамики изменения биохими- ли узловыми швами шелком и обрабатывали клеем БФ-6.
ческих, гематологических и иммунологических показа- Исследования биологического материала.. Морфоло-
телей. гические исследования выполняли на биологических об-
разцах фрагментов реберных костей, извлеченных пос-Материал и методы ле эвтаназии животных через 10 и 30 суток после опера-
в г ции; количество животных (n) - от 8 до 10 в каждой груп-
В опытах был исследован материал от 464 белых мы-
„ пе. Образцы фиксировали в 10-процентном растворе
шей-самцов линии СВА массой 25-30 г. Уход за живот- . Ж
формалина, обезжиривали в ацетоне, декальцинировали
ными, эксперименты и эвтаназию проводили в соответ-
r r r г в Трилоне Б, обезвоживали и заливали в парафин. Гисто-
ствии с этическими нормами работы с лабораторными
логические срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гема-
животными, отраженными в Правилах проведения работ
токсилином и эозином. Светооптическое исследование
с использованием экспериментальных животных (при-
гистологических препаратов проводили на микроскопе каз №755 Министерства здравоохранения СССР от 12 v v v м v
“Микмед 5” (“ЛОМО”, Россия). Для выполнения гистомор-фометрического исследования на проекционном экране микроскопа Visopan (“Reichert-Jung”, Австрия) размещали тестовую систему в виде решетки с ячеями известной площади. В произвольно выбранных неперекрыва-ющихся полях зрения производили подсчет количества дифференцированных клеток хондробластического и ос-теобластического ряда в периосте, а также числа микрососудов в параоссальной области. Через 1, 3, 5 и 7 суток после операции (n=7^10) проводили гематологические исследования, включавшие подсчет количества лейкоцитов, эритроцитов в единице объема, лейкоцитарной формулы, ретикулоцитов в периферической крови. Иммунологические исследования (n=6^10) проводили спустя 1, 3 и 7 суток после операции. Они заключались в определении бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК) по методике С.А. Паевского в модификации [16, 20], лизоцимной активности сыворотки крови (ЛАСК) [22], фагоцитарной активности нейтрофилов по поглощению микробных клеток Staphylococcus epidermidis (штамм №9198 НИИЭМ) с подсчетом фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа [11]. Биохимические исследования сыворотки крови, проводимые спустя 3 и 10 суток после операции (n=6^21), включали спектрофотометрическое определение в сыворотке крови активности щелочной (ЩФ) и тартратрезистентной кислой фосфатаз (ТрКФ), содержания кальция, магния, фосфора и хлоридов, молочной кислоты (МК) с помощью наборов Vital Diagnostic (СПб), пировиноградной кислоты (ПВК) по методу Умбрайта [2]. Для всех перечисленных показателей были определены их величины у интактных животных, принятые в качестве контрольных.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкок-сона для независимых выборок. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным
0,05.
Результаты и обсуждение
На гистологических препаратах исследовали фрагменты тел реберных костей, включающие зону сращения перелома и прилежащие участки костных отломков. Спустя 10 суток после операции в интермеди-арной части зоны сращения перелома располагалась рыхлая, реактивно измененная волокнистая соединительная ткань, бесструктурные массы детрита. В периостальной части зоны сращения формировалась объемная костно-хрящевая мозоль (рис. 1А на 3-й стр. обложки). Хрящевая ткань отличалась высокой клеточной плотностью. Поверхностно расположенные хондроциты имели меньший диаметр и входили в состав изогенных групп, тогда как глубоко расположенные хондроциты были
гипертрофированы, в части клеток отмечались дегенеративные изменения (рис. 1Б на 3-й стр. обложки). Новообразованная костная ткань наблюдалась в виде тонкого слоя непосредственно на поверхности компактной пластинки кости (рис. 1В на 3-й стр. обложки), реже - в виде перихондрально образованных костных трабекул. К 30-м суткам после операции было сформировано периостальное костно-хрящевое и эндостальное костно-волокнисто-соединительнотканно-хрящевое сращение перелома. Компактная костная пластинка отломков реберной кости была спонгизирована (рис. 2А на 3-й стр. обложки). Объемные периостальные наслоения были представлены губчатой костной тканью с сетью пластинчатых трабекул и красным костным мозгом межтрабекуляр-ных пространств (рис. 2Б на 3-й стр. обложки). В плоскости перелома сохранялись очажки гиалинового хряща (рис. 2В на 3-й стр. обложки) и поля рыхлой волокнистой соединительной ткани (рис. 2Г на 3-й стр. обложки), формировались периостальные костные перемычки. Численная плотность клеток опорных тканей для обоих сроков эксперимента представлена в таблице 1.
Общее количество лейкоцитов периферической крови в сроки эксперимента достоверно не изменялось. Статистически значимо на всех сроках опыта снижалось количество нейтрофильных лейкоцитов за счет палочкоядерных и сегментоядерных с восстановлением количества последних на 7-е сутки опыта (рис. 3). С 1-х суток после операции снижалось содержание моноцитов, также оставаясь низким спустя 7 суток после операции. Единственным видом лейкоцитов, количество которых не снижалось, остались лимфоциты; их относительное содержание на 1, 3 и 5-е сутки эксперимента было даже выше дооперационных значений.
Среди изученных показателей неспецифической резистентности единственным достоверно изменявшимся
Рис. 3. Гематологические показатели периферической крови животных, % от контрольных значений. Приведены медианы показателей, имеющие в динамике наблюдений достоверные отличия от контрольных (* - р<0,05). По оси абсцисс - сутки после операции. Обозначения: НЬ - гемоглобин (г/л), Р - ретикулоциты (х 109/л), ПФ - палочкоядерные нейтрофилы (х 109/л), СФ - сегментоядерные нейтрофилы (х 109/л), НФ - нейтрофилы (х 109/л), ЛЦ - лимфоциты (%), МЦ - моноциты (%)
Таблица 1
Количество клеток и микрососудов на единицу площади периоста/параоссальной ткани (0,0025 мм2)
Таблица 2
Показатели неспецифической резистентности экспериментальных животных
Срок опыта* Костные клетки Хрящевые клетки Микро- сосуды
Медиана 0,600 6,40 0,163
1 квартиль 10 суток 0,529 5,90 0,140
3 квартиль 0,921 7,39 0,173
Медиана 4,04 1,70 0,088
1 квартиль 30 суток 3,90 1,49 0,075
3 квартиль 4,33 2,47 0,119
р-значение 0,005 0,005 0,035
Примечание: * - для обеих точек опыта, объемы выборки п=6.
была лизоцимная активность сыворотки крови (табл. 2), которая оставалась ниже значений интактых животных на всех сроках опыта.
Концентрации электролитов (кальция, хлорида, фосфора, магния) в сроки эксперимента не отличались от контрольных значений. Активность ЩФ в два раза возрастала, а ТрКФ снижалась в полтора раза на 10-е сутки после операции (табл. 3). Концентрация МК к этому сроку опыта также снижалась. Содержание ПВК повышалось к 3-м, после чего снижалось к 10-м суткам после операции.
Показа- тели* Срок после операции, сут п** Медиана Квартиль 1 Квартиль 3 р***
БАСК, мм Интактные 9 18,5 17,00 19,00 -
ЛАСК, % животные 9 81,90 ,8 0, 8 83,4 -
БАСК, мм 1 7 18,00 18,00 18,00 0,611
ЛАСК, % 1 7 74,90 70,40 77,00 0,001
БАСК, мм 3 6 16,00 15,25 16,00 0,066
ЛАСК, % 3 6 70,95 66,53 73,05 0,002
БАСК, мм 5 6 18,00 17,25 19,50 0,952
ЛАСК, % 5 6 77,95 75,50 79,88 0,021
БАСК, мм 7 6 18,00 18,00 18,75 0,620
ЛАСК, % 7 6 66,55 65,38 69,30 0,002
Примечания: * сокращения: БАСК - бактерицидная активность сыворотки крови, ЛАСК - лизоцимная активность сыворотки крови; ** п - объем выборки; *** р - критический уровень значимости критерия Вилкоксона при сравнении с контрольной группой животных; жирным шрифтом выделены медианы показателей, отличающиеся от контрольных с р<0,05.
Таблица 3
Биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных
Обсуждение
В литературе имеются исследования, оценивающие репаративные способности реберной кости как промежуточные между таковыми у большеберцовой и бедренной кости [13]. Гистологические исследования подтвердили адекватность выбора именно этой кости для моделирования перелома. Анатомические особенности ее расположения оказались благоприятными как для получения воспроизводимой морфологической картины периостального регенерата, так и для количественной оценки интенсивности регенераторного процесса. К 10-м суткам после операции периостальный регенерат представлен исключительно грубоволокнистой костной и гиалиновой хрящевой тканями, не подвергается резорбции и сосудистой инвазии. Подсчет численной плотности дифференцированных клеточных элементов остео-бластического и хондробластического ряда и микрососудов пароссальных тканей позволяет выявить влияние различных факторов на процессы остео-, хонд-ро- и ангиогенеза.
Хорошо изученные основные принципы регенерации тканей при переломе остаются справедливыми и для данной модели, однако мы обнаружили ряд особенностей в реакции некоторых систем. Деструкция клеток и тканей при переломе вызывает последовательно протекающие защитно-приспособительные процессы, начальными из которых являются реакции воспаления [4, 8, 17]. В первые 6—24 ч в очаг воспаления эмигрируют нейтрофилы, через 24-48 ч - моноциты и лимфоциты. Острые воспалительные процессы с травмой опорно-двигательного аппарата, к числу которых принадлежит и приведенная
Показатель Этап опыта п* М К1 К3 Р**
ЩФ, Е/л интактные 8 93,0 74,5 121,8
3 суток п/о 20 107,5 91,3 149,0 0,346
10 суток п/о 21 183,0 139,4 201,9 0,002
ТрКФ, Е/л интактные 8 6,10 5,08 8,20
3 суток п/о 18 6,15 5,30 7,03 0,955
10 суток п/о 21 4,00 2,60 6,10 0,036
МК, ммоль/л интактные 6 9,03 7,21 9,83
3 суток п/о 17 9,90 7,54 11,79 0,195
10 суток п/о 20 5,83 4,26 6,28 0,008
ПВК, ммоль/л интактные 7 0,434 0,363 0,472
3 суток п/о 14 0,615 0,485 0,686 0,015
10 суток п/о 20 0,280 0,252 0,355 0,011
Примечания: * обозначения: п - объем выборки, М, К1, КЗ - медиана, 1 и 3-й квартили соответственно; ЩФ - щелочная фосфатаза, ТрКФ - тартратрезистент-ная кислая фосфатаза, МК - молочная кислота, ПВК - пировиноградная кислота, п/о - после операции; ** р - критический уровень значимости критерия Вилкоксона при сравнении с группой интактных животных; жирным шрифтом выделены медианы показателей, отличающиеся от контрольных с р<0,05.
модель, обычно сопровождаются лейкоцитозом, моноци-тозом и нейтрофилезом в картине периферической крови за счет миграции резервных клеток из костного мозга и маргинального пула [3, 7]. Так, в эксперименте после остеотомии большеберцовой кости у собак в сроки 1-10 суток после операции при благоприятном течении наблюдались: лейкоцитоз - от 150 до 120%, нейтрофилез -от 220 до 160%, моноцитоз - от 200 до 110% клеток от их количества в дооперационном периоде. Авторы отмечали лимфопению (до 60% от исходного уровня) в 1 —6-е сутки и нормализацию количества лимфоцитов к 10-м суткам после операции [23]. В наших исследованиях ко-
личество лейкоцитов в периферической крови у животных не изменялось, были обнаружены нейтропения и моноцитопения; к сроку 7 суток количество сегментоядерных нейтрофилов не отличалось от уровня интактных животных. Мы полагаем, что снижение количества нейт-рофилов и моноцитов вызывается, с одной стороны, известным феноменом миграции фагоцитирующих клеток в очаг воспаления, с другой стороны, супрессирующим воздействием наркотизирующих препаратов. Несмотря на то, что эти препараты широко применяются в ветеринарии [14, 19], в доступных нам литературных источниках не удалось обнаружить сведений о картине периферической крови у животных после подобного наркоза. Возможно, что препараты модулируют иммуносупрессив-ный эффект глюкокортикоидов, что включает перераспределение, секвестрацию и миграцию клеток к месту повреждения или в другие органы.
Известно, что травма оказывает выраженное влияние на лимфоцитарный пейзаж периферической крови. Обнаружено, что травматическое воздействие вызывает в начальный период активацию, а с 3-й недели - супрессию Т-клеточного звена иммунитета [9]. При дистракци-онном остеосинтезе содержание Т- и В-лимфоцитов в периферической крови животных также существенно колеблется [23]; эти колебания имеют фазовый характер. В зависимости от периода и вида регенерации их показатели уменьшаются или увеличиваются по сравнению с исходным уровнем. Фазовый характер имеют и изменения активности ферментов биоэнергетики лимфоцитов, что указывает на повышенную функциональную активность этих клеток в наиболее важные периоды регенерации кости, несмотря на отсутствие увеличения их общего числа. Таким образом, обнаруженный нами лимфоци-тоз в процентном содержании не был истинным повышением количества этих клеток, что показали абсолютные значения, однако приведенные факты, а также известная роль различных типов лимфоцитов в регенерации любой ткани [1, 6], несомненно, предполагают активную роль этого основного звена иммунной системы в условиях рассматриваемой модели.
В наших экспериментах не обнаружено существенных изменений фагоцитарной функции нейтрофилов. Ранее было показано, что степень угнетения фагоцитарной активности имеет фазовый характер и зависит от тяжести травмы [9]. С другой стороны, известно, что введение наркотизирующего препарата рометара без оперативного вмешательства вызывает быстро проходящую супрессию показателей иммунного статуса животных; экспериментаторы наблюдали снижение числа фагоцитирующих нейтрофилов и процента фагоцитоза в пределах одних суток после инъекции [21]. Обнаруженное нами отсутствие значимых изменений в показателях фагоцитоза, по-видимому, свидетельствует о сравнительно небольшой тяжести травматического воздействия.
Снижение ЛАСК в наших экспериментах говорит о супрессии гуморальных факторов неспецифической резистентности. Разница в динамике значений лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови перекликается с результатами, полученными другими исследователями. Так, было обнаружено, что острый воспалитель-
ный процесс в желудочно-кишечном тракте у собак также сопровождается ослаблением гуморальных факторов неспецифической защиты, но при этом БАСК, ЛАСК и бета-лизинная активность сыворотки крови изменялись у больных животных неоднозначно: БАСК мало отличалась от показателей у здоровых собак, а лизоцимная и бета-лизинная активность имели тенденцию к снижению [10]. Значительная разница констатирована по бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови животных в зависимости от возраста: БАСК с возрастом увеличивалась, тогда как ЛАСК уменьшалась [15].
Увеличение активности щелочной фосфатазы на фоне снижения активности ТрКФ свидетельствует о стимуляции анаболических процессов в зоне повреждения. Резкое (почти в два раза) снижение концентраций молочной и пировиноградной кислот в крови к 10-м суткам после операции свидетельствует о преимущественном поступлении ПВК в цикл Кребса, то есть об активации аэробного окисления, способствующего образованию костной ткани. Такие изменения характерны для фазы регенерации при переломе кости [5, 18]. Отсутствие значимых различий в электролитном составе крови доказывает адаптационно-компенсаторные возможности метаболизма ионов в данных условиях эксперимента, тогда как при множественных переломах или удлинении кости методом Илизарова эти показатели претерпевают значительные изменения [12].
Таким образом, перелом реберной кости у экспериментальных животных вызывает умеренное напряжение при адаптации системы крови, звеньев неспецифической резистентности иммунной системы, метаболических систем обеспечения регенераторных процессов, что в совокупности с компенсаторно-адаптационными реакциями других систем приводит к стабильно воспроизводимой морфологической картине регенерации костной ткани. Проведенные исследования показали пригодность модели перелома реберной кости для экспериментальных исследований как остеорепаративных процессов, так и метаболического ответа на костную травму.
Литература
1. Бабаева А.Г. Прошлое, настоящее и будущее проблемы лимфоидной регуляции нелимфоидных клеток // БЭБМ. - 1995.
- № 9. - С. 230-234.
2. Бабаскин, Б.С. Определение пировиноградной кислоты модифицированным методом Умбрайта // Лабораторное дело. - 1976. - № 3. - С. 76-79.
3. Бердюгина О.В. Иммунологические тесты в оценке замедленной консолидации костной ткани при дистракционном остеогенезе нижней челюсти // Тезисы участников Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры травматологии, ортопедии РГМУ [Электронный ресурс]. - ШЬ : http://travmatology.narod.ru/ tezis01.htm.
4. Воспаление. Руководство для врачей / под ред. В.В. Серова,
В.С. Паукова. - М. : Медицина, 1995. - 640 с.
5. Герасимов А.М., Фурцева Л.Н. Биохимическая диагностика в травматологии и ортопедии. - М. : Медицина, 1986. - 240 с.
6. Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лифшиц Р.И. Иммунология травмы. - Свердловск : Изд-во Урал. ун-та, 1989. - 188 с.
7. Иммунология в клинической практике. - 1-й том издания 15.
медицинской электронной библиотеки [Электронный ресурс] / под ред. проф. К.А. Лебедева. - 1996. - URL: http:// www.rosmedic.ru/immunologiya/immunologiya-v-klinicheskoy-praktike-2.html.
8. Корж Н.А., Дедух Н.В. Репаративная регенерация кости: со- 16.
временный взгляд на проблему. Стадии регенерации (сообщение 1) // Ортопедия, травматология и протезирование. - 2006. - № 1. - С. 77-84.
9. Кравцов В.И., Рыков В.А., Даровский Б.П., Загородников И.В. 17.
Моделирование травматической болезни в эксперименте
на животных [Электронный ресурс] // Медицина в Кузбассе: Восстановительное лечение пострадавших от производственных травм и профессиональных заболеваний на санаторном этапе. Материалы межрегиональной научно- 18.
практической конференции, г. Новокузнецк, 19 мая 2006 г.
- Кемерово : Медицина и просвещение, 2006. - Спецвыпуск № 5. - С. 62-65. - URL : http://www.kuzdrav.ru/medlib/ mk/mksp2006_5.pdf.
10. Куприянова АД., Дыдыкина Н.И. Полиферментные препа- 19
раты и острые расстройства пищеварения у собак [Электронный ресурс] // Проблемы и перспективы современной науки : сборник научных трудов (выпуск 1) / под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. - 2009. - URL: http://tele- 20. conf.ru/aktualnyie-problemyi-tehnologii-i-primeneniya-bav/ polifermentnyie-preparatyi-i-ostryie-rasstroystva-pischevareniya-u-sobak.html. 21.
11. Лабораторные методы исследования в клинике : справочник / под ред. В.В. Меньшикова. - М. : Медицина, 1987. -
С. 310-311.
22.
12. Лунева С.Н., Стогов М.В., Столбиков С.А. Изменения биохи-
мических показателей сыворотки крови у пациентов с закрытыми переломами костей голени в нижней трети при лечении по методу Илизарова // Травматология и ортопедия России. - 2007. - № 3 (45). - С.63-67. 23.
13. Маланчук В.А., Астахова В.С., Циленко О.Л. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека в реконструктивно-восстановительной хирургии лицевого скеле- 24. та // Журнал академии медицинских наук Украины. - 2009.
- Т. 15, № 2. - С. 276-289.
14. Методические рекомендации по применению препарата “Золетил 50” в подразделениях государственной ветеринарной службы города Москвы [Электронный ресурс]. - М.,
2004. - URL : http://www.msu.ru/bioetika/doc/pismo-veterenar.doc.
Огнев А.С. Иммунобиохимические показатели крови маралов в норме и при патологии : автореф. дис. ... канд. ветеринар. наук : 16.00.03 [Электронный ресурс] / Алтайский гос. аграрный университет. - Барнаул, 2009. - 17 с. - URL: http: //www.asau.ru/doc/nauka/Autoreferat_Ognev.doc.
Паевский С.А. Способ определения бактерицидной активности тканей при лечении ортопедических больных методом чрескостного остеосинтеза // Клиническая лабораторная диагностика. - 1993. - № 5. - С.25-29.
Попсуйшапка А.К., Литвишко В.А., Подгайская О.А. Сращение отломков после перелома кости [Электронный ресурс] // Международный медицинский журнал. - 2009. - №2. -
С. 73-80. - uRL: http://www.nbuv.gov.ua/portal/Chem_Biol/ Mmzh/2009_2.pdf.
Предварительные результаты влияние препарата “Мицел-лат” на репаративную регенерацию костной ткани [Электронный ресурс] / Российский научный центр “Восстановительная травматология и ортопедия” им. акад. ГА Илиза-рова, г. Курган. - URL : http://www.micellat.ru/doc/02.doc.
Разина А.В., Фролова А.И., Сергеев М.А. Влияние нейролеп-танальгезии на клинический статус кроликов // Ветеринарная клиника. - 2008. - № 1. - С. 27-28.
Розова Л.В., Науменко З.С. Использование агара Мюллера-Хинтон при определении бактерицидной активности : рационализаторское предложение № 56/08 от 18.12.08.
Сергеев М. А., Фролова А. И., Равилов Р. Х. Влияние общего обезболивания и операционной травмы на показатели специфического и неспецифического иммунитета у щенков // Ветеринарная клиника. - 2008. - № 5. - С.11-13. Стогний В.И., Голик В.П., Ткаченко В.В., Воропаева Л.В., Полякова С.В. Способ определения активности лизоцима в слюне и сыворотке крови // Лабораторное дело. - 1989. -№ 8. - С. 54.
Ястребов А.П., Осипенко А.В. Система крови и регенерация костной ткани. - Свердловск : Изд-во Урал. ун-та, 1990. -124 с.
Asaumi K., Nakanishi T., Asahara H. et al. Expression of neurotrophins and their receptors (TRK) during fracture healing // Bone. - 2000. - Vol. 26, No. 6. - P. 625-633.
Поступила 23.05.2010
