CC BY
24
Реферат.
Л1КУВАННЯ РАКУ ПРЯМОТ КИШКИ, В УМОВАХУРГЕНТНОГО Х1РУРГ1ЧН0Г0 СТАЦЮНАРУ
ГрЫцов О.Г., Совпель О.В., 31яд Аптарава.
Ключов1 слова: рак, пряма кишка, кишкова непрохщнють.
Метою роботи було вивчення можливосп виконання первинно- вщновлюючих радикальних резекцм з приводу рака прямо!' кишки, ускладненого кишковою непрохщнютю. У дослщження включен! 9 хворих, яким ургентно на висоп кишковоТ непрохщносл ви-конана брюшноанальна резещя прямо!' кишки с низведениям на промежину ободочноТ за Петровим-Холдиним-Нисневичем в модифкацп академка АМН УкраТни, проф. Г.В. Бондаря. В 7 випадках виконана радикальна операщя, в 1 випадку на фош не-видалимого парааортального пухлиного ¡нфтьтрату виконана пал1ативна операщя обсягом радикально! в 1 випадку на фош метастаз1в у печшку виконаа пал1ативна операщя. В результат! анатза ¡нтра- та пюляоперацмних ускпаднень встановлено, що виконання радикально! одномоментноТ первинно- вщновлювально!' операцп з приводу ускладненого раку прямоТ кишки дозво-ляе досягти задов1пьного близького та вщдаленного результату, що пщтверджус доцтьнють ТТ виконання.
УДК 57.086.83:616-001.4-002.44.2-089-084
ЭФФЕКТЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА
Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака АМН Украины, Донецк (директор - чл.-кор. АМНУ, профессор Гринь В.К.) Гринь В.К., Михайличенко В.Ю.
Трансплантация культуры мезенхималъных стволовых клеток животным с моделью инфаркта миокарда качественно и количественно улучшает функцию сердца за счет активации и усиление процессов репарации. Показано положительное влияние клеточной терапии на регенераторную способность миокарда при моделировании инфаркта миокарда. При экспериментальном инфаркте миокарда наблюдается уменьшение площади миокарда в 4 раза. После введения мезен-химальных стволовых клеток, темпы уменьшения площади инфаркта миокарда снижаются ( ~ в 2 раза). Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток приводит к значительному улучшению васкуляризации в зоне инфаркта миокарда ( ~ в 6 раз), что приводит к уменьшению ишемии в пограничные с инфарктом зонах и к уменьшению площади инфаркта.
Ключевые слова: инфаркт миокарда, мезенхимальные стволовые клетки, трансплантация.
Сердечно-сосудистые заболевания
это одна
из ведущих причин смертности в цивилизованных странах. Сердце взрослого человека имеет ограниченную способность к регенерации, поэтому мышца, погибшая при остром инфаркте миокарда (ИМ), обычно замещается не сокращающейся рубцовой тканью, вызывая прогрессирующую сердечную недостаточность. Трансплантация всего органа ограничена из-за недостаточного количества донорских сердец и необходимости в дальнейшей иммуносупрессии, не применяется повсеместно, поэтому в последние годы клеточная терапия вызывает огромный интерес как альтернативный способ восстановления сердца [2,6]. Стволовые клетки содержат большой потенциал для регенераторной медицины, особенно в замещении клеток в тканях которые едва ли имеют любую внутреннюю способность к регенерации, включая сердце. За последние несколько лет, описано несколько многообещающих результатов [1,5-7], но остается много препятствий для того, что бы стволовые клетки стали фактически использоваться для лечения пациентов м поврежденным сердцем.
Цель исследования - изучить роль мультипо-тентных мезенхимальных стволовых клеток изо-генных доноров в регенерации миокарда крыс после моделирования ИМ.
Материалы и методы исследования
Опыт проводили на 45 половозрелых самках крыс инбредной линии Вистар-Кайота, которые содержались в обычных условиях вивария Института неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака АМН Украины. Исследования проводились при соблюдении правил биоэтики. Всем животным моделировали инфаркт миокарда путем прошивания и лигирования левой межжелудочковой артерии после первого деления. Оперативные вмешательства проводили в условиях общего обезболивания, путем интрао-перитонеального введения калипсола и ксила-зина в дозах 60мг/кг и 7,5 мг/кг соответственно. Медикаментозный сон при правильном введении наступал через 2-3 минуты после введения и продолжался 110±5 минут. После достижения 3 ст. хирургического наркоза, выполняли тра-хеостому: линейным разрезом до 1 см по средней линии рассекали кожу животных и тупо зажимом раздвигали мышцы на передней поверхности шей. Трахею брали на зажим, поперечно в межкольцевом промежутке на 3 мм ниже перстневидного хряща рассекали трахею и в ее просвет вводили пластиковый катетер 14в (диаметр до 2 мм). После чего катетер подсоединяли с аппаратом искусственной вентиляции легких. Вентиляцию проводили с частотой 50-60 в минуту и объемом 1,5 мл на 100 г веса животно-
BiCHHK Украгнсъког медичног стоматологгчног акадежш
го. Адекватность вентиляции оценивали по сердечной деятельности и состояния кровоснабжения слизистой оболочки ротовой полости. Далее выполняли левостороннюю торакотомию в 5 межреберье, продольно вскрывали перикард. Прошивали переднюю межжелудочковую ветвь левой коронарной артерии в проксимальной части Prolene 7/0 (фирмы Ethicon, Inc.). После чего грудную полость ушивали послойно и во втором межреберье по среднекпючичной линии пунктировали плевральную полость для эвакуации воздуха. Далее отключали аппарат искусственной вентиляции от катетера, при правильно выполненной методике у крысы восстанавливаются адекватные дыхательныедвижения. Затем убирали катетер из трахеи и ушивали ее проле-ном 7/0, путем наложения узловых швов. После чего послойно ушивали мышцы над трахеей. Во время выполнения оперативного вмешательства выполняли мониторинг сердечной деятельности аппаратом ЭКТ - 1 подключенного по схеме 6 стандартных отведений.
Культуру эмбриональных клеток крысы изготовляли в Лаборатории клеточного и тканевого культивирования ИНВХ им. В.К. Гусака АМН Украины (зав. лабораторией - д.мед.н. Попандо-пуло А.Г.). Для получения культуры мезенхи-мальных стволовых клеток использовали костный мозг здоровых животных. Для предотвращения бактериальной контаминации их промывали физиологическим раствором, содержащим антибиотики. Костный мозг трубчатых костей крыс обрабатывали механически и фермента-тивно. Затем помещали в термостат при 37°С на 10-15 минут. Через 10-15 минут заингибирован-ную клеточную суспензию центрифугировали и сливали супернатант. Клеточный осадок заливали ростовой средой, содержащей 10 % ЭТС (Биолот, Санкт-Питербург) и помещали в куль-туральный матрас. Клеточный осадок ресуспен-дировали в ростовой среде Игла (Биолот, Санкт-Петербург), содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки (Биолот, Санкт-Петербург). Клетки, в количестве 1,5-2,0x106 кп/мл, помещали в культуральный флакон и культивировали в С02-инкубаторе при 37°С с 5% содержание С02 и 95% влажности. Среду заменяли через каждые три дня во всех культурах. Перед трансплантацией конфлуэнтную культуру клеток промывали буферным раствором и переводили в суспензию, используя стандартный раствор трипсина (2,5 г) на Хэнксе без Mg2+ и Са2+ (Sigma, USA). Ингибировали суспензию клеток добавлением сыворотки, затем центрифугировали, супернатант удаляли и суспензию клеток в физиологическом растворе отдавали на трансплантацию. Культуру клеток вводили крысам в бедренную вену из расчета 1 000 000 на 1 животное.
Через 2 недели после моделирования инфаркта миокарда путем десекции бедренной вены с последующей пункцией ее вводили
стромальные стволовые клетки в дозе 1000000 на 1 животное.
Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась на компьютере Pentium V, при помощи лицензионного пакета статистических программ Excel (Microsoft office XP).
Результаты и их обсуждение
Лигирование коронарной артерии у лабораторного животного приводило к образованию последовательных изменений, напоминающих картину острого ИМ у человека. У животных без лечения формировался обширный рубец, распространяющийся на все слои миокарда и по своим свойствам напоминающий картину трансмурального ИМ у человека.
При иммуногистохимическом окрашивании на актин и тропонин Т наиболее ярко визуализировалась тотальная гибель мышечных волокон в зоне рубцевания. К 30 дню стенка рубцующегося участка была полностью представлена соединительной тканью. При этом во все сроки обнаруживали пролиферирующие клетки соединительной ткани и сосудистой стенки, что говорит о том, что к данному сроку еще продолжаются процессы неполной регенерации и ремо-делирования. Следует отметить, что уже при качественном морфологическом исследовании после трансплантации МСК отмечалось существенное отличие морфологической картины в пораженном участке. Прежде всего, в участке инфаркта наблюдали перемежение участков сохранившихся мышц и полей рубцовой ткани. Данные изменения подтверждаются тем, что ни в одном из случаев после трансплантации МСК мы не наблюдали формирования аневризм. При иммуногистохимическом окрашивании на актин и тропонин Т мы наиболее четко видели перемежение участков сохранившихся мышц и полей рубцовой ткани. Кроме того, начиная со срока в 21 день мы обнаруживали лишь единичные пролиферирующие клетки в рубце, что говорит о завершении процесса рубцевания к данному сроку. Кроме того, обращало внимание различное состояние сосудов у леченых и нелеченых животных. У животных после трансплантации сосудов было больше на единицу площади, их просвет был меньше, они имели хорошо сформированную стенку.
При использовании гибридизации in situ мы обнаружили в формирующемся рубце у крыс-самок клетки с наличием Y-хромосомы в ядре, т.е. клетки-потомки пересаженных МСК. Такие клетки мы обнаруживали среди эндотелиальных клеток, в стенке формирующихся сосудов и среди фибробластов рубца. В пограничных с рубцом пучках миокарда мы не обнаруживали позитивных клеток. Таким образом, трансплантация МСК приводит к значительному улучшению вас-куляризации в зоне инфаркта, что, возможно, приводит к уменьшению ишемии в пограничных с инфарктом зонах, снижению ишемического по-
вреждения кардиомиоцитов в этих зонах, что в итоге способствует уменьшению площади рубца и предотвращению формирования аневризмы сердца. Доказано, что трансплантированные клетки активно участвуют в формировании сосудов и соединительной ткани в зоне рубцевания. Процесс рубцевания завершается к 21 дню после моделирования ИМ. При анализе морфо-метрических данных видно, что удельный объем инфарцированного участка у крыс без лечения составил 24,02% от первоначального объема, т.е. произошло уменьшение площади миокарда в 4 раза. В группах животных, которым выполняли трансплантацию, наблюдали всего двукратное уменьшение площади рубца. При этом у нелеченных животных 34% площади рубцующегося участка было занято соединительной тканью, а у леченных животных - 18%. Удельный объем сосудов в участке рубцевания у леченных животных был ниже, чем у животных без лечения, однако сами сосуды были различного строения. Так, у животных без лечения сосуды представляли собой широкие сосуды с большим просветом, тогда как у леченных животных это были сосуды небольшого диаметра. Поэтому мы также вычислили удельное количество сосудов на 100000 мкм2 ткани рубца. Из полученных данных видно, что удельное кол-во сосудов на единицу объема приблизительно в 6 раз больше уживотных после трансплантации.
Исследования хронотропной реакции экспериментальных животных на фармакологический стресс продемонстрировали, что трансплантация культуры МСК животным с моделью инфаркта миокарда качественно и количественно восстанавливает функцию сердца, по всей вероятности за счет активации и усиления процес-
сов репарации.
Выводы.
Итак в результате проделанной работы мы видим, что трансплантация мезенхимальных стволовых клеток полученных из костного мозга взрослых животных позволяет улучшить функциональные и морфологические показатели поврежденного миокарда. Предварительные данные позволяют сделать вывод, что наиболее прогрессивный в данном направлении является интрамиокардиальный путь введения культуры клеток.
Литература
1. Владимирская Е.Б., Майоров О.А., Румянцев С.А., Румянцев А,Г. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. - 2005.-С.392
2. Гринь В.К., Михайличенко В.Ю., Коноплянко В.А. Моделирование инфаркта миокарда в эксперименте // Нейронауки: теоретичы та KniHi4Hi аспекти.-2007.-Т.3.-№1.-С.8
3. Grin V., Mikhailichenko S. Cardiac remodeling in the rat infarct model after transplantation of stem cells // Kardiochi-rurgia i torakochirurgia Polska.-2007.-T.4.-supl.1.- S.14-15
4. Gabriella Agnoletti, Anna Cargnoni, Laura Agnoletti et al. Percutaneous coronary injection of bone marrow cells in small experimental animals* small is not too small // Pathology - research and practice.- 2007.-Vol.203.-P.801-808
5. Jain M., DerSimonian H., Brenner D.A., Ngoy S., Teller P., et al. Cell therapy attenuates deleterious ventricular remodeling and improves cardiac performance after myocardial infarction // Circulation.-2001.- Vol.103.-P.1920-1927
6. Leobon B., Garcin I., Menasche P., Vilquin J.T., Audinat
E., Charpak S. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.- Vol.100.-P.7808-7811
7. Scorsin M., Hagege A., Vilquin J.T., Fiszman M., Marotte
F. et al. Comparison of the effects of fetal cardiomyocyte and skeletal myoblast transplantation on postinfarction left ventricular function // J. Thorac. Cardiovasc. Surg.-Vol.119.-P.1169-1175
Реферат
ЕФЕКТИ ТРАНСПЛАНТАЦ11 МЕЗЕНХ1МАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛ1ТИН ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ 1НФАРКТ1 МЮКАРДА Гринь В.К., Михайл1ченко В.Ю
Ключов1 слова: ¡нфарктмюкарда, мезенх1мальы стовбуров1 кл1тини, транспланта^я.
Трансплантац1я культури мезенх1мальних стовбурових кл1тин тваринам з моделлю ¡нфаркту мюкарда якюно й ктькюно пол1п-шуе функцш серця за рахунок активацп й посилення процеав репарацп. Показано позитивний вплив кп1тинноТ терапп на реге-неративну здатнють м1окарда при моделюванн1 ¡нфаркту мюкарда. При експериментальному ¡нфаркту мюкарда спостертаеться зменшення площ1 м1окарда ~ в 4 рази. П1сля введения мезенх1мальних стовбурових кл1тин темпи зменшення площ1 ¡нфаркту мн окарда знижуються ( ~ в 2 рази). Трансплантац1я мезенх1мальних стовбурових кл1тин приводить до значного пол1пшення васку-ляризацп в зон1 ¡нфаркту мюкарда ( ~ в 6 раз1в), що приводить до зменшення ¡шемп в прикордонш з ¡нфарктом зонах I до зменшення площ1 ¡нфаркту.
