CC BY
48
УДК 664.002.3
Экологически безопасные методы
в интегрированной защите и сохранении растительной продукции
Е.И. Кипрушкина, канд. техн. наук, доцент, В.С. Колодязная, д-р техн. наук, профессор Институт холода и биотехнологий, Санкт-Петербург В.К. Чеботарь, канд. биол. наук ВНИИСХМ, Санкт-Петербург
В условиях современной экономики внедрение инновационных биотехнологий помогает быстро реагировать на вызовы рынка, одним из рациональных направлений по развитию устойчивых систем в агропромышленном секторе экономики многих стран оказалось внедрение в практику землепользования биотехнологий, замены химических пестицидов и агрохимикатов биологическими препаратами.
Биопрепараты становятся обязательным элементом интенсивных
Ключевые слова: антагонистические бактерии; бациллы; микробиологические препараты; фитопатогены; овощи; длительное холодильное хранение.
технологий современного конкурентоспособного экологически безопасного земледелия.
В заметной степени это может быть достигнуто в результате внедрения в растениеводство высоко-
Key words: antagonistic bacteria, bacilli, microbiological agents; phytopatho-gens, vegetables, prolonged cold storage.
эффективных микробиологических препаратов (МБП, в тексте также используются синонимы МБП — «микробные препараты», «биопрепараты»), изготовленных на основе активных штаммов микроорганизмов, в том числе полезных эндофитных и ризобактерий (ПЭРБ) [1-5].
Проблемы хранения растительной продукции стоят также остро, поскольку потери урожая от болезней в осенне-зимний период могут быть значительно выше, чем во время вегетации [6, 7]. Плоды и овощи нуждаются в безопасных и эффективных средствах их защиты в процессе длительного холодильного хранения.
При подборе биоагентов для разработки микробных препаратов наиболее часто используются представители ризосферных микроорганизмов родов Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Bacillus, Achromobacter, способных продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов и хорошо приспосабливаться к условиям ризосферы. Особенный интерес для разработки комплексных МБП по сумме полезных свойств представляют бациллы, которые занимают, в зависимости от группы природных и хозяйственных факторов, до 36 % всей микробной популяции [3, 4, 8]. Исследование
INNOVATIONS FOR FOOD, HEALTH AND ENVIRONMENTAL SAFETY
механизмов взаимодействия ПЭРБ с растениями служит базой для создания МБП как компонента систем устойчивого земледелия будущего.
При создании биопрепаратов учитывают следующие основные группы хозяйственно значимых свойств ПЭРБ.
Биологическая ассоциативная азотфиксация. Она вносит заметный вклад в азотное питание растений. Осуществляется гетеротрофными бактериями на поверхности и в тканях высшего растения, без образования морфологически выраженной структуры. В число активных диазот-рофов входят бактерии ВасШиз ззр., причем некоторые бациллы, в частности В. ро1утуха, могут интенсивно фиксировать азот также и в анаэробных условиях [2, 9].
Биосинтез литических ферментов антипатогенного действия. Бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду функционально различающиеся группы ферментов, лизиру-ющих стенки фитопатогенных грибов: протеазы, манназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, глюканазы, хити-назы. Первый микроорганизм, у которого обнаружена способность ли-зировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов, - В. зиЫШз. Литические ферменты бацилл обладают различной субстратной специфичностью. Некоторые, в частности, лизируя клеточные стенки фитопатогенных грибов, приводят к высвобождению содержимого гиф, которое служит дополнительным источником питания и энергии для бацилл.
Продуцирование антибиотиков и фитотоксинов. Бактерии - продуценты широкого спектра антибиотиков, угнетающих жизнедеятельность разнообразия фитопатогенных грибов и бактерий агроценоза [10]. Штаммы В. зиЫШз продуцируют антибактериальные и антифунгальные вещества как рибосомальной (суб-тилин, субтилозин и субланцин), так не рибосомальной природы (хлоро-тетаин, микобациклин, ризатацин, бациллян, диффицидин, липопроте-иды сурфактин, итурин, фенгицин). Наиболее активно синтез пептидных антибиотиков протекает в начале стационарной стадии роста, что облегчает интерпретацию данных лабораторной диагностики антифун-гальной эффективности штаммов-продуцентов.
Продуцирование фитогормонов и витаминов. Многие ПЭРБ, в том числе и бациллы, способны синтезировать фитогормоны — ауксины (индо-лил-3-уксусная кислота ИУК), гиббе-релины, цитокинины, этилен и др., а
также жизненно необходимые для развития растений витамины, такие как фолиевая кислота, фенилала-нин, биотин, тиамин, никотиновая
кислота, В., В...
' 6' 12
Индуцированный иммунитет. Способность микроорганизмов индуцировать устойчивость растений к болезням и вредителям, названная индуцированным иммунитетом, выделяется в самостоятельное перспективное направление использования ПЭРБ в растениеводстве. Выраженность данного эффекта в значительной степени варьирует в зависимости от бактериального штамма и вида растения, определяется продуцированием антибиотиков, конкуренцией за ионы железа, инфекционные сайты, активацией самозащиты растений [5].
Цели работы - изучение диагностической значимости методов лабораторного исследования ПЭРБ на наличие хозяйственно-ценных свойств на примере бациллярного препарата комплексного действия Экстрасол, апробирование его применения на этапах производства и длительного холодильного хранения сельскохозяйственной продукции.
Объект микробиологического исследования - продуцент биопрепарата комплексного действия Экстрасол — штамм Bacillus subtllls Ч-13, изолированный из черноземной почвы Республики Молдова. Биопрепарат Экстрасол зарегистрирован в установленном порядке (№ гос. рег. 0680-07-208-216-0-0-0-1).
Для определения антифунгальной и фитостимулирующей активности бактерии выращивали стационарно при 28 0С в течение 4 сут на картофельной среде, для анализа продуцирования штаммом фитогормонов — на минимальной минеральной среде.
Анализ антифунгальной активности бактериальной суспензии проводили методом колодцев. Споры гриба Fusarium graminearum (F.graminearum) вносили в агаризо-ванную среду PDA в количестве 106 спор/мл, а суспензия бактерий в количестве 100 мкл в колодцы диаметром 8 мм. Антифунгальную активность после инкубации в течение 24 сут определяли по диаметрам зон ингибирования гриба, образующихся вокруг колодцев.
После выращивания бактериальные клетки отделяли центрифугированием и проводили экстракцию культуральной жидкости (КЖ) эквивалентным объемом этилацетата. Экстракт выпаривали под вакуумом. Полученный сухой остаток растворяли в 350 мкл метанола с последую-
Таблица 1
Антифунгальная активность штамма Bacillus subtilis Ч-13 против гриба F.graminearum
Вариант
Разведение
Диаметр зоны ингибирования, мм
Примечание
Живая культура
КЖ
Экстракт -1 Экстракт -2 Экстракт -3
Нет
Нет 1:10 1:100 1:1000
31,0
12,5 14,0 15,0 15,0
Зона слабая
Зоны более активные, чем в варианте с КЖ
Таблица 2
Антагонистическая активность Bacillus subtilis Ч-13 по отношению к фитопатогенным бактериям и грибам
Диаметр зоны ингибирования, мм
бактерии
Erwinia Pseudo- Pseudo- Erwinia Clavibac-
carotovo- monas monas caroto- ter Mic-
ra A-1 syringiae syringiae vora higanense
8300 2314 3391 17-1
28,4+2,0 32,0+2,6 48,0+3,3 49,5+4,1 36,0+2,7
грибы
Phyto- Rhizocto- Fusarium Fusarium Pythium
phtora nia solani culmo- solani spp.
capsici rum
48,1+3,2 29,6+1,9 33,0+2,4 23,8+1,9 38,1+2,9
Таблица 3
Влияние биопрепарата на энергию прорастания и клубнеобразование картофеля (агрофон N60 P60 K60)
Сорт Вариант опыта Всходы на 21-й день после посадки, % Количество клубней, шт/раст.
Невский Контроль 52 6,6
Опыт 54 8,2
Опыт 70 4,3
Сантэ Контроль Опыт 62 65 9,1 11,0
Опыт 40 30 5,6 6,4 4,6
Опыт 44 56 6,4 6,8
сельский Опыт 61 7,5
щей фильтрацией через нейлоновый мембранный фильтр. Антифунгальная активность суммарной фракции метаболитов определяли аналогично тестированию активности бактериальной суспензии.
Анализ антифунгальной активности Bacillus subtilis Ч-13 показал, что максимальная ингибирующая активность по отношению к фитопатоген-ному грибу Fusarium graminearum отмечается у живой бактериальной культуры (табл. 1). Антифунгальная активность КЖ после отделения бактериальных клеток и суммарной фракции экстрагированных метабо-
^ ИННОВАЦИИ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЙ, МЕДИЦИНСКОЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ^ЩтШмЛ НОМЕРА^^^^^^^Ш
литов была, соответственно, в 2 и 2,5 раза ниже, чем у живой культуры. Вероятно, в антагонистическую активность заметный вклад вносят эк-зоферменты, продуцируемые именно живой культурой штамма Ч-13.
Антифунгальная активность, определяемая содержащимися в культу-ральной жидкости водорастворимыми метаболитами, составляет примерно 50 % от суммарной активности живой культуры в тестах на чашках Петри, а концентрированный этилацетатный экстракт активен даже при разведении в 1000 раз.
В табл. 2 приведены результаты изучения антагонистической активности В. БиЫШз Ч-13 на тест-культурах по отношению к фитопатоген-ным бактериям и грибам, показывающие, что штамм обладает широким спектром действия против различных возбудителей болезней растений.
Далее проводили закладку полевых опытов по изучению эффективности биопрепарата на разных этапах технологической цепи производства и хранения картофеля, в частности, при обработке клубней перед посадкой и дополнительной обработке ботвы в период вегетации.
Хозяйственно-ботанические сорта картофеля Невский, Луговской, Сан-тэ, Пушкинец, Елизавета и Детско-сельский опрыскивали жидкой формой препарата: посадочный материал (1 %-ный раствор Экстрасола с концентрацией 109 кл/мл, доза -
1 л/т); вегетационный материал в фазе появления первых листьев и в фазе появления бутонов до цветения (10 %-ный раствор Экстрасола с концентрацией 109 кл/мл, доза -
2 л/га). Контролем служили клубни и делянки, обработанные водой в те же периоды времени.
Применение биопрепарата оказало положительное влияние на элементы структуры урожая: все показатели в опытном варианте превосходили таковые в контроле (табл. 3). Количество всходов на 21-й день после высадки на всех обработанных сортах больше, что свидетельствует о повышении энергии прорастания и активном развитии клубней. Применение данного биопрепарата стимулировало прорастание клубней на 2-14 дней раньше, сокращало продолжительность межфазных периодов развития картофеля, активизировало рост растений в высоту и стеблеобразование, положительно влияло на фотосинтезирующий аппарат растения, а также существенно увеличивали площадь листовой поверхности, массу и количество клубней с одного растения и с единицы
площади. Эти факторы в конечном итоге способствовали повышению урожая картофеля суммарно по всем вариантам на 15 - 122 ц/га в зависимости от сорта.
При инокуляции происходит искусственное заселение поверхности клубней полезной микрофлорой, которая при высадке начинает активно размножаться и активно колонизировать ризосферу развивающегося растения. Ризосферные микроорганизмы находятся в сложных и многообразных взаимоотношениях с корневой системой растения, оказывая большое влияние на её поглотительную и синтетическую функции [2, 5, 9].
Испытания препарата показали его высокую биологическую эффективность против ризоктониоза, черной ножки, фитофтороза и ряда других болезней клубнеплодов: 52-70 % в зависимости от варианта опыта. Повышенной устойчивостью к указанным фитопатогенам обладал картофель сорта Луговской, особенно к фитофторозу. Биопрепарат оказывал также положительное влияние на потребительские свойства товарного картофеля: клубни были более крупные и выровнены по размерным фракциям, уменьшилось содержание мелких, нестандартных и уродливых экземпляров.
Оценка устойчивости картофеля к инфекционным заболеваниям после длительного холодильного хранения при температуре 3±1 °С и относительной влажности воздуха 9095 % показала, что применение биопрепарата при инокуляции посевного материала и вегетирующих растений позволяет повышать устойчивость клубней к основным фитопатогенам, вызывающим потери картофеля при хранении -Phytophthora infestans, Fusarium solani, Phoma tuberosа, что положительно сказывается на выходе товарной продукции и на сокращении абсолютного отхода. Так, через 8 мес хранения выход стандартных клубней продовольственного картофеля сорта Детскосельский в опыте снизился на 11,0 % (контроль - на 24,8 %), у продовольственного картофеля сорта Нев-ский - на 8,0 % (контроль - на 15,9 %), у картофеля сорта Невский (1-я репродукция) -на 1,74 % (контроль - на 4,3 %). Наибольшая сохраняемость характерна для картофеля при использовании посадочного материала высоких репродукций.
Таким образом, показана перспективность применения микробиологических препаратов различного назначения при выращивании сельско-
хозяйственных культур с целью усиления биологической составляющей агрофитоценозов и получения экологически безопасной, высококачественной и конкурентоспособной продукции с высокими потребительскими свойствами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Петров, В.Б. Микробиологические препараты в практическом растениеводстве России: функции, эффективность, перспективы/В.Б. Петров, В.К. Чеботарь //Рынок АПК. -2009. - № 7. - С. 16-18.
2. Тихонович, И.А. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем/И.А. Тихонович, Н.А. Проворов//Усп. еовр. биол. - 2007. - №.4. - С. 339357.
3. Чеботарь, В.К. Эффективность применения биопрепарата Экстра-сол/В.К. Чеботарь, А.А. Завалин, Е.И. Кипрушкина. - М.: Издательство ВНИИА, 2007. - 216 с.
4. Use of PGPB for biological control of plant diseases: principles, mechanisms of action and future prospects./S. Compant [et al.]//Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71. -№ 9. - P. 4951-4959.
5. Kloepper, J.W. Plant growth-promoting rhizobacteria as biological control agents/J.W. Kloepper//In: F.B. Metting, Jr., editor. Soil Microbial Ecology. M Dekker. - N.Y., 1993. - Р. 255-274.
6. Кипрушкина, Е.И. Защитно-стимулирующие свойства биопрепарата при вегетации и хранении картофе-ля/Е.И. Кипрушкина, В.Б. Петров, В.К. Чеботарь//Доклады РАСХН. -2005. - № 3. - С. 21-24.
7. Кипрушкина, Е.И. Экспериментальное обоснование биотехнологических основ хранения растительного сырья/Е.И. Кипрушкина, В.С. Ко-лодязная, А.В. Хотянович//Доклады РАСХН. - 2003. - № 3. - С. 47-49.
8. Кирюшин, В.И. Экологизация земледелия и технологическая поли-тика/В.И. Кирюшин. - М.: Изд-во МСХА, 2000. - 473 с.
9. Роль агглютинирующих белков ризобий и азотфиксирующих бацилл при взаимодействии с растением: сб.ст./под ред. В.В. Игнатова. - М.: Наука, 2005. - 260 с.
10. Schisler, D.A. The nature and application of biocontrol microbes: Bacillus spp. - formulation of Bacillus spp. for biological control of plant diseases/D.A Schisler, P.J Slininger, R.W. Behle//Phytopatol. - 2004. -Vol. 94. - P. 1267-1271.
