CC BY
15ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ*
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
С.Б.Чекнев, Е.И.Вострова, Л.С.Писковская, А.В.Востров
ЭФФЕКТЫ КАТИОНОВ МЕДИ И ЦИНКА, СВЯЗАННЫХ БЕЛКАМИ у-ГЛОБУ-ЛИНОВОЙ ФРАКЦИИ, В КУЛЬТУРЕ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Цель. Оценка динамики роста культуры Staphylococcus aureus в присутствии металлоком-плексов у-глобулина, образованных с катионами меди и цинка, а также катионов металлов, примененных изолированно, в течение первых 24 час экспозиции. Материалы и методы. В суспензию бактерий S.aureus, содержавшую ориентировочно 103 КОЕ/мл, вносили образцы металлокомплексов у-глобулина человека с катионами меди или цинка в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Суспензию в объеме 5,0 мл инкубировали при 37°С в течение 24 час с отбором проб и подсчетом числа КОЕ в культуре на различные сроки экспозиции. Использовали принятый микрометод определения жизнеспособности бактерий. Результаты. Белок, трансформированный связыванием катионов меди, реализует бактериостатическую активность в логарифмической фазе роста культуры S.aureus на сроки от 3,0 до 6,0 час инкубации. Свободные катионы меди в еще большей степени, чем образованный металлокомплекс, тормозят размножение бактерий. Белок, трансформированный связыванием катионов цинка, реализует бактериостатическую активность на сроке 1,5 час инкубации S.aureus. Свободные катионы цинка бактериостатическим действием в отношении S.aureus не обладают. Заключение. В диапазоне физиологических концентраций белки у-глобулиновой фракции, образующие метал-локомплексы с катионами меди и цинка, могут выступать факторами, обладающими цитоста-тическим действием в отношении бактерий S.aureus. Катионы цинка реализуют бактериостатическую активность только в связанном у-глобулинами, тогда как катионы меди — и в свободном состоянии.
Журн. микробиол., 2014, № 3, С. 4—9
Ключевые слова: у-глобулины, медь, цинк, Staphylococcus aureus S.B.Cheknev, E.I.Vostrova, L.S.Piskovskaya, A.V.Vostrov
EFFECTS OF COPPER AND ZINC CATIONS BOUND BY y-GLOBULIN FRACTION IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS CULTURE
Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
Aim. Evaluation of Staphylococcus aureus culture growth dynamics in the presence of y-globulin metal-complexes formed with copper and zinc cations as well as cations of metals used in isolation during the first 24 hours of exposition. Materials and methods. Samples of human y-globulin metal-complexes with copper or zinc cations at a final concentration of 0.5 И-g/ml were introduced into S. aureus bacteria suspensions containing approximately 103 CFU/ml. Suspension at the volume of 5.0 ml was incubated at 37 0C for 24 hours with sampling and CFU calculation in the culture at various exposure periods. An accepted micromethod for determination of viability ofbacteria was used. Results. The protein transformed by copper cation binding realizes bacteriostatic activity in the logarithmic growth phase of S. aureus culture from 3.0 to 6.0 hours of incubation. Free copper cations inhibit bacterial reproduction at a higher degree than the metal-complex. The protein transformed by zinc cation binding realizes bacteriostatic activity at 1.5 hours of S. aureus incubation. Free zinc cations do not have bacteriostatic effect against S. aureus. Conclusion. Proteins of the y-globulin fraction in the range of physiological concentrations forming metal-complexes with copper and zinc cations may be factors
*В данном номере делается отступление от обычных разделов журнала (ред.).
that have cytostatic effect against S. aureus bacteria. Zinc cations realize bacteriostatic activity only in y-globulin bound state whereas copper cations — also in the free state.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 3, P. 4—9
Key words: y-globulins, copper, zinc, Staphylococcus aureus
ВВЕДЕНИЕ
Сегодня не подлежит сомнению первостепенная роль катионов металлов в поддержании жизнедеятельности бактериальной клетки и реализации ее патогенных свойств в организме хозяина. Выступая структурными, каталитическими или регуля-торными компонентами биомакромолекул, металлы вовлечены в обеспечение многих биологических процессов, принципиально важных для функционирования бактериальной клетки и определяющих ее вирулентность [9, 13].
Известно, в то же время, что высокие концентрации катионов токсичны для бактерий. Поэтому бактериальная клетка располагает эволюционно закрепленными механизмами и факторами детоксикации, переводящими металл в состояние и форму, снижающие или исключающие его токсическое воздействие [9, 12 — 14]. К таким факторам и механизмам можно отнести синтез специфических экспортеров металлов Ctr-1, АТФаз типа А и Р [9, 12, 13], экспрессию белков, подобных металлотионеинам [12], активацию импортера Zip8, облегчающего секвестрацию связываемого металла в клетке [9, 12], окисление металлов в периплазме [12].
Работами последнего времени установлено, что в организме человека катионы меди и цинка, критически значимые в биологии ряда патогенных и условно патогенных бактерий [11, 14], могут циркулировать в связанном белками у-глобулиновой фракции состоянии [3, 7, 15]. Хелатирование катионов у-глобулинами и образование белковых металлокомплексов происходят в условиях, приближенных к физиологическим [7, 8], что предполагает возможность прямого контакта патогена с подобными белковыми металлокомплексами в ходе развития инфекционного процесса.
Целью работы явилась оценка динамики роста культуры Staphylococcus aureus в присутствии металлокомплексов у-глобулина, образованных с катионами меди и цинка, а также катионов металлов, примененных изолированно, в течение первых 24 час экспозиции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения белковых металлокомплексов использовали препарат человеческого сывороточного у-глобулина (ICN) в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,06 — 7,12) с концентрацией белка по навеске 100 мкг/мл. Освобожденные от крупных ассо-циатов мембранной фильтрацией (0,45 мкм, Millipore) образцы у-глобулина инкубировали в течение 1 час при 37°С с водным сульфатом меди (Merc) или хлоридом цинка; концентрация металла — 0,5 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы у-глобулина, инкубированные в тех же условиях, но без солей указанных металлов.
По истечении срока инкубации опытные и контрольные образцы в объеме 10 мл подвергали двукратной молекулярной ультрафильтрации в ячейках Ultracel-30k (Millipore) в режиме 1700 g 5 мин с умеренным охлаждением. По окончании фракционирования супернатанты поднимали из ячеек, восстанавливали в 0,15 М растворе NaCl и как и на всех этапах исследования анализировали спектрофотометрически в ультрафиолете в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм с шагом 10 нм в полуавтоматическом режиме с использованием дифференцирующего спектрофотометра PU 8730 UV/VIS (Philips).
Содержание свободных (не связавшихся с белком) металлов в фильтрате оценивали с использованием фотометрии реакций комплексообразования: меди — с диэ-
тилдитиокарбаматом натрия (pH 9,0 — 9,2), длина волны 440 нм; цинка — с о-фенантролином (нейтральный рН), длина волны 226 нм. Далее производили расчет концентрации металлов, связавшихся с белком.
Расчет показателей изменения оптической плотности и молярных отношений в растворе осуществляли на основании концентрации у-глобулина, установленной спектрофотометрически при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0,7). Кислотность образцов контролировали с помощью электронного рН метра-иономера Эксперт-001 (Эконикс-Эксперт).
Первичная культура S.aureus получена методом посева патологического биоматериала человека на элективные и селективные питательные среды [5].
Для построения кривых роста бактерий из суточной культуры S.aureus, выращенной на чашках Петри с питательным агаром (Himedia), с использованием стандарта мутности и серии последовательных десятикратных разведений в питательном бульоне (Himedia) готовили суспензию, содержавшую ориентировочно 103 КОЕ/мл. В полученную суспензию вносили образцы металлокомплексов у-глобулина с медью или цинком и контрольные белки (конечная концентрация 0,5 мкг/мл), а также солевые растворы меди (водный сульфат, Merc) или цинка (хлорид), содержание металлов в которых соответствовало их количеству, связавшемуся с белком на стадии получения экспериментальных образцов (меди — 1,0 нг/мл, цинка — 2,5 нг/мл в 0,15 М NaCl), или контрольный 0,15 М NaCl.
Суспензии бактериальных клеток в объеме 5,0 мл инкубировали при 37°С в течение 24 час. Отбор проб и подсчет числа КОЕ в культуре производили в сроки 1,5; 3,0; 4,5; 6,0 и 24 час инкубации в соответствии с принятым микрометодом определения жизнеспособности бактерий.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Как видно на рис., белок, трансформированный связыванием катионов меди, реализует бактериостатическую активность в логарифмической фазе роста культуры S.aureus в сроки от 3,0 до 6,0 час инкубации бактериальных клеток. В сравнении с контрольным 0,15 М раствором NaCl торможение роста культуры составило от 0,11 до 0,41 ед. логарифма КОЕ/мл, или от 2,30х105 до 1,03х107 клеток /мл.
Обнаруженная активность, по-видимому, определяется хелатированными белком катионами меди, способными в еще большей степени, чем полученный металло-комплекс, ослаблять пролиферацию бактериальных клеток на те же сроки инкубации S.aureus. В сравнении с 0,15 М раствором NaCl, в присутствии меди, примененной в контрольной дозе 1,0 нг/мл, торможение роста культуры составило от 0,35 до 0,59 ед. логарифма КОЕ/мл, или от 1,35х105 до 1,65х107 клеток/мл.
ь.и
1,0 -.-.-.
3,0
Показатели роста культуры S.aureus в присутствии металлокомплексов человеческого сывороточного у-глобулина, образованных с катионами меди, и катионов меди, примененных изолированно.
По оси абсцисс: время инкубации, час; по оси ординат: ^ (КОЕ/мл); ось абсцисс проведена по концентрации 104 КОЕ/мл. 1 — 0,15 М раствор №С1; 2 — трансформированный медью у-глобулин (белка 0,5 мкг/мл, связанной меди 1,0 нг/мл); 3 — медь (1,0 нг/мл в 0,15 М растворе №С1).
В исследованиях примененные в дозе 1,0 нг/мл катионы меди проявляли тенденцию к реализации бактериостатической активности даже в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa. В сравнении с бактериями, инкубированными в присутствии 0,15 М раствора NaCl, торможение роста культуры на сроке наблюдения 4,5 час составило 0,14 ед. логарифма КОЕ/мл, или 7,50х105 клеток/мл.
Белок, трансформированный связыванием катионов цинка, аналогично метал-локомплексу у-глобулина, образованному с катионами меди, при выходе на логарифмическую фазу роста культуры S.aureus (срок наблюдения 1,5 час) реализовал бакте-риостатическую активность. В сравнении с действием препарата нативного у-глобулина, торможение роста клеток в культуре в присутствии полученного метал-локомплекса составило 0,24 ед. логарифма КОЕ/мл, или 7,05х105 клеток/мл.
Бактериостатическое действие комплекса с цинком, в отличие от трансформированного медью у-глобулина, не связано с прямыми эффектами металла, который мог бы захватываться бактериями в случае его локализации на внешних металлосвязы-вающих сайтах белковых молекул, поскольку в присутствии катионов цинка, примененных изолированно в контрольной дозе 2,5 нг/мл, рост культуры S.aureus соответствовал нативному белковому контролю.
Сказанное подтверждается результатами, полученными по достижении стационарной фазы роста культуры (24 час экспозиции), когда при попарном сравнении эффектов экспериментальных образцов и их контроля разница в действии цинкового металлокомплекса у-глобулина и изолированно катионов цинка оказывалась максимальной.
В исследованиях зарегистрировать эффекты белкового металлокомплекса, образованного с катионами цинка, в культуре клеток не удалось.
ОБСУЖДЕНИЕ
Планируя постановку описанных экспериментов, мы полагали, что хелатирование из периглобулярного пространства катионов металлов будет приводить к изменению (нарастанию) ферментативной активности антител и функционально связанных с ними белков плазмы крови, поскольку эта активность, как показано ранее, реализуется в режиме металлозависимости [1, 2, 4, 6].
Речь могла идти о протеиназной активности (расщепление фибронектина), свойственной гомореактантам [4], и супероксиддисмутазной активности (диспропорцио-нирование свободных радикалов), характеризующейся цинк/медь-зависимостью и определяемой у Р-белков [1], полноразмерных антител [6] и коротких олигопептидов, входящих в структуру аминокислотной последовательности, формирующую «шарнирную» область IgG [2]. Казалось, что встраивание металла в сайты молекул антител, подобное активным центрам металлоферментов, должно усиливать энзиматическую активность последних, а это, в свою очередь, могло бы существенным образом влиять на жизнеспособность бактерий — за счет прямого ферментативного воздействия на поверхностные белковые структуры бактериальной клетки или изменения редокс-потенциала в ее микроокружении.
Действительно, металлокомплексы белков у-глобулиновой фракции, образованные с катионами как меди, так и цинка, обладали способностью тормозить размножение бактерий в культуре S.aureus. При этом катионы цинка изолированно такими свойствами не обладали. Следовательно, формирующийся в условиях, приближенных к физиологическим, белковый металлокомплекс с цинком обретает и реализует в культуре бактериальных клеток принципиально новые эффекторные свойства, отсутствующие у его белкового и катионного контроля.
В отличие от цинка, свободные катионы меди реализуют в культуре выраженную бактериостатическую активность, которая заметно ослабляется в условиях хелатиро-вания катионов белками у-глобулиновой фракции. При этом, однако способность тормозить рост колоний S.aureus не утрачивается в системе полностью, а реализуется белком, содержащим в составе присоединенные катионы меди.
Не исключено, что механизмы детоксикации, выступающие одним из факторов вирулентности бактерий [9, 13], ориентированы на эффлюкс бактериальной клеткой
именно свободной меди, которая и активирует эти механизмы [9, 13]. Тогда металл, поступивший в клетку в связанном с белком состоянии, может выводиться бактерией менее эффективно и иметь достаточно времени для реализации своего бактерио-статического действия.
Сказанное очевидно демонстрируют результаты опытов с цинком. Цинк, как и медь, в высоких дозах токсичен для бактерий [13]. Его эффлюкс бактериальной клеткой, как и эффлюкс меди, усиливается в условиях внутриклеточного повышения содержания металла [13]. Mеханизмы детоксикации S.aureus исключают действие свободных катионов цинка и оказываются не эффективными в отношении катионов, поступивших с хелатировавшим их у-глобулином.
Следовательно, если в реализацию описанных бактериостатических эффектов металлокомплексов у-глобулина конкретный вклад вносит вызываемое связыванием меди и цинка изменение ферментативной активности антител [2, 6], то обнаруженная разница в свойствах «медного» и «цинкового» белковых комплексов (в сопоставлении с эффектами свободных катионов меди и цинка, соответственно) во многом может определяться активностью бактериальных систем детоксикации, по-разному отвечающих на повышение содержания в клетке свободного и связанного белком металла.
В разработке стратегии использования токсических свойств металлов для борьбы с патогенными микроорганизмами следует учитывать однако, что эффективность бактериальных систем детоксикации по тяжелым металлам необычайно высока [9, 12, 13]. В примененных нами экспериментальных условиях обнаружено бактериоста-тическое действие свободных катионов меди в культуре P.aeruginosa. В то же время, известно, что бактерии P.aeruginosa высокорезистентны к меди [14]. Резистентность возникает в динамике длительной экспозиции культуры с самими катионами меди [10], когда бактерии, наряду с резистентностью к меди, обретают устойчивость и к высоким дозам катионов цинка [10].
Л ИТЕРАТУРА
1. Кульберг А.Я., Петяев И^., Замотаева Н.Г. Каталитические свойства продуктов катаболит-ного распада клеточных рецепторов (R-белков). Иммунология. 1988, 3: 37-40.
2. Кульберг А.Я., Оганян F.F., Шибнев В.А. Утилизация радикалов кислорода синтетическими пролин-богатыми олигопептидами. Биохимия. 1992, 57 (11): 1744-1749.
3. Кульберг А.Я., Беркун Ю.Б., Чекнев С.Б. Влияние субфракций IgG с различным сродством к переходным металлам на спонтанную бласттрансформацию лимфоцитов человека in vitro. Иммунология. 1997, 6: 7-9.
4. Mаргулис Г.У., Бабаева Е.Е., Неугодова Г.Л., Бартова Л^., Кульберг А.Я. Сывороточный антииммуноглобулин человека — пепсиновый агглютинатор гомореактант как протеиназа. Иммунология. 1992, 2: 55-57.
5. Mедицинская микробиология. Под ред. В.И.Покровского и О.К.Поздеева. M., ГЭОTAР-медиа, 1998.
6. Петяев И^., Кульберг А.Я. Ферментативные свойства антител и клеточных рецепторов. Иммунология. 1988, 5: 12-14.
7. Чекнев С.Б., Бабаева Е.Е., Голуб А.Е., Денисова Е.А., Воробьева У.А. Эффекты меди и цинка при связывании с человеческим сывороточным у-глобулином. Mед. иммунология. 2006, 8 (5-6): 615-622.
8. Чекнев С.Б., Ефремова И.Е., Денисова Е.А., Юшковец Е.Н. Иммуноферментный анализ модифицированного катионами металлов у-глобулина на низких концентрациях образцов. Росс. иммунол. журнал. 2008, 2 (11); 1: 55-62.
9. Botella H., Stadthagen G., Lugo-Villarino G. et al. Metallobiology of host-pathogen interactions: an intoxicating new insight. Trends Microbiol. 2012, 20 (3): 106-112.
10. Caille O., Rossier C., Perron K. A copper-activated two-component system interacts with zinc and inipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 2007, 189 (13): 4561-4568.
11. Corbin B.D., Seeley E.H., Raah A. et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 2008,319, Feb.15: 962-965.
12. Hodgkinson V., Petris M.J. Copper homeostasis at the host-pathogen interface. J. Biol. Chemistry 2012, 287 (17): 13549-13555.
13. Hood M.I., Skaar E.P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Rev. Microbiol. 2012, 10: 525-537.
14. Samanovic M.I., Ding C., Thiele D.J., Darwin K.H. Copper in microbial pathogenesis: medding with the metal. Cell. Host. Microbe. 2012, 11: 106-115.
15. Siberil S., Menez R., Jorieux S. Effect of zinc on human IgG1 and its FcyR interactions. Immunol. Letters. 2012, 143: 60-69.
Поступила 17.10.13
Контактная информация: Чекнев Сергей Борисович , д.м.н., 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)190-43-88
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
О.В.Бухарин, А.В.Сгибнев, С.В.Черкасов
РОЛЬ ПРО- И АНТИОКСИДАНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕХАНИЗМОВ ГОМЕОСТАЗА СИМБИОЗА (НА МОДЕЛИ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА)
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Изучение продукции бактериальных про- и антиоксидантов в вагинальном биотопе и анализ их роли в регуляции механизмов гомеостаза симбиоза. Материалы и методы. Исследовали продукцию пероксида водорода, ингибиторов каталазы и антиоксидантов у бактерий, выделенных от 63 женщин с эубиозом влагалища и у 53 — с дисбиозом. Продукцию про- и антиоксидантов регулировали лактатом, летучими жирными кислотами, полиаминами и экзополисахаридами Lactobacillus plantarum и Corynebacterium minutissimum, бактерицид-ность метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл усиливали добавлением ионов железа (II). Результаты. Для состояния эубиоза отмечен высокий уровень продукции проок-сидантов и антиоксидантов, а их соотношение близко к единице, для биотопов с дисбиозом характерно многократное преобладание уровня микробных антиоксидантов над прооксидан-тами. Пероксидпродуцирующие симбионты являются важным компонентом системы генерации гидроксильных радикалов, которые являются высокоэффективным дезинфектантом широкого спектра действия. Заключение. Поддержание баланса продукции про- и антиокси-дантов симбионтами определяет гомеостаз симбиоза вагинального биотопа. Выявленная высокая биоцидная активность гидроксильных радикалов, образующихся из пероксида водорода нормофлоры за счет создания оптимальных условий для их генерации путем подбора соответствующих концентраций ионов железа (II) и Н2О2, открывает перспективы разработки новых способов дезинфекции.
Журн. микробиол., 2014, № 3, С. 9—15
Ключевые слова: антиоксиданты, активные формы кислорода, бактерии, вагинальный биотоп, гидроксильный радикал, дезинфекция, лактобациллы, пероксид водорода, прооксиданты, симбиоз
O.V.Bukharin, A.V.Sgibnev, S.V.Cherkasov
THE ROLE OF PRO- AND ANTIOXIDANTS OF MICROORGANISMS IN REGULATION OF SYMBIOSIS HOMEOSTASIS MECHANISMS (ON THE MODEL OF HUMAN VAGINAL BIOTOPE)
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Study the production ofbacterial pro- and antioxidants in vaginal biotope and analysis of their role in regulation of symbiosis homeostasis mechanisms. Materials and methods. Hydrogen peroxide, catalase inhibitors and antioxidant production in bacteria isolated from 63 women with vaginal eubio-sis and 53 — with dysbiosis were studied. Production of pro- and antioxidants was regulated by lactate, volatile fatty acids, polyamines and Lactobacillus plantarum and Corynebacterium minutissimum polysaccharides, metabolite bactericidity of peroxide producing lactobacilli was enhanced by addition of iron (II) ions. Results. A high level of pro- and antioxidant production was noted for eubiosis state, and their ratio was close to 1, for biotopes with dysbiosis a multiple predominance of microbial antioxidant levels over pro-oxidants was characteristic. Peroxide producing symbionts are an important component
