CC BY
63
УДК 576.8, 582.28, 629.198.3
ЭКСПЕРИМЕНТ "НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ БИОДЕГРАДАЦИИ И БИОПОВРЕЖДЕНИЙ В УСЛОВИЯХ КОСМОСА"
Т.А. Алехова, А.В. Александрова, Т.Ю. Новожилова, Л.В. Лысак, Н.А. Загустина
(кафедра микробиологии и кафедра микологии и альгологии биологического факультета МГУ; e-mail: [email protected]; кафедра биологии почв факультета почвоведения МГУ; Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН; e-mail: [email protected])
В рамках сформированной в 1999 г. в России "Долгосрочной программы научно-прикладных исследований и экспериментов, планируемых на российском сегменте МКС", проводится эксперимент "Начальные этапы биодеградации и биоповреждений в условиях космоса", рассчитанный на весь период эксплуатации МКС. Космическая станция — зона повышенного риска с экстремальными условиями как для находящихся там людей, так и для работы оборудования. В связи с этим постоянный контроль всех параметров внутренней среды, в том числе и микробного населения станции, повысит надежность и безопасность работы станции. Особенно важно исследование начальных этапов коло-низаций микроорганизмами поверхностей конструкционных материалов в условиях замкнутой среды обитания экипажа МКС.
Микробиологическая коррозия материалов, как содержащих органические вещества, так и металлов, является на сегодняшний день хорошо известным явлением. Считается, что около 20% коррозионных процессов, имеющих негативные последствия для человека, вызваны именно микробиологическими процессами (Андреюк и др., 1980; Кт^огШ е! а1., 1999).
В основе действия микроорганизмов на металлы лежит электрохимический механизм. Микроорганизмы могут вызывать или усиливать коррозионные повреждения тремя основными способами: непосредственно воздействуя на кинетику электродных реакций; образуя метаболиты, обладающие коррозионными свойствами (неорганические и органические кислоты и т.п.); вызывая изменения на поверхности раздела металл—электролит, которые могут привести к коррозии (например, образование участков с повышенным образованием окислов) (Со81е11о, 1969; Ои е! а1., 1988). Возникшая коррозионная пленка увеличивает возможность адсорбции микроорганизмов и скопления конденсата, что создает новые места обитания для все большего числа разнообразных микроорганизмов, в том числе способных влиять на усиление биокоррозионных процессов.
В ранее проводившихся исследованиях показано, что при длительных космических полетах человека на орбитальных станциях на борту космическо-
го аппарата обнаруживается широкий спектр самых различных микроорганизмов, обладающих биопов-реждающими свойствами. На орбитальной станции "Мир" было обнаружено более 200 видов бактерий и грибов, среди которых найдены условно-патогенные виды, но наиболее обширная по составу группа — это так называемые технофилы — микроорганизмы, участвующие в заселении и биодеструкции различных промышленных материалов, в том числе и в коррозии металлов (Викторов и др., 1998; КНпТ;-^»огШ е! а1., 1999; Новикова, 2001; Алехова и др., 2002; Скуратов и др., 2002; Руденко и др., 2003).
Развитие микроорганизмов-деструкторов на поверхности материала ухудшает качество материалов и может привести к нарушениям в эксплуатации оборудования, что снизит безопасность полета для космонавтов (Основы космической биологии и медицины, 1975; Ои е! а1., 1988). Вследствие этого необходим мониторинг поверхностей конструкционных материалов для исследования ассоциаций микроорганизмов и их возможного повреждающего действия, а также разработка эффективных способов подавления их жизнедеятельности в условиях микрогравитации. Несомненна актуальность экспериментов, проводимых в настоящее время, задачей которых является разработка методов обеспечения биологической безопасности космических, авиационных, подводных и других гермозамкнутых обитаемых аппаратов на основе исследований начальных этапов колонизации различными микроорганизмами поверхностей конструкционных материалов.
Цель настоящей работы — мониторинг видового состава микроорганизмов, заселяющих конструкционные поверхности на российском сегменте (РС) МКС, и изучение их биокоррозионных свойств в модельных экспериментах.
Материалы и методы
Эксперимент "Начальные этапы биодеградации и биоповреждений в условиях космоса" рассчитан на весь период эксплуатации МКС с цикличностью отбора проб 2 раза в год. К настоящему времени проведено 7 циклов исследований. В работе приняли участие 7 космонавтов, каждый из которых прошел специальную подготовку. Во время проведения
отбора материала на борту МКС, который длится около 2 ч, ученые координируют работу в Центре управления полетами (ЦУП), находясь на прямой связи с космонавтами.
Для проведения эксперимента на борту орбитального комплекса была разработана специальная укладка "Биопробы", предназначенная для доставки устройства для отбора проб с различных конструкционных материалов внутренних поверхностей станции, хранения отобранных проб и доставки их на Землю с целью проведения микробиологического анализа (Алехова и др., 2005а; 2006).
Места забора проб — 20 точек — были согласованы с различными подразделениями ОАО РКК "Энергия" (материаловедами, проектантами, службой обеспечения жизнедеятельности) и находились в различных зонах возможного скопления и развития микроорганизмов.
Обработку полученных образцов проводили на биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова по возможности в день получения материала. Выделение микроорганизмов из пробоотборников проводили общепринятыми методами с рассевом на плотные питательные среды, оптимально подходящие для выделения всего спектра видов, способных обитать на конструкционных материалах (Методы..., 1991). Для идентификации бактерий и грибов использовали общепринятые определители (Bergey's manual..., 1986; Pitt, 1991; Domsch et al., 1993; Hoog, Guarro, 1995; Определитель бактерий Берджи, 1997; Maren, 2002; и др.). В результате работы создана коллекция микроорганизмов — биодеструкторов с РС МКС, насчитывающая на сегодняшний день около 300 штаммов.
В модельном эксперименте была исследована способность выделенных штаммов вызывать коррозию алюминиево-магниевого сплава (АМг-6), используемого в изделиях космической техники. Исследование повреждения поверхности материала проводилось на цилиндрических заготовках диаметром 16 мм и высотой 5 мм. Биокоррозионная нагрузка моделировалась в соответствии с условиями и сроками, рекомендованными действующими ГОСТами 9.913-90, 9.048-89 и 9.049-91 и международными стандартами ИСО в области коррозии сплавов. Контрольный образец подвергался точно такой же обработке без внесения микроорганизмов. Изучение степени воздействия микроорганизмов на поверхность металла осуществляли методом сканирующей электронной микроскопии (Алехова и др., 2005б) на сканирующем электронном микроскопе CAM SCAN фирмы CAMBRIG.
Результаты и обсуждение
На каждом отдельном этапе эксперимента микроорганизмы обнаруживались не во всех пробах, однако за проведенные семь циклов они были вы-
явлены на поверхности конструкционных материалов во всех точках, выбранных для взятия проб, и были представлены эукариотами (мицелиальные и дрожжевые грибы) и прокариотами (бактерии и актиномицеты).
Выделены представители 28 различных таксонов микроорганизмов: 17 видов из 5 родов плесневых грибов: Aspergillus chevalieri L. Mangin; A.flavus Link; A. niger van Tieghem; A. sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church; A. ustus (Bainier) Thom et Church; A. versicolor (Vuillemin) Tiraboschi; Chaetomium glo-bosum Kunze: Fries; Cladosporium herbarum (Persoon: Fries) Link; Penicillium aurantiogriseum Dierckx; P. chry-sogenum Thom; P. crustosum Thom; P. decumbens Thom; P. purpurogenum Stoll; P. spinulosum Thom; P. variabile Sopp; Scopulariopsis brumptii Salvanet-Duval; S. bre-vicaulis (Saccardo) Bainier. Один дрожжевой гриб: Rhodotorula glutinis (Fresenius) F.C. Harrison. Представители 7 родов бактерий: Arthrobacter; Bacillus; Cytophaga; Flavobacterium; Micrococcus; Myxococcus; Rhodococcus; и 3 родов актиномицетов Noccardia; Geodermatophilus; Streptomyces.
Постоянно присутствуют во всех образцах бактерии Bacillus subtilis, мицелиальный гриб Penicillium chrisogenum и дрожжи Rhodotorula glutinis. Несколько реже обнаруживались Aspergillus sydowii, A. versicolor, Penicillium aurantiogriseum, P. crustosum и бактерии Myxococcus luteus и представители рода Micrococcus (рис. 1, а, б).
Общее количество выявленных видов и число колоний при рассеве отобранных проб на чашках с агаризованной средой сильно варьировало на разных этапах проведения эксперимента и изменялось волнообразно. Такой характер динамики микробного населения ранее был показан для станции "Мир", что, по-видимому, характерно и для других гермо-замкнутых объектов (Викторов и др., 1998; Klintworth et al., 1999; Новикова, 2001).
На рис. 2, а представлена диаграмма, демонстрирующая изменение процентного соотношения количества точек, в которых выявлены микроорганизмы, к общему числу точек отбора проб на всех этапах эксперимента. На диаграмме хорошо видна цикличность в степени заселенности станции на протяжении исследования, первая волна (1—3 циклы) имеет меньшую амплитуду, чем вторая (4—7 циклы).
Численность микроорганизмов, выявляемая на чашках, была относительно невысокой и изменялась также волнообразно в соответствии со степенью заселенности станции. Однако нарастание амплитуды колебания от первой волны ко второй по численности микроорганизмов выражено больше, чем по степени заселенности.
Видовое разнообразие микроскопических грибов и бактерий на разных этапах исследования изменялось сходным образом (рис. 2, б). Число видов, не обнаруженных ранее, с каждым следующим эта-
Рис. 1. а — частота встречаемости микроскопических грибов (% от суммы для 7 этапов исследования); б — частота встречаемости бактерий (% от суммы для 7 этапов исследования)
пом исследования сокращалось. Однако с каждым новым этапом обнаруживались и некоторые новые виды, что может говорить о постоянном пополнении микрофлоры станции, по всей вероятности, за счет новых грузов.
На разных этапах эксперимента наиболее загрязненными были практически одни и те же точки с условиями, наиболее благоприятными для развития микроорганизмов, расположенные в местах скопления пыли и влаги за панелями и т.п.
Все выявленные мицелиальные грибы относились к группе анаморфных (несовершенных грибов). Среди них преобладали представители родов Pénicillium и Aspergillus.
Рис. 2. а — динамика заселенности станции микроорганизмами на разных этапах эксперимента "Биодеградация"; б — видовое разнообразие микроорганизмов, выделенных на разных этапах эксперимента "Биодеградация"
Наибольшим количеством видов (7) был представлен род Pénicillium. Виды этого рода также наиболее широко распространены на Земле и встречаются практически на любых субстратах. Естественным их резервуаром является почва, откуда они легко переходят на растительные и техногенные субстраты, продукты питания и т.п. Многие виды этого рода образуют широкий спектр гидролитических ферментов. Практически все виды выделяют те или иные антибиотики или токсины, многие могут быть причиной аллергических реакций, некоторые условно патогенны для человека.
Наиболее часто встречающийся в пробах вид рода Pénicillium P. chrysogenum — технофил, постоянно выделяемый на всех этапах космического эксперимента. Он был одним из доминирующих видов на станции "Мир" (Викторов и др., 1998; Klintworth et al., 1999; Новикова, 2001; Алехова и др., 2002). В земных условиях это основной фоновый вид в микобиоте домашней пыли в г. Москве (Петрова-Никитина и др., 2000).
Были обнаружены 6 видов рода Aspergillus. Представители этого рода весьма устойчивы к различным неблагоприятным факторам (сухость, соленость, повышенная температура, различные излучения и др.) и способны использовать широкий спектр питательных субстратов. Видимо, эти свойства и объясняют их высокую представленность на борту РС МКС.
Большинство выявленных видов этого рода (кроме A. ustus) ранее отмечались на станции "Мир" (Викторов и др., 1998; Klintworth et al., 1999; Новикова, 2001; Скуратов и др., 2002).
Наиболее опасный среди представителей рода Aspergillus — вид A.flavus, который выделяет опасные афлатоксины, может быть причиной аллергических реакций и даже аспергиллезов легких у людей с ослабленным иммунитетом. На II этапе космического эксперимента (в период МКС 6, май 2003 г.) этот вид в значительном количестве был выделен с поглотителей СО2. В дальнейшем этот вид был выявлен только на VII этапе (МКС 11, сентябрь 2005 г.).
Все выделенные грибы относятся к группе тех-нофилов и способны образовывать органические кислоты. Кроме того, представители рода Aspergillus и многие виды рода Penicillium являются ток-синообразователями и условными патогенами, их споры могут быть причиной аллергических заболеваний.
Дрожжи представлены всего одним видом Rho-dotorula glutinis, являющимся обитателем почвы, пыли, пищевых продуктов и часто выделяющимся из воздуха.
Обнаруженные на всех субстратах изоляты грибов не имели морфологических отклонений от описанных в определителях. Различие касалось степени выделения в среду пигментов разными колониями грибов.
Все обнаруженные виды, также как и на ОС "Мир", микроорганизмы-космополиты с естественным резервуаром в почве, но освоившие и субстраты, связанные с деятельностью человека (Лугаускас и др., 1987). Они способны вызывать биоповреждения различных полимерных материалов и ускорять коррозию металлов. Большинство выделенных видов (кроме Aspergillus ustus и Chaetomium globosum) выявлялись ранее на станции "Мир". Эти виды микроорганизмов указываются как "фоновые" или "очень частые" в жилых и офисных помещениях разных стран (Davies et al., 1995; Петрова-Никитина и др., 2000).
Выделенные из проб прокариоты принадлежали 7 родам бактерий (Bacillus, Rhodococcus, Micro-
coccus, Arthrobacter, Cytophaga, Myxococcus, Flavobac-terium) и 3 родам актиномицетов Noccardia, Strepto-myces, Geodermatophilus. Преобладали по встречаемости бактерии рода Bacillus, представленного двумя видами B. subtilis и B. sphericus, что, по-видимому, связано с их устойчивостью к разнообразным неблагоприятным факторам среды и способностью к деструкции различных органических соединений (The Prokariotes, 1992).
Другие бактерии были представлены в основном Rhodococcus rhodochrous, Micrococcus luteus, Ar-throbacter globiformis, Geodermatophilus obscurus, Noc-cardia asteroids и др. Роды бактерий, к которым отнесены выделенные штаммы, широко распространены в почвах. Бациллы и миксобактерии являются типичными педобионтами, микрококки также часто выделяются из почвы, а также с поверхности растений и из воздуха, с кожных покровов человека и шерсти животных. Миксобактерии и бациллы обладают гидролитическими ферментами и способны разлагать такие природные полимеры, как целлюлоза и некоторые полисахариды, а также выделять в процессе жизнедеятельности органические кислоты и кислые полисахариды (The Prokaryotes, 1992), что может способствовать разрушению конструкционных материалов МКС.
Для изучения способности выделенных микроорганизмов вызывать биоповреждения были проведены эксперименты по моделированию биокоррозионной нагрузки. Показано, что практически все взятые штаммы оказывают влияние на структуру поверхности сплава АМГ-6, однако степень изменения и внешнее проявление этих процессов сильно отличались в зависимости от вида агента биокоррозии.
При исследовании поверхности контрольных образцов сколько-нибудь существенных изменений поверхности ни в один из сроков эксперимента замечено не было (рис. 3, а, б, контроль с различным увеличением). Исследованные виды микроорганизмов вызывали различные по характеру повреждения сплава.
Самыми активными агентами биокоррозии из рассмотренных видов оказались 3 вида плесневых грибов: Aspergillus flavus Link; Aspergillus niger van Ti-
Рис. 3. Внешний вид поверхности контрольного образца металла на 3-й срок испытания
Рис. 5. Внешний вид поверхности образца металла, пораженной Aspergillus niger на 1-й срок испытания
Рис. 6. Внешний вид поверхности образца металла, пораженной Aspergillus niger на 3-й срок испытания
Рис. 7. Внешний вид поверхности образца металла, пораженной Cladosporium квгЬагит на 3-й срок
испытания
eghem; Cladosporium herbarum (Persoon: Fries) Link. Эти виды вызывали глубокое изъязвление поверхности образцов сплава (рис. 4—7).
К достаточно активным видам, вызывающим равномерное, но не глубокое изъязвление поверхности или появление пятен и корок, можно отнести большинство изученных видов грибов: Aspergillus versicolor (Vuillemin) Tiraboschi; Chaetomium globosum Kunze: Fries; Penicillium chrysogenum Thom; P. crus-tosum Thom; P. purpurogenum Stoll (рис. 8, а, б) и некоторые бактерии: Micrococcus sp., Myxococcus sp.
К видам, вызвавшим слабые повреждения, можно отнести 2 вида грибов — Aspergillus sydowii (Bai-nier et Sartory) Thom et Church; A. ustus (Bainier) Thom et Church и 3 рода бактерий — Bacillus sp. 2; Cytophaga sp. Rhodococcus sp.
Видом, практически не изменяющим поверхность металла за срок проведения эксперимента, оказался дрожжевой гриб Rhodotorula glutinis (Frese-nius) F.C. Harrison.
Таким образом, изучение микрофлоры конструкционных поверхностей на российском сегменте МКС показало, что в процессе работы формируется
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алехова Т.А., Новожилова Т.Ю., Александрова А.В., Борисова В.А., Самосадная Т.Е., Ермак А.Л. 2002. Выделение микрофлоры с конструкционных поверхностей ОС "Мир", способность к биоповреждению материалов // Биотехнология, состояние и перспективы развития: Мат-лы I Междунар. конгресса. М. С. 315.
Алехова Т.А., Александрова А.В., Новожилова Т.Ю., Голутвин И.А., Наси-кан Н.С., Загустина Н.А., Плотников А.Д., Борисов В.А. 2005а. Применение атомно-силовой микроскопии для мониторинга микробиологической коррозии алюминиево-магниевых сплавов // Поверхность. № 1. 54—59.
Алехова Т.А., Александрова А.В., Новожилова Т.Ю., Лысак Л.В., Загустина Н.А., Безбородов А.М. 2005б. Мониторинг микроорганизмов-деструкторов на пилотируемых орби-
видовой состав, сходный с таковым станции "Мир". Следует отметить, что микробный состав исследованных точек имеет свои особенности, но близок к характерному для жилых и промышленных помещений на Земле.
Число выявляемых на чашках колоний микроорганизмов довольно низкое, и в целом исследованные конструкционные материалы на РС МКС можно считать мало заселенными микроорганизмами-деструкторами. Однако среди мицелиальных грибов присутствуют виды, способные сильно корродировать алюминиево-магниевые сплавы и образовывать токсины.
Получаемые результаты активно используются в рамках работ по теме "МКС — Эксплуатация" Государственного контракта, выполняемых РКК "Энергия" по теме "Обеспечение ресурса эксплуатации элементов конструкции отсеков РС МКС в условиях воздействия технофильных микроорганизмов", а также по теме "Определение дополнительных воздействий на системы жизнеобеспечения от биологически активных веществ".
тальных комплексах // Прикладная биохимия и микробиология. 41. № 4. 435—443.
Алехова Т.А., Александрова А.В., Новожилова Т.Ю., Лысак Л.В., Загустина Н.А. 2006. Научный эксперимент "Биодеградация" на международной космической станции (МКС) // Докл. МОИП (Биотехнология охране окружающей среды). 39. 21—25.
Андреюк Е.И., Билай В.И., Коваль Э.З., Козлова И.А. 1980. Микробная коррозия и ее возбудители. Киев.
Викторов А.Н., Новикова Н.Д., Дешевая Е.А., Поликарпова Н.А., Поддуб-ко С.В., Брагина М.П. 1998. Сравнительная оценка биологических свойств микроорганизмов, выделенных в орбитальном комплексе "Мир" в различные сроки эксплуатации // Авиакосмическая и экологическая медицина. 32. № 2. 61—68.
Лугаускас А.Ю., Микульскене А.И., Шляужене Д.Ю. 1987. Каталог микромицетов-био-деструкторов полимерных материалов. М.
Методы почвенной микробиологии и биохимии. 1991 / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.
Новикова Н.Д. 2001. Основные закономерности формирования микрофлоры среды обитания орбитального комплекса "Мир" // Авиакосмическая и экологическая медицина. 34. № 4. 32—40.
Определитель бактерий Берджи: В 2-х т. 1997 / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.
Основы космической биологии и медицины. 1975. М.
Петрова-Никитина А.Д., Мокеева Л.В., Желтикова Т.М., Чекунова Л.Н., Антропова А.Б., Мокроносова М.А., Биланен-ко Е.Н., Сизова Т.П. 2000. Микобиота домашней пыли г. Москвы // Микол. и фитопатол. 34. № 3. 25—33.
Руденко А.В., Коваль Э.З., Савельев Ю.В., Алехова Т.А. Новожилова Т.Ю., Загустина Н.А., Безбородов А.М. 2003. Ми-кодеструкция полимерных материалов в условиях Земли и космоса // Космическая наука и технология. 9. 20—23.
Скуратов В.М., Загибалова Л.Б., Пушкин В . П . 2002. Родовой состав и микробная контаминация конденсата атмосферной влаги и питьевой воды систем водообеспечения орбитального комплекса "Мир" в период ЭО-4-27 // Авиакосмическая и экологическая медицина. 36. № 2. 28—32.
Bergey's manual of Systematic Bacteriology: 1st ed. / Eds. A. Balow et al. Vol. 1-4. Baltimore, 1984-1986.
Costello J.A. 1969. The corrosion of metals by microorganisms // Int. Biodent. Bull. 5. 101.
Davies R., Summerbell R.C., Halda-ne D. 1995. Fungal contamination in public buildings: A guide to recognition and management. Environmental Health Directorate, Health Canada, Ottawa.
Domsch K.H., Gams W., Anderson T.H. 1993. Compendium of soil fungi. London.
Gu J.D., Roman M., Elsseman T., Mitch e l R. 1988. The role of microbial biofilm in deterioration of space station candidate materials // Int. Biodeterior. Biodegradation. 41. N 1. 25—33.
Hoog G.S., de Guarro J. 1995. Atlas of clinical fungi. Utrecht.
Maren A.K. 2002. Identification of Common Aspergillus Species: 1st ed. Utrecht.
Klintworth R., Reher H.J., Viktorov A.N., Bohle D. 1999. Biological induced corrosion of materials II: new test method and experiences from MIR station // Acta Astronaut. 44. 569—578.
Pitt J.I. 1991. A laboratory guide to common Penicillium species. North Ryde.
The Prokaryotes. 1992. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Application / Eds. A. Balow et al. Vol. 1—4. Berlin.
Поступила в редакцию 27.02.07
EXPERIMENT "THE INITIAL STAGES OF BIOLOGICAL DAMAGE AND BIODETERIORATION IN SPACE"
T.A. Alekhova, A.V. Alexandrova, T.Yu. Novozhilova, L.V. Liysak, N.A. Zagustina
The species composition of microorganisms formed on the Russian Segment of the International Space Station (ISS RS) similar to microorganisms on the Mir space station, and indoor environment of Earth. Were founded 17 species of microscopic fungi, 7 genera of bacteria and 3 genera of actinomycetes. The abundance of microorganisms in the Russian Segment of the International Space Station was low, and it was change undulant. The some species of filamentous fungi was appertain to group of technophilous species, which can corrode aluminum-magnesium alloy (AMr-6) in model experiment.
