CC BY
47
© Коллектив авторов, 2022
Фишер М.С.1, Курилин В.В.1, Терещенко В.П.1, Булыгин А.С.1, Кузнецова М.С.1, Ивлева Е.К.2, Сенников С.В.1
Экспериментальная модель антиген- и коллаген-индуцированного артрита у мышей
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 630559, г. Кольцово, Российская Федерация
Резюме
Введение. Ревматоидный артрит (РА) - одно из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний со сложным патогенезом. Для разработки и апробации новых методов и подходов в терапии РА (биологических препаратов, клеточных технологий) необходима экспериментальная модель со схожими патогенетическими реакциями и иммунологическими изменениями. Одним из таких подходов является разработка моделей комбинированного антиген- и коллаген-индуцированного артрита.
Цель исследования - обосновать применение в исследовательской деятельности и в разработке новых терапевтических подходов модели антиген- и коллаген-индуциро-ванного артрита (АИА/КИА) на основании изучения иммунологических и гистологических показателей, выявленных в данной модели.
Материал и методы. Индукция экспериментального АИА/КИА проводилась по трем разным протоколам у 60 мышей линии Ва1Ь/с. Визуальную оценку артрита проводили, измеряя припухлость лап штангенциркулем в разные сроки. Оценка иммунологических изменений включала анализ содержания антител к коллагену II типа методом иммуноферментного анализа, содержания Т-регуляторных клеток методом проточной цитометрии. Кроме того, проводилось гистологическое исследование тканей суставов с последующим анализом полученных данных.
Результаты. На 10-е сутки регистрировали достоверное увеличение толщины лап у животных при индукции экспериментального артрита по 3 разным протоколам. Интенсивность припухлости спадала к 23-м суткам. Достоверное увеличенное содержание антител к коллагену II типа наблюдалось во всех экспериментальных группах, но в группе животных с использованием протокола № 1 количество антител к коллагену II типа было достоверно выше. Высокий уровень Т-регуляторных клеток зарегистрирован на 10-е сутки только в группе мышей с использованием протокола № 1. Гистологические изменения в виде гиперплазии синовиальной оболочки, паннусов, узураций в разной степени наблюдались во всех экспериментальных группах, но наиболее выраженные изменения были в группе животных с применением протокола № 1.
Заключение. У всех экспериментальных животных независимо от использованного протокола индукции артрита наблюдались изменения, наиболее приближенные к РА, при их сравнении с классическими моделями индукции экспериментального артрита. Основываясь на том, что в группе животных с использованием протокола № 1 выявляется увеличение содержания Т-регуляторных клеток, уровни антител к коллагену II типа стабильно находились на высоком уровне, а гистологические изменения были наиболее выражены, можно полагать, что протокол № 1 комбинированной модели АИА/КИА на линии мышей Ва1Ь/с более всего подходит для апробации и разработки новых методов терапии РА.
Ключевые слова: ревматоидный артрит; модель артрита; экспериментальный артрит; антиген- и коллаген-индуцированный артрит
Статья получена 18.02.2022. Принята в печать 18.03.2022.
Для цитирования: Фишер М.С., Курилин В.В., Терещенко В.П., Булыгин А.С., Кузнецова М.С., Ивлева Е.К., Сенников С.В. Экспериментальная модель антиген- и коллаген-индуцированного артрита у мышей. Иммунология. 2022; 43 (2): 157-165. БОГ https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-2-157-165
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Курилин В.В., Фишер М.С., Сенников С.В.; сбор и обработка материала - Фишер М.С., Курилин В.В., Булыгин А.С., Ивлева Е.К.; статистическая обработка -Фишер М.С., Терещенко В.П., Кузнецова М.С.; написание текста - Фишер М.С.; редактирование - Сенников С.В., Терещенко В.П.
Fisher M.S.1, Kurilin V.V.1, Tereshchenko V.P.1, Bulygin A.S.1, Kuznetsova M.S.1, Ivleva E.K.2, Sennikov S.V.1
Experimental model of antigen-collagen induced arthritis in mice
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
2 State Scientific Center of Virology and Biotechnology «Vector», Federal Service for Consumer Protection and Human Welfare, 630559, Koltsovo, Russian Federation
Abstract
Introduction. Rheumatoid arthritis (RA) is one of the most common autoimmune diseases with a complex pathogenesis. To develop and test new methods and approaches in RA therapy (biological preparations, cell technologies), an experimental model with similar pathogenetic reactions and immunological changes is needed. One such approach is the development of models of combined antigen-collagen-induced arthritis.
The aim of the study is to show the immunological and histological changes similar to RA in the antigen-collagen induced arthritis (AIA/CIA) model and the validity of its application in research activities and for the development of new therapeutic approaches.
Material and methods. Experimental AIA/CIA was induced according to 3 different protocols in 60 Balb/c mice. Arthritis was assessed visually by measuring paw swelling with a caliper at different times. The assessment of immunological changes included the analysis of the content of antibodies to type II collagen by ELISA, the content of T-regulatory cells by flow cytometry. In addition, a histological examination of the tissues of the joints was carried out, followed by an analysis of the data obtained.
Results. On the 10th day, a significant increase in the thickness of the paws was recorded in animals using the induction of experimental arthritis with different protocols. The intensity of swelling subsided by the 23rd day. A significant increase in the content of antibodies to type II collagen was observed in all experimental groups, but in animals on Protocol No. 1, the level of antibodies to type II collagen was significantly higher. A high level of T-regulatory cells was registered only in mice on Protocol No. 1 on the 10th day. Histological changes in the form of synovial hyperplasia, pannus, usurations were observed to varying degrees in all experimental groups, but the most pronounced changes were in animals on Protocol No. 1.
Conclusion. In experimental animals, in all the presented protocols, changes were observed that were closest to RA, when compared with classical models of experimental arthritis induction. Based on the fact that protocol 1 animals showed an increase in the content of T-regulatory cells, the levels of antibodies to type II collagen were consistently high, and histological changes were the most pronounced, it can be assumed that Protocol No. 1 of the combined AIA/CIA model on the Balb/c mice line is the most suitable for testing and developing of new methods for RA therapy.
Keywords: rheumatoid arthritis; arthritis model; experimental arthritis; collagen antigen-induced arthritis
Received 18.02.2022. Accepted 18.03.2022.
For citation: Fisher M.S., Kurilin V.V., Tereshchenko V.P., Bulygin A.S., Kuznetsova M.S., Ivleva E.K., Sennikov S.V Experimental model of antigen-collagen-induced arthritis in mice. Immunology. 2022; 43 (2): 157-65. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-2-157-165 (in Russian)
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contributions. The concept and design of the study - Kurilin V.V., Fisher M.S., Sennikov S.V; collection and processing of material - Fisher M.S., Kurilin V.V., Bulygin A.S., Ivleva E.K.; statistical processing - Fisher M.S., Tereshchenko V.P., Kuznetsova M.S.; text writing - Fisher M.S.; text edition - Sennikov S.V, Tereshchenko V.P.
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of Molecular Immunology Laboratory, RIFCI, MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Введение
Ревматоидный артрит (РА) - хроническое системное аутоиммунное воспалительное заболевание, для которого характерны симметричное поражение суставов малого и среднего калибра, воспалительный процесс в суставах с прогрессирующей деструкцией хряща и субхондральной кости [1]. В течение многих десятилетий РА считается одной из центральных проблем ревматологии. Основой современной терапии РА являются болезнь-модифицирующие препараты и биологические агенты [2]. Имеющиеся препараты несовершенны: они обладают серьезными побочными действиями и не всегда вызывают стойкое улучшение состояния или ремиссию [3, 4]. Все вышеперечисленное ставит задачу поиска новых подходов к лечению, которые будут эффективны, более специфичны и безопасны. Необходимо учитывать, что существующие терапевтические агенты нацелены на патогенетические механизмы развития заболевания. В связи с этим необходимо разрабатывать и применять экспериментальные модели, по патогенезу максимально приближенные к ревматоидному артриту у человека.
Модели артрита на мышах - незаменимые инструменты для разработки новых методов терапии. Существующие модели не позволяют точно воссоздавать РА либо они трудновоспроизводимы. Большинство моделей воспроизводятся на мышах со специализированным генетическим фоном [5]. Наиболее известная модель экспериментального артрита на мышах - коллаген-инду-цированный артрит (КИА) [6]. В данной модели артрит развивается примерно у 80 % мышей, но только у штаммов, несущих МНС класса II подтипов !АЧ, !АГ и Н-2Ч, и имеет течение ремиттирующего заболевания [7].
По данным литературы, наиболее точно имитирует патогенез РА у мышей линии Ва1Ь/с комбинированная модель, индуцируемая метилированным сывороточным бычьим альбумином (тВ8А) и коллагеном [8]. Было показано, что линия Ва1Ь/с наиболее восприимчива к антиген- и коллаген-индуцированному артриту (АИА/ КИА) [8]. В классической модели КИА используются мыши линии С57ВЬ/6. Вследствие генетических различий между мышами Ва1Ь/с и С57ВЬ/6, таких как различные гаплотипы МНС, эти линии по-разному реагируют в моделях инфекционных процессов и аутоиммунных заболеваний [5]. В то время как у мышей С57ВЬ/6 при АИА/КИА развивается невыраженный артрит, у мышей Ва1Ь/с наблюдается быстрое начало воспаления и образование антител к циклическому цитруллинированному пептиду [8].
Модель АИА/КИА - одна из наиболее приближенных по патогенезу к РА, но она редко используется. В настоящей работе стояла задача показать иммунологические механизмы данной модели, обоснованность ее применения в исследовательской деятельности и для апробации новых терапевтических агентов РА. Индукция экспериментального артрита проводилась по 3 протоколам: 1-й - модель АИА/КИА, 2-й и 3-й - модель АИА/КИА с измененными дозировками вводимых
веществ. Изменение протокола № 1 потребовалось для попытки развития более выраженной клинической картины у экспериментальных животных. Также был проведен сравнительный анализ результатов для выявления оптимального варианта протокола для использования в дальнейших экспериментах.
Материал и методы
Лабораторные животные. В исследовании использовали 60 самцов мышей BALB/c в возрасте 2-6 мес. Мышей содержали в виварии ФГБНУ НИИФКИ в условиях естественного освещения и неограниченного доступа к еде и воде. Все манипуляции с лабораторными животными были предварительно одобрены локальным этическим комитетом (документ № 119 от 10.10.2019).
Протоколы индукции артрита. За основу протоколов индукции АИА/КИА взята модель из работы U. Baddack, S. Hartmann и соавт. [8].
Протокол № 1. Первую иммунизацию проводили, вводя подкожно 100 мкг альбумина метилированного из бычьей сыворотки (mBSA, Sigma-Aldrich, Германия), разведенного в PBS и эмульгированного с тем же объемом полного адъюванта Фрейнда (CFA, Sigma-Aldrich, Германия) (день 0). Через неделю мышей повторно подкожно иммунизировали раствором, содержащим 100 мкг бычьего коллагена типа II (Collagen Type II, Bovine, Lyophilized, Sigma-Aldrich, Германия), 50 мкг mBSA, эмульгированного с тем же объемом неполного адъю-ванта Фрейнда (IFA, Sigma-Aldrich, Германия). Параллельно с каждой иммунизацией внутрибрюшинно вводили 200 нг токсина Bordetella p. (Pertussis toxin from Bordetella pertussis, PTX, lyophilized powder, Sigma-Aldrich, Германия). Через 14 дней после последней иммунизации в полость левого коленного сустава вводили 50 мкг mBSA, разведенного в 20 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), в экспериментальной группе, в группе контроля - 20 мкл ФСБ внутрисуставно.
Протоколы № 2 и № 3. В день 0 подкожно вводили 200 мкг mBSA, разведенного в PB S и эмульгированного с тем же объемом полного адъюванта Фрейнда. Через неделю мышей повторно подкожно иммунизировали раствором из 200 мкг бычьего коллагена типа II (Collagen Type II, Bovine, Lyophilized, Sigma-Aldrich, Германия), 200 мкг mBSA, эмульгированного с тем же объемом неполного адъюванта Фрейнда (IFA, Sigma-Aldrich, Германия). Параллельно с каждой иммунизацией внутрибрюшинно вводили 300 нг токсина Bordetella p. (Pertussis toxin from Bordetella pertussis, PTX, lyophilized powder, Sigma-Aldrich, Германия). Через 14 дней после последней иммунизации в полость левого коленного сустава вводили: во 2-й группе ( протокол № 2) 100 мкг mBSA, разведенного в 20 мкл PBS, в 3-й группе (протокол № 3) - 250 мкг в 20 мкл PBS, в группе контроля -20 мкл PBS внутрисуставно.
Визуальная оценка артрита. Припухлость лап оценивали, измеряя среднюю толщину обеих задних лап с помощью штангенциркуля 0-10 мм на 0, 3, 6, 7-23-и сутки после индукции артрита.
Измерение толщины лап
10-е сутки 23-е сутки
0 Протокол № 1, контроль □ Протокол № 2, эксперимент
□ Протокол № 1, эксперимент В Протокол № 3, эксперимент П Протокол № 2 и № 3, контроль
Рис. 1. Сравнение толщины задних лап групп мышей линии Balb/c с использованием протоколов № 1-3 на 10-е и 23-и сутки Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала, минимума и максимума значений. Указаны статистически значимые отличия от: * - группы контроля протокола № 1 на 10-е сутки; # - группы контроля протокола № 2 на 10-е сутки; л - данных, полученных на 10-е сутки, от данных, полученных на 23-и сутки, в группах мышей со всеми протоколами (two-wayANOVA, p < 0,0001).
Гистологическое исследование. На 10-е и 2325-е сутки после индукции артрита мышей умерщвляли с помощью цервикальной дислокации. Задние лапы отделяли от уровня коленного сустава. Полученные материалы фиксировали в забуференном 10 % растворе формалина для гистологического исследования. Срезы тканей суставов собирали на предметные стекла, которые затем депарафинизировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Воспаление оценивали как гиперплазию слоя синовиальной оболочки и инфильтрацию лейкоцитов в синовиальную мембрану/пространство сустава, разрушение тканей - по образованию паннуса и наличию эрозии хряща.
Иммуноферментный анализ. Содержание антител, специфичных к мышиному коллагену II типа, измеряли в сыворотке крови лабораторных животных методом иммуноферментного анализа (ИФА; мышиные IgG против мышиного коллагена типа II, Cayman chemical, США).
Проточная цитометрия. Для цитометрического анализа у экспериментальных животных на 10-е и 23-и сутки проводили забор селезенок, из которых путем гомогенизации выделяли спленоциты, далее их разводили в концентрации 0,5 млн клеток на 100 мкл полной среды RPMI-1640. Для оценки относительного количества РохР3+-Трег-клеток спленоциты метили антителами к поверхностным антигенам: CD3 -BV421, CD4 - PerCP, CD25 - FITC (Biolegend, США). Мечение внутриядерного транскрипционного фактора FoxP3 проводили с помощью антитела анти^охР3-РБ (Biolegend, США) и коммерческого набора для фикса-
ции и пермеабилизации True-Nuclear™ Transcription Factor Staining (Biolegend, США), согласно инструкции производителя.
Статистический анализ данных был выполнен с помощью программы Prism 8.0 (GraphPad Software, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA или с помощью критерия Манна-Уитни. Данные были представлены в виде медианы и межквартильного интервала (25-75%). Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты
Данные визуальной оценки артрита. При анализе толщины лап экспериментальных животных были получены следующие результаты (рис. 1). В экспериментальной группе животных протокола № 1 на 10-е сутки медианное значение толщины лап составило 2,05 (LQ 1,98; UQ 2,06), на 23-и сутки - 1,70 (LQ 1,53; UQ 1,90); в экспериментальной группе протокола № 2 медианное значение на 10-е сутки составило 2,03 (LQ 1,86; UQ 2,05), на 23-и сутки - 1,80 (LQ 1,70; UQ 1,90); в экспериментальной группе протокола № 3 медианное значение на 10-е сутки составило 2,05 (LQ 1,98; UQ 2,15), на 23-и сутки - 1,55 (LQ 1,50; UQ 1,90). Для контрольных групп получено медианное значение 1,50 (LQ 1,40; UQ 1,60). Анализ изменения толщины лап в эксперименте, проведенном на группе мышей с использованием протокола № 1 (далее пр. 1), показал достоверное увеличение толщины лап в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой на 10-е сутки (р < 0,0001). На 23-и сутки при анализе толщины лап не выявлено статистически значимых отличий.
Анализ изменения толщины лап в эксперименте, проведенном на группе мышей с использованием протокола № 2 (далее пр. 2), и в эксперименте, проведенном на группе мышей с использованием протокола № 3 (далее пр. 3), показал достоверное увеличение толщины лап во всех экспериментальных группах по сравнению с контрольными группами (р < 0,0001). На 23-и сутки анализ толщины лап не выявил статистически значимых отличий. Увеличение толщины лап на 10-е сутки по сравнению с 23-ми сутками оказалось достоверным во всех экспериментальных группах (р < 0,0001).
Иммунологические данные. При анализе количества Трег-клеток в селезенках экспериментальных групп животных (рис. 3) медианное значение на 10-е сутки составило: для пр. 1 - 16,03 (LQ 14,16; UQ 19,71), для пр. 2 и пр. 3 - 4,17 (LQ 2,43; UQ 6,75); на 23-и сутки для пр. 1 - 6,65 (LQ 6,09; UQ 7, 73), для пр. 2 и пр. 3 - 3,63 (LQ 0,48; UQ 6,67). Анализ количества Трег-клеток в селезенках групп мышей пр. 1 на 10-е сутки показал достоверное увеличение их количества в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой (р < 0,0001) и при сравнении с экспериментальной группой на 23-и сутки (р < 0,0001).
5L
X
0
1
+
О
О
25
20
10
5-
т
Анализ количества Т-регуляторных клеток ■<-►
I
1
É i
10-е сутки 23-е сутки
0 Протокол № 1, контроль □ Протокол № 2
0 Протокол № 1, эксперимент □ Протокол № 3 П Протокол № 2 и № 3, контроль
6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 350 300 250 200 150 100 50
0 □
Анализ количества антител к коллагену II типа
□
10-е сутки 23-е сутки
Протокол № 1, контроль □ Протокол № 2, эксперимент
Протокол № 1, эксперимент В Протокол № 3, эксперимент Протокол № 2 и № 3, контроль
Рис. 2. Анализ количества T-регуляторных (Трег) клеток в селезенках групп мышей с использованием протоколов № 1-3 на 10-е и 23-и сутки (медианы и межквартильный интервал) Стрелкой обозначены статистически значимые отличия экспериментальной группы пр. 1 на 10-е сутки от контрольной группы на 10-е сутки, экспериментальной группы пр. 2 на 10-е сутки, экспериментальной группы пр. 1 на 23-и сутки (two-wayANOVA, p < 0,0001).
Рис. 3. Анализ содержания антител к коллагену II типа в сыворотке групп лабораторных животных с использованием протоколов № 1-3 на 10-е и 23-и сутки (средние значения и стандартные ошибки средних, медианы и межквартильный интервал)
Стрелкой указаны статистически значимые различия (тест Манна-Уитни, р < 0,0001).
& 15
0
Также в экспериментальной группе пр. 1 показано достоверное увеличение содержания Трег-клеток по сравнению с экспериментальными группами пр. 2 и пр. 3 на 10-е сутки (р < 0,0001).
При анализе содержания антител к коллагену II типа в сыворотке экспериментальных групп лабораторных животных (рис. 4) на 10-е сутки медианное значение составило: для пр. 1 - 1143,0 (ЪО 611,7; ИО 2738,0), для пр. 2 - 197,2 (ЪО 113,6; ИО 354,6), для пр. 3 - 124,1 (ЪО 116,0; Щ 198,1); на 23-и сутки для пр. 1 - 758,0 (ЪО 100,7; Щ 2717,0), для пр. 2 - 4338,0 (ЪО 3899,0; Щ 4777,0), для пр. 3 - 128,2 (ЪО 100,3; Щ 376,1).
Анализ содержания антител к коллагену II типа в сыворотке лабораторных животных групп пр. 1 на 10-е и 23-и сутки показал достоверное увеличение уровня антител в экспериментальных группах по сравнению с контрольными (р < 0,0001). Также обнаружено, что уровень антител к коллагену II типа на 10-е сутки в экспериментальной группе пр. 1 достоверно выше, чем в экспериментальных группах пр. 2 и пр. 3 (р < 0,0001). На 23-и сутки достоверным оказалось увеличение уровня антител к коллагену II типа в экспериментальной группе пр. 2 по сравнению с показателями групп пр. 1 и пр. 3 (р < 0,0001).
При сравнении уровней антител к коллагену II типа в экспериментальных группах всех приведенных протоколов видно, что в группе пр. 1 более стойкое увеличение, сохраняющееся на 10-е и 23-и сутки, чем в группе пр. 3. Также необходимо отметить, что у 30% лабораторных животных на 10-е сутки пр. 2 и пр. 3 не наблюдалось увеличения уровня антител к коллагену II типа, отличного от группы контроля. В сыворотке крови всех
животных экспериментальной группы пр. 1 регистрировалось увеличение уровня антител к коллагену II типа.
Гистологические данные. В группе лабораторных животных пр. 1 на 11-е сутки эксперимента во всех опытных образцах были обнаружены гипертрофия синовиальной оболочки, инфильтрация лейкоцитами; в 1 образце - паннус. На 25-е сутки вышеуказанные изменения проявлялись менее выраженно, но в 2-х образцах наблюдался паннус.
В образцах пр. 2 и пр. 3 наблюдалось сходство выявленных изменений, присутствовало реактивное разрастание синовиальной оболочки при слабой воспалительно-клеточной инфильтрации и сохранении хрящевого слоя, кроме 2 образцов от группы мышей пр. 2 и одного образца пр. 3. Также у нескольких мышей пр. 2 обнаружено образование паннусов на 10-е сутки.
Обсуждение
В большинстве используемых современных экспериментальных моделей артрита на мышах не может развиваться хроническое течение болезни и не формируются специфические аутоантитела. Также эти модели ограничены несколькими восприимчивыми линиями животных, которые обычно не используются в иммунологических исследованиях [9, 10]. Чтобы добиться наибольшей схожести с РА, в настоящем эксперименте была воссоздана модель АИА/КИА в разных вариантах. Также задачей данного исследования был поиск экспериментальной модели артрита, которую можно воспроизводить на общедоступных линиях лабораторных мышей, таких как Ва1Ь/с.
Рис. 4. Гистологическое исследование. А-З - микрофотографии тканей суставов мышей после окраски гематоксилином и эозином Протокол № 1, 11-е сутки: А - контроль: патологических изменений нет; Б - опыт: увеличенная толщина синовиальной оболочки с многоочаговой лейкоцитарной инфильтрацией, большая площадь покрытия суставной поверхности (паннус). Синовиальная оболочка имеет утолщенные немногочисленные ворсины.
Протокол № 1, 23-е сутки. В - контроль: норма; Г - опыт: выраженные разрастания синовиальной оболочки, значительная инфильтрация лейкоцитами, присутствует нарастание синовиальной оболочки на суставной хрящ (паннус). Протокол № 2, 10-е сутки. Д - контроль: патологических изменений нет; Е - опыт: дефект суставного хряща в виде узуры, удлиненные разрастания синовиальной оболочки по типу ворсин, но довольно тонкие. Присутствуют нейтрофилы группами в полости сустава.
Протокол № 2, 23-и сутки. Ж - контроль: норма; З - опыт: гипертрофия синовиальной оболочки, мелкая группа нейтрофилов в синовиальной полости, мелкие очаги инфильтрации лейкоцитами синовиальной оболочки.
В настоящем исследовании продемонстрированы разные варианты комбинированной модели АИА/КИА. Протоколы индукции, применяемые в данном исследовании, показали изменения, сходные с РА, а следовательно, эта модель может быть выбрана для дальнейшего изучения эффективности новых терапевтических подходов и методов. Подобно РА у человека, в представленных моделях обнаруживали такие клинические изменения, как припухлость суставов, эритема. Также в представленных моделях регистрировали типичные для РА гистологические изменения синовиальной оболочки, деструкцию хрящей, паннусы [11]. Интересно, что, по данным литературы, в некоторых экспериментальных моделях артрита на мышах также регистрируются антитела к циклическому цитруллинированному пептиду, а наиболее значимой является модель АИА/ КИА [8, 12, 13].
В приведенных моделях получено достоверное увеличение толщины лап исследуемых мышей независимо от использованного протокола. Но в группе мышей пр. 1 удалось зарегистрировать более значительные визуальные проявления, такие как припухлость
и эритема. Обычно наиболее выраженные изменения наблюдаются у восприимчивых линий мышей, таких, как ББА/1 и др.
При исследовании уровней антител к коллагену II типа в сыворотке исследуемых групп лабораторных животных было обнаружено, что в группе мышей пр. 1 более стойкое увеличение сохраняется на 10-е и на 23-и сутки, чем у группы мышей пр. 3. Аутоантитела играют огромную роль в патогенезе артрита. При РА у человека аутоантитела, содержащие ревматоидные факторы, антитела к цитруллинированному белку и антитела против коллагена II типа, участвуют в некоторых проявлениях патогенеза РА, но также являются полезными биомаркерами в диагностике и прогнозе [14-17]. Клинические исследования показали, что повышенные уровни этих антител в сыворотке и в синовиальной жидкости пациентов с РА напрямую коррелируют с выраженностью воспалительной реакции, симптомами, уровнями провоспалительных цитокинов. Интересно, что все эти антитела часто обнаруживаются в сыворотке крови человека до начала РА [18, 19]. Эти антитела могут оказывать влияние на воспалительную
реакцию, которая возникает через активацию каскада комплемента в суставе, особенно на ранних стадиях РА, аналогично процессам, наблюдаемым в моделях КИА и АИА/КИА.
Анализ количества Трег-клеток в селезенке исследуемых групп мышей показал достоверное увеличение их количества в экспериментальной группе пр. 1 только на 10-е сутки, в группах с использованием других протоколов увеличения количества Трег-клеток не зарегистрировано ни на одном сроке. Трег-клетки проникают в синовиальную оболочку для защиты тканей от разрушения, в том числе при РА. Трег-клетки инициируют продукцию ТФРр и интерлейкина(ИЛ)-10. Также при воспалении присутствуют провоспалитель-ные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа) и ТЫ7-клетки [20]. ИЛ-17, продуцируемый ТЫ7-клетками, связан с тяжестью воспаления в синовии у пациентов с РА [20, 21]. Следовательно, считается, что ИЛ-17, продуцируемый ТЫ7-клетками, играет важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний. У животных пр. 1 на 10-е сутки наблюдалось достоверное увеличение количества Трег-клеток, а это может свидетельствовать о выраженной воспалительной реакции на индукцию артрита. В то же время у данной группы мышей наблюдалось увеличение уровня антител к коллагену II типа, что, в свою очередь, говорит об аутоиммунном компоненте патогенетической реакции. Необходимо отметить: несмотря на снижение количества Трег-клеток на 23-и сутки и снижение интенсивности припухлости лап в экспериментальной группе животных пр. 1, гистологические изменения в виде гиперплазии синовиальной оболочки и увеличенное содержание антител к коллагену II типа сохраняются в хроническую фазу заболевания. Также, по литературным данным, в моделях аутоиммунных заболеваний количество Трег-клеток увеличивается по мере прогрессирования заболевания [22]. Указанные обстоятельства могут подтверждать развитие аутоиммунной воспалительной реакции у экспери-
ментальной группы пр. 1, но не у групп пр. 2 и пр. 3, так как там не регистрировалось увеличение количества Трег-клеток.
Наиболее выраженные морфологические изменения были обнаружены в пределах отдельных групп пр. 1. Максимально - на 10-е сутки эксперимента: разрастание и гипертрофия синовиальной оболочки в виде паннуса зачастую сопровождалась выраженной инфильтрацией лейкоцитами. На 23-и сутки вышеуказанные патомор-фологические изменения проявлялись заметно слабее. В частности, по сравнению с 10-ми сутками менее интенсивно представлена лейкоцитарная инфильтрация синовиальной оболочки. В целом, в группах животных с использованием пр. 2 и пр. 3 выраженность изменения суставных структур сравнима с характерными нарушениями, отмеченными в группе животных на 23-и сутки пр. 1, так как для обеих этих групп характерно реактивное разрастание синовиальной оболочки при слабой воспалительно-клеточной инфильтрации и сохранение хрящевого слоя. Также в нескольких образцах обнаружено образование паннусов на 10-е сутки пр. 2. По данным литературы, успешность модели определяется по образованию паннусов, так как они являются основным морфологическим признаком РА [23].
Заключение
Итак, у животных при использовании всех представленных протоколов наблюдались изменения, наиболее приближенные к РА, если сравнивать их с классическими моделями индукции экспериментального артрита. Основываясь на том, что в группе с использованием пр. 1 наблюдалось увеличение содержания Трег-клеток, уровни антител к коллагену II типа были стабильно повышены, а гистологические изменения обнаруживались наиболее выраженные, можно полагать, что пр. 1 комбинированной модели АИА/КИА на линии мышей Ва1Ь/с, более всего подходит для апробации и разработки новых методов и подходов к терапии РА.
■ Литература
1. Croia C., Bursi R., Sutera D., Petrelli F., Alunno A., Puxeddu I. One year in review 2019: pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Rheumatol. 2019; 37 (3): 347-57. PMID: 31111823.
2. Abbasi M., Mousavi M.J., Jamalzehi S., Alimohammadi R., Bez-van M.H., Mohammadi H., Aslani S. Strategies toward rheumatoid arthritis therapy; the old and the new. J. Cell. Physiol. 2018; 234 (7): 10 018-31. DOI: https://doi.org/10.1002/jcp.27860
3. Greenberg J.D., Reed G., Kremer J.M., Tindall E., Kavanaugh A., Zheng C., Bishai W., Hochberg M.C.; CORRONA Investigators. Association of methotrexate and tumour necrosis factor antagonists with risk of infectious outcomes including opportunistic infections in the COR-RONA registry. Ann. Rheum. Dis. 2010; 69 (2): 380-6. DOI: https://doi. org/10.1136/ard.2008.089276
4. Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Медуницын Н.В. Проблемы, связанные с нежелательной иммуно-генностью биотехнологических лекарственных препаратов (терапевтических белков). Сообщение 1. Методические подходы к оценке иммуногенности. Иммунология. 2019; 40 (3): 51-64. DOI: https://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-13006
5. Brand D.D. Rodent models of rheumatoid arthritis. Comp. Med. 2005; 55 (2): 114-22. PMID: 15884771.
6. Choudhary N., Bhatt L.K., Prabhavalkar K.S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2018; 40 (3): 193-200. DOI: https://doi.org/10.1080/08923973.2018.1434793
7. Bessis N., Decker P., Assier E., Semerano L., Boissier M.C. Arthritis models: usefulness and interpretation. Semin. Immunopathol. 2017; 39 (4): 469-86. DOI: https://doi.org/10.1007/s00281-017-0622-4
8. Baddack U., Hartmann S., Bang H., Grobe J., Loddenkemper C., Lipp M., Müller G.A chronic model of arthritis supported by a strain-specific periarticular lymph node in BALB/c mice. Nat. Commun. 2013; 4 (1): 1-10. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms2625
9. Asquith D.L., Miller A.M., McInnes I.B., Liew F.Y. Animal models of rheumatoid arthritis. Eur. J. Immunol. 2009; 39: 2040-4. DOI: https:// doi.org/10.1002/eji.200939578
10. Lindqvist A.K.B., Bockermann R., Johansson A.C., Nandaku-mar K.S., Johannesson M., Holmdahl R. Mouse models for rheumatoid arthritis. Trends Genet. 2002; 18 (6): S7-13. DOI: https://doi.org/10.1016/ S0168-9525(02)02684-7
11. Комарова Е.Б. Изменения синовиальной оболочки у больных ревматоидным артритом при артроскопии. Научно-практическая ревматология. 2017; 55 (3): 241-4. DOI: http://dx.doi.org/10.14412/1995-4484-2017-241-244
12. López-Longo F.J., Oliver-Miñarro D., de la Torre I., González-Díaz de Rábago E., Sánchez-Ramón S. et al. Association between anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and ischemic heart disease in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Care Res. 2009; 61 (4): 419-24. DOI: https://doi.org/10.1002/art.24390
13. Cantaert T., Teitsma C., Tak P.P., Baeten D. Presence and role of anti-citrullinated protein antibodies in experimental arthritis models. Arthritis Rheum.. 2013; 65 (4): 939-48. DOI: https://doi.org/10.1002/ art.37839
14. Kim W.U., Yoo W.H., Park W., Kang Y.M., Kim S.I., Park J.H., Kim H.Y. IgG antibodies to type II collagen reflect inflammatory activity in patients with rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. 2000; 27 (3): 575-81. PMID: 10743792.
15. Bugatti S., Codullo V., Caporali R., Montecucco C.B cells in rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 2007; 7 (2): 137-42. DOI: https://doi. org/10.1016/j.autrev.2007.02.017
16. Vallbracht I., Rieber J., Oppermann M., Förger F., Siebert U., Helmke K. Diagnostic and clinical value of anti-cyclic citrullinated pep-tide antibodies compared with rheumatoid factor isotypes in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2004; 63 (9): 1079-84. DOI: http://dx.doi. org/10.1136/ard.2003.019877
17. Cho Y.G., Cho M.L., Min S.Y., Kim H.Y. Type II collagen autoim-munity in a mouse model of human rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 2007; 7 (1): 65-70. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.autrev.2007.08.001
18. van Venrooij W.J., Zendman A.J., Pruijn G.J. Autoantibo-dies to citrullinated antigens in (early) rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 2006; 6 (1): 37-41. DOI: https://doi.org/10.1016/j.autrev.2006. 03.008
19. Kim W.U., Cho M.L., Jung Y.O., Min S.Y., Park S.W., Min D.J., Kim H.Y. Type II collagen autoimmunity in rheumatoid arthritis. Am. J. Med. Sci. 2004; 327 (4): 202-11. DOI: https://doi.org/10.1097/00000441-200404000-00006
20. Furuzawa-Carballeda J., Vargas-Rojas M.I., Cabral A.R. Autoimmune inflammation from the Th17 perspective. Autoimmun. Rev. 2007; 6 (3): 169-75. DOI: https://doi.org/10.1016/j.autrev.2006.10.002
21. Lubberts E., Koenders M.I., van den Berg W.B. The role of T cell interleukin-17 in conducting destructive arthritis: lessons from animal models. Arthritis Res. Ther. 2004; 7 (1): 1-9. DOI: https://doi.org/10.1186/ ar1478
22. Scalapino K.J., Tang Q., Bluestone J.A., Bonyhadi M.L., Daikh D.I. Suppression of disease in New Zealand Black/New Zealand White lupus-prone mice by adoptive transfer of ex vivo expanded regulatory T cells. J. Immunol. 2006; 177 (3): 1451-9. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.177.3.1451
23. Cajas L.J., Casallas A., Medina Y.F., Quintana G., Rondón F. Pannus and rheumatoid arthritis: Historic and pathophysiological evolution. Rev. Colomb. Reumatol. 2019; 26 (2): 118-28. DOI: https://doi. org/10.1016/j.rcreue.2018.10.005
■ References
1. Croia C., Bursi R., Sutera D., Petrelli F., Alunno A., Puxeddu I. One year in review 2019: pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Rheumatol. 2019; 37 (3): 347-57. PMID: 31111823.
2. Abbasi M., Mousavi M.J., Jamalzehi S., Alimohammadi R., Bez-van M.H., Mohammadi H., Aslani S. Strategies toward rheumatoid arthritis therapy; the old and the new. J. Cell. Physiol. 2018; 234 (7): 10 018-31. DOI: https://doi.org/10.1002/jcp.27860
3. Greenberg J.D., Reed G., Kremer J.M., Tindall E., Kavanaugh A., Zheng C., Bishai W., Hochberg M.C.; CORRONA Investigators. Association of methotrexate and tumour necrosis factor antagonists with risk of infectious outcomes including opportunistic infections in the COR-RONA registry. Ann. Rheum. Dis. 2010; 69 (2): 380-6. DOI: https://doi. org/10.1136/ard.2008.089276
4. Avdeeva Zh.I., Soldatov A.A., Bondarev V.P., Merkulov V.A., Me-dunitsyn N.V. The problems concerned with undesirable immunogenicity of biotechnological medicines (therapeutic proteins). Part 1. Methodological approaches to the evaluation of immunogenicity. Immunologiya. 2019; 40 (3): 51-64. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-13006 (in Russian)
5. Brand D.D. Rodent models of rheumatoid arthritis. Comp. Med. 2005; 55 (2): 114-22. PMID: 15884771.
6. Choudhary N., Bhatt L.K., Prabhavalkar K.S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2018; 40 (3): 193-200. DOI: https://doi.org/10.1080/08923973.2018.1434793
7. Bessis N., Decker P., Assier E., Semerano L., Boissier M.C. Arthritis models: usefulness and interpretation. Semin. Immunopathol. 2017; 39 (4): 469-86. DOI: https://doi.org/10.1007/s00281-017-0622-4
8. Baddack U., Hartmann S., Bang H., Grobe J., Loddenkemper C., Lipp M., Müller G.A chronic model of arthritis supported by a strain-specific periarticular lymph node in BALB/c mice. Nat. Commun. 2013; 4 (1): 1-10. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms2625
9. Asquith D.L., Miller A.M., McInnes I.B., Liew F.Y. Animal models of rheumatoid arthritis. Eur. J. Immunol. 2009; 39: 2040-4. DOI: https:// doi.org/10.1002/eji.200939578
10. Lindqvist A.K.B., Bockermann R., Johansson A.C., Nandaku-mar K.S., Johannesson M., Holmdahl R. Mouse models for rheumatoid arthritis. Trends Genet. 2002; 18 (6): S7-13. DOI: https://doi.org/10.1016/ S0168-9525(02)02684-7
11. Komarova E.B. Synovial membrane changes in patients with rheumatoid arthritis revealed during arthroscopy. Nauchno-prakticheskaya rev-matologiya. 2017; 55 (3): 241-4. DOI: http://dx.doi.org/10.14412/1995-4484-2017-241-244 (in Russian)
12. López-Longo F.J., Oliver-Miñarro D., de la Torre I., González-Díaz de Rábago E., Sánchez-Ramón S., et al. Association between anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and ischemic heart disease in patients
with rheumatoid arthritis. Arthritis Care Res. 2009; 61 (4): 419-24. DOI: https://doi.org/10.1002/art.24390
13. Cantaert T., Teitsma C., Tak P.P., Baeten D. Presence and role of anti-citrullinated protein antibodies in experimental arthritis models. Arthritis Rheum. 2013; 65 (4): 939-48. DOI: https://doi.org/10.1002/ art.37839
14. Kim W.U., Yoo W.H., Park W., Kang Y.M., Kim S.I., Park J.H., Kim H.Y. IgG antibodies to type II collagen reflect inflammatory activity in patients with rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. 2000; 27 (3): 575-81. PMID: 10743792.
15. Bugatti S., Codullo V., Caporali R., Montecucco C.B cells in rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 2007; 7 (2): 137-42. DOI: https://doi. org/10.1016/j.autrev. 2007.02.017
16. Vallbracht I., Rieber J., Oppermann M., Förger F., Siebert U., Helmke K. Diagnostic and clinical value of anti-cyclic citrullinated pep-tide antibodies compared with rheumatoid factor isotypes in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2004; 63 (9): 1079-84. DOI: http://dx.doi. org/10.1136/ard.2003.019877
17. Cho Y.G., Cho M.L., Min S.Y., Kim H.Y. Type II collagen autoimmunity in a mouse model of human rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 2007; 7 (1): 65-70. DOI: https://doi.org/10.1016/j.autrev.2007.08.001
18. van Venrooij W.J., Zendman A.J., Pruijn G.J. Autoantibodies to citrullinated antigens in (early) rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 2006; 6 (1): 37-41. DOI: https://doi.org/10.1016/j.autrev.2006.03.008
19. Kim W.U., Cho M.L., Jung Y.O., Min S.Y., Park S.W., Min D.J., Kim H.Y. Type II collagen autoimmunity in rheumatoid arthritis. Am. J. Med. Sci. 2004; 327 (4): 202-11. DOI: https://doi.org/10.1097/00000441-200404000-00006
20. Furuzawa-Carballeda J., Vargas-Rojas M.I., Cabral A.R. Autoimmune inflammation from the Th17 perspective. Autoimmun. Rev. 2007; 6 (3): 169-75. DOI: https://doi.org/10.1016/j.autrev.2006.10.002
21. Lubberts E., Koenders M.I., van den Berg W.B. The role of T cell interleukin-17 in conducting destructive arthritis: lessons from animal models. Arthritis Res. Ther. 2004; 7 (1): 1-9. DOI: https://doi.org/10.1186/ ar1478
22. Scalapino K.J., Tang Q., Bluestone J.A., Bonyhadi M.L., Daikh D.I. Suppression of disease in New Zealand Black/New Zealand White lupus-prone mice by adoptive transfer of ex vivo expanded regulatory T cells. J. Immunol. 2006; 177 (3): 1451-9. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.177.3.1451
23. Cajas L.J., Casallas A., Medina Y.F., Quintana G., Rondón F. Pannus and rheumatoid arthritis: Historic and pathophysiological evolution. Rev. Colomb. Reumatol. 2019; 26 (2): 118-28. DOI: https://doi. org/10.1016/j.rcreue.2018.10.005
Сведения об авторах
Фишер Марина Сергеевна - аспирант лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Курилин Василий Васильевич - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Терещенко Валерий Павлович - канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
Булыгин Алексей Сергеевич - аспирант лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9055-6069
Кузнецова Мария Сергеевна - канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Ивлева Елена Константиновна - мл. науч. сотр. отд. микроскопических исследований ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово, Российская Федерация
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0003-1194-7219
Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Authors' information
Marina S. Fisher - PhD Student of Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Vasily V. Kurilin - PhD, Senior Researcher of Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Valeriy P. Tereshchenko - PhD, Researcher of Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
Aleksey S. Bulygin - PhD student of Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9055-6069
Maria S. Kuznetsova - PhD, Researcher of Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Elena & Ivleva - Junior Researcher, Dept. of Microscopic Research, State Research Center of Virology and Biotechnology Vector Rospotrebnadzor, Koltsovo, Russian Federation
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0003-1194-7219
Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Prof., Head of Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
