CC BY
47
БИОЛОГИЯ
УДК 612.73/.74-074:612.014.48
ЭФФЕКТЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ГАММА-ИЗЛУЧЕНИЕМ И НИЗКОИНТЕНСИВНЫМ КРАСНЫМ СВЕТОМ НА МЫШЕЧНЫЕ ТКАНИ КРЫС
© 2013 г.
А.П. Баврина1, В.А. Монич1, С.Л. Малиновская1, Е.И. Яковлева1, М.Л. Бугрова1, В. С. Ермолаев, Е.А. Дружинин2
'Нижегородская государственная медицинская академия ^Нижегородский областной онкологический диспансер
Поступнла в рвдакцню 23.01.2013
Рассмотрены особенности свободнорадикального окисления в мышечных тканях крыс после последовательного воздействия ионизирующим излучением и низкоинтенсивным широкополосным красным светом. Выявлено снижение уровня продуктов окислительной модификации белков в обработанных светом образцах. Изменения активности процессов перекисного окисления сопровождались альтерацией микроструктуры поперечно-полосатых мышечных волокон в опытной группе животных по сравнению с контрольной. На основе полученных данных сделан вывод о том, что низкоинтенсивный свет примененных в опытах спектра и интенсивности способен вызывать радиопротекторный эффект и может применяться для коррекции нарушений, вызванных воздействием ионизирующих излучений.
Ключевые слова: свободнорадикальное окисление, ионизирующие излучения, красный свет, ультраструктура скелетной мышцы.
В настоящее время в связи с широким использованием в медицине ионизирующих излучений актуальной задачей является поиск эффективных радиопротекторов. Ионизирующее излучение вызывает в живых тканях образование ионов, возбужденных молекул и свободных радикалов. В их числе возбужденные молекулы Н2О, которые диссоциируют с образованием двух радикалов: Н и ОН , последние, в свою очередь, ответственны более чем за половину последующих радиационных повреждений молекул ДНК [1]. Продуктами радиолиза являются и другие цитотоксические вещества, которые приводят к модификации многих биологически значимых молекул, изменяют активность процессов ферментативного распада белков, нарушают процессы синтеза ДНК и ферментов [2].
Низкоинтенсивный красный свет имеет способность реактивировать антиоксидантные ферменты, модифицировать процессы синтеза ДНК и белков [3-6] и может быть использован в качестве радиопротектора. Поскольку продукты свободнорадикального окисления липидов и белков являются универсальными маркерами повреждения тканей, их определение в ткани можно использовать для оценки воздействия
низкоинтенсивного красного света на скелетную мышечную ткань.
Цель данного исследования - оценка уровня продуктов окислительной модификации белков (ОМБ), перекисного окисления липидов (ПОЛ) и ультраструктуры мышечной ткани крыс на 4-е сутки развития лучевой болезни в контрольной серии и при воздействии низкоинтенсивным красным светом на очаг облучения.
Материалы и методы
Исследования проводили на беспородных белых крысах массой 180-250 грамм, которые были разделены на 2 группы. Контрольную группу составили 10 крыс, получивших локальную дозу облучения 9 Гр. Облучению подвергалась внутренняя сторона бедра опытного животного площадью 1 см2. Облучение проводилось на установке «Луч-1» (энергия гамма-квантов, получаемых при распаде кобальта-60, имеет два пика - 1.17 и 1.33 мэВ). Опытную группу составили 10 крыс, получивших локальную дозу облучения мышечной ткани бедра (9 Гр), и после этого ежедневно, в течение 4 дней, облучавшихся низкоинтенсивным красным светом. Продолжительность каждого сеан-
Таблнца 1
Содержание алифатических альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера в мышечной ткани бедра крыс
Длина волны Контрольная группа (ед. опт. пл. / г белка) Опытная группа (ед. опт. пл. / г белка) Фактической значение допустимого уровня значимости р
356 нм 0.53±0.061 0.60±0.082* р = 0.014
363 нм 0.54±0.058 0.38±0.094* р = 0.030
370 нм 0.55±0.007 0.40±0.089* р = 0.023
430 нм 0.34±0.034 0.21±0.041* р = 0.002
530 нм 0.048±0.016 0.033±0.010 р = 0.445
* Статистически значимые различия (р < 0.05).
са составляла 15 минут. Световому воздействию подвергалась зона, предварительно облученная гамма-квантами. Интенсивность света в зоне светового пятна 5 мВт/см2. Использовался широкополосный свет сверх яркого светодиода. Максимум спектрального диапазона соответствует 630 нм, ширина на полувысоте 20 нм. Забор материала (мышечной ткани бедра) в обеих группах животных производился на четвертые сутки после развития радиационного поражения.
Интенсивность свободнорадикального окисления оценивали по следующим показателям: содержанию продуктов ОМБ - алифатических альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера; уровню продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) и оснований Шиффа (ОШ).
Оценку ОМБ проводили по методу Е.Е. Дубининой [7], продуктов ПОЛ - по методу И.А. Волчегорского [8].
Для электронно-микроскопического исследования иссекали мышечную ткань, фиксировали ее в 2.5%-ном растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН = 7.4) с последующей дофиксацией 1%-ным раствором осмиевой кислоты, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации с последующей заливкой в смесь эпона с аралдитом [9]. Ультра-тонкие срезы готовили на ультратоме Leica UC7 и просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D фирмы FEI. Морфометрию проводили с помощью программы AnalySIS.
Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ для обработки биологической и медицинской информации Biostat. Распределения большинства изучаемых параметров были нормальными или близкими к таковому, что позволило использовать параметрический t-критерий Стьюдента для определения различий между двумя группами. Распределение продуктов ПОЛ нормальным не оказалось, поэтому был использован
непараметрический критерий Уилкоксона. Достоверными считались различия при р < 0.05. Результаты представлены в виде М±о, где М -среднее значение, а о - среднеквадратичное отклонение.
Результаты и обсуждение
Первым этапом работы было определение содержания алифатических альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера в мышечной ткани бедра крыс, а также определение общего белка биуретовым методом в этих же пробах для последующего представления результатов в ед. опт. пл. / г белка. Из данных литературы известно, что для алифатических альдегид-динитро-фенилгидразонов нейтрального характера спектр поглощения зарегистрирован в диапазоне 260-558 нм, а основного характера - в диапазонах 258-264 и 428-520 нм. Для алифатических кетон-динитрофенилгидра-зонов нейтрального характера диапазон 363367 нм, основного характера - 430-434 и 524535 нм. Поэтому образовавшиеся 2,4-динитро-фенилгидразоны регистрировали при следующих длинах волн: 356, 363, 370, 430 и 530 нм [7]. Результаты определения данных продуктов представлены в табл. 1.
Исходя из данных табл. 1, можно статистически достоверно заключить, что процесс ОМБ в мышечной ткани крыс опытной группы менее выражен, чем у крыс из контрольной группы. Для алифатических кетон-динитрофенилгидра-зонов основного характера различия были недостоверными. Вероятно это связано с небольшим количеством данных о содержании продуктов окисления в мышечной ткани крыс.
Следующей частью исследования было определение содержания промежуточных продуктов ОМБ в мышечной ткани бедра крыс (табл. 2).
Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что процесс образования промежуточных продуктов ОМБ в мышечной ткани крыс
Таблица 2
Содержание промежуточных продуктов ОМБ в мышечной ткани бедра крыс
Длина волны Контрольная группа (ед. оп. пл. / г белка) Опытная группа (ед. оп. пл. / г белка) Фактическое значение допустимого уровня значимости р
356 нм 0.24±0.077 0.21±0.029* р = 0.046
363 нм 0.25±0.075 0.25±0.044* р = 0.050
370 нм 0.244±0.090 0.242±0.046 р = 0.060
430 нм 0.19±0.046 0.15±0.025* р = 0.050
530 нм 0.031±0.08 0.025±0.007* р = 0.050
* Статистически значимые различия (р < 0.05).
Таблица 3
Содержание продуктов ПОЛ в мышечной ткани бедра крыс
Продукты ПОЛ Контрольная группа (отн. ед.) Опытная группа (отн. ед.) Фактическое значение допустимого уровня значимости р
ДК 0.24±0.049 0.22±0.014* р = 0.050
ТК 0.22±0.043 0.20±0.078* р = 0.050
ОШ 25.6±4.9 16.6±4.4* р = 0.020
* Статистически значимые различия (р < 0.05).
из контрольной группы идет более интенсивно, чем в тканях животных опытной группы. Анализируя полученные результаты, можно отметить, что достоверные различия были получены при определении содержания всех промежуточных продуктов ОМБ, кроме алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера.
Следующим этапом исследования стало определение продуктов липопероксидации в мышечной ткани бедра крыс. На этом этапе нами были также получены данные о достоверных различиях в содержании первичных продуктов ПОЛ (ДК и ТК) и конечных продуктов (ОШ) в гомогенате тканей опытной и контрольной групп животных (табл. 3).
Из данных табл. 3 следует, что в мышечной ткани крыс контрольной группы процессы образования промежуточных продуктов и накопления конечных продуктов ПОЛ также имеют более интенсивный характер, чем в мышечной ткани крыс опытной группы.
Полученные результаты подтверждают литературные данные, свидетельствующие об активации процесса свободнорадикального окисления белков и липидов в мягких тканях животных, подвергшихся воздействию ионизирующими излучениями, а также при их альтерации, обусловленной развитием патологических процессов [10-12].
Известно, что широкополосный красный свет положительно влияет на ход репаративных процессов в мышечных тканях крыс [13]. Кроме того, известно, что красный свет способен реак-
тивировать антиоксидантный фермент суперок-сиддисмутазу в мягких тканях животных [3]. Это позволяет объяснить наблюдаемую нормализацию уровня продуктов свободнорадикального окисления в ткани бедра крыс.
При изучении гистологического материала, проведенного с использованием серийных и ступенчатых срезов как в контрольной, так и в опытной группах, было выявлено, что изменения были одноплановы и отражали процессы альтерации с соответствующими ответными реакциями в виде развития гемодинамических и гемореологических расстройств, воспаления и компенсаторноприспособительных реакций. Было установлено также, что при воздействии низкоинтенсивным красным светом альтерации тканей ограничивались дистрофическими процессами. Кроме того, в образцах, относящихся к опытной группе, часто отсутствовал отек, расстройства кровообращения носили поверхностный характер, а клеточная инфильтрация была представлена единичными лимфогистиоцитарными элементами.
Электронно-микроскопический анализ скелетной мышцы контрольной группы животных выявил нарушение микроциркуляции: преобладали плазматические сосуды с небольшим содержанием аморфного осмиофильного материала (рисунок б); в отдельных капиллярах наблюдалась агрегация эритроцитов (рисунок в). Базальный слой (БС) местами был набухшим. В межклеточном пространстве обнаружены единичные макрофаги и эозинофилы. Мышечные волокна находились в состоянии незначительно-
■■ і -
у и
N • т
■ і ■ V
в
• • • • - . • : ■ . ■■
-;.
'■ ' ’ -'Ж?
--- V т •
Рис. Ультраструктура скелетной мышцы белых крыс (масштабный отрезок 2 мкм): а - интактной серии; б, в, г - контрольной серии; д, е - опытной серии.
Я - ядро, ЯД - ядрышко, К - просвет капилляра, ЭР - эритроцит
го сокращения, хотя в некоторых участках мио-фибриллы (МФ) были в состоянии релаксации. Большая часть ядер мышечных волокон не имела ядрышек (62%) (рисунок б). Отмечались фрагментация ядер (20%) и просветление кариоплазмы (рисунок г), набухание и вакуолизация митохондрий (МХ) (табл. 4). Во всех полях зрения встречались отдельные МХ с частичным или полным вымыванием матрикса и деструкцией кристаллов. В некоторых участках саркоплазма-тический ретикулум (СПР) был расширен. В саркоплазме имелись вторичные лизосомы, не-мно-гочисленные гранулы гликогена.
У крыс опытной группы в большинстве капилляров были свободные эритроциты и тонкодисперсный осмиофильный материал (рисунок д); в отдельных сосудах находились микроагрегаты эритроцитов. Мышечные волокна на значительном протяжении имели сохраненную структуру и значительное количество гранул
гликогена в саркоплазме. Ядра их содержали эухроматин и хорошо выраженные ядрышки (рисунок е). Отмечалось набухание МХ (табл. 4), однако они имели сохраненную структуру. В отдельных МХ выражено просветление матрикса. В субсарколеммальной области отмечена гиперплазия МХ. Отметим, что наблюдавшиеся в этой работе эффекты модификации ультра-структурных изменений в мышечных тканях бедра крыс, вызванные световым воздействием, согласуются с полученными ранее данными об альтерации капилляров и органелл кардиомици-тов миокарда крыс после ишемии [14, 15].
Заключение
Проведенное исследование показало, что воздействие низкоинтенсивного некогерентного красного света на облученную ионизирующим излучением мышечную ткань способствовало
Таблица 4
Средняя площадь митохондрий мышечных волокон
Группа животных Площадь митохондрий, мкм2 Количество митохондрий Фактическое значение допустимого уровня значимости р
Интактная группа 0.063±0.0044 n = 60 0.0001
Контрольная группа 0.24±0.02* n = 60 0.0001
Опытная группа 0.129±0.014* 3 in II n 0.0001
* Статистически значимые различия (р < 0.05).
снижению в ней уровней накопления продуктов ПОЛ и ОМБ. Кроме того, световое воздействие снижало проявления лучевой болезни на суб- и клеточном уровне, что выражалось в улучшении микроциркуляции и сохранении структуры мышечных волокон и их органелл.
Таким образом, низкоинтенсивный красный свет обладает выраженным радиопротекторным свойством и может применяться для коррекции нарушений, вызванных воздействием ионизирующих излучений.
Список литературы
1. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных. М: Высшая школа, 2004. 549 с.
2. Зайко Н.Н., Быць Ю.В., Атаман А.В. Патологическая физиология. К: Логос, 1996. 647 с.
3. Monich V., Drngova O., Lazukin V., Bavrina A. // J. Photochemistry and Photobiology. B. Biology. 2011. № 1. P. 21-24.
4. Корочкин И.М., Картелищев А.В., Бабушкина Г.В. и др. Комбинированная гелий-неон-лазерная терапия у больных с ишемической болезнью сердца // Кардиология. 1990. № 30. С. 24-28.
5. Котельницкая Л.И., Ходарева Н.К., Глушко А.Б. Перекисное окисление липидов как показатель эффективности лечения гелий-неоновым лазером больных хронической ишемической болезнью сердца // Клиническая медицина. 1989. № 67. С. 37-39.
6. Чичук Т.В., Страшкевич И.А., Клебанов Г.И. Свободнорадикальные механизмы стимулирующего действия низкоинтенсивного лазерного излучения // Вестник Российской академии наук. 1999. № 2. С. 27-32.
7. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и др. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. 1995. № 41. С. 24-26.
8. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г. и др. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови // Вопросы медицинской химии. 1989. № 1. С. 127-131.
9. Микроскопическая техника: руководство / Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. М.: Медицина, 1996. 544 с.
10. Шугалей И.В., Лукогорская С.А., Целинский И.В. Цепной процесс перекисного окисления белков - удобная модель для изучения повреждающей способности АФК. 2002. URL: http://www.biomed.spb.ru /cgibin/5.pl?n=5&name=21&v=3
11. Murphy M.E., Kehrer J.P. Oxidation state of tissue thiol groups and content of protein carbonyl groups in chickens with inherited muscular dystrophy // Biochemical J. 1989. № 260. С. 359-364.
12. Turi J.L., Yang F, Garrick M.D., Piantadosi C.A., Ghio A.J. The iron cycle and oxidative stress in the lung // Free Radical Biology and Medicine. 2004. № 36. С. 850-857.
13. Тимен А.Е. Светолечение гнойных ран мягких тканей // Клиническая хирургия. 1988. № 1. С. 51-53.
14. Малиновская С.Л., Монич В.А., Артифексова А.А. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. № 5. С. 509-511.
15. Монич В.А., Малиновская С.Л., Баймуратов Е.А., Соловьева Т.И., Яковлева Е.И., Рахчеева М.В. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). С. 668-672.
EFFECTS OF SUCCESSIVE EXPOSURE TO GAMMA RADIATION AND LOW-INTENSITY RED
LIGHT ON RAT MUSCLE TISSUES
A.P. Bavrina, V.A. Monich, S.L. Malinovskaya, E.I. Yakovleva, M.L. Bugrova,
V.S. Ermolaev, E.A Druzhinin
We consider the peculiarities of free radical oxidation in the skeletal muscle tissues of rats after their successive exposure to gamma-rays and to low-intensity broadband red light. A reduction in the level of protein oxidative modification products in the light-treated samples has been revealed. The changes in peroxidation activity are accompanied with the ultrastructure alteration of striated muscle fibers in the samples treated with light as compared to the control group samples. On the basis of the results obtained, it has been concluded that low-intensity broadband red light may have a radioprotective effect and can be used to correct the damage caused by ionizing radiation.
Keywords: free radical oxidation, ionizing radiation, red light, ultrastructure of skeletal muscles.
