CC BY
71
УДК 576.364: 616.5-002
ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ПРИРОДНЫХ ВОД НА КЕРАТИНОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
Наталья Сергеевна ЗАЙЦЕВА, Антон Владимирович ЧЕЧУШКОВ, Петр Михайлович КОЖИН, Анна Евгеньевна ЛЕМЗА, Виктор Олегович ТКАЧЕВ, Наталия Геннадьевна ЛУЗГИНА
ФГБУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Природные высокоминерализованные воды широко применяют для лечения заболеваний кожи. Вместе с тем механизмы их влияния на клетки кожи человека не достаточно изучены. В данной работе на кератиноцитах человека НаСаТ in vitro было показано, что рапа озера Малое Островное в дозах, не обладающих цитотоксиче-ским эффектом, вызывает арест клеточного цикла в фазе G0/G1 с последующим торможением пролиферации и увеличением экспрессии маркеров дифференцировки кератиноцитов, лорикрина и филаггрина. Полученные результаты свидетельствуют о начале терминальной дифференцировки кератиноцитов под влиянием рапы и могут быть использованы для модуляции процессов воспаления в эпидермисе, связанных с дисрегуляцией и/или десинхронизацией процессов клеточной пролиферации и дифференцировки.
Ключевые слова: высокоминерализованные воды, гиперосмотический стресс, кератиноциты, пролиферация, дифференцировка.
В физиологических условиях процессы пролиферации и последующей дифференцировки кератиноцитов кожи в направлении от базально-го к роговому слою обеспечивают формирование эпидермального барьера, одна из функций которого состоит в защите внутренней среды организма. При ряде заболеваний кожи, в частности при атопическом дерматите, происходит усиление пролиферации клеток кожи и нарушение их последующей дифференцировки, а также угнетение апоптоза, что приводит к нарушению барьерных свойств эпидермиса и избыточности продуктивной фазы воспаления [1].
Одним из методов лечения атопического дерматита является бальнеотерапия высокоминерализованными природными водами, в частности рапой, полученной из воды озера Малое Островное Краснозерского района Новосибирской об-
ласти [4]. После воздействия рапой на очаги лихенификации кожи, проявляющейся, наряду с другими симптомами, повышенной пролиферацией кератиноцитов, снижается интенсивность воспаления и пролиферативных акантозов, исчезают косметические проявления воспаления [2, 3]. Однако механизмы, лежащие в основе описанных эффектов, остаются недостаточно изученными.
В качестве модели кератиноцитов человека в работе использована клеточная линия НаСаТ, полученная из спонтанно трансформированных эпителиальных клеток кожи взрослого человека [5]. Клетки линии НаСаТ сохраняют полный диф-ференцировочный потенциал, и, в определенных условиях, экспрессируют классические маркеры дифференцировки кератиноцитов, такие как цитокератины-1 и 10, инволюкрин и филаггрин.
Зайцева Н.С. - научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов физиологии и патологии клетки, e-mail: nszaitseva@gmail.com
Чечушков А.В. - научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов физиологии и патологии клетки, e-mail:achechushkov@gmail.com
Кожин П.М. - научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов физиологии и патологии клетки, e-mail: kozhinpm@gmail.com
Лемза А.Е. - младший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов физиологии и патологии клетки, e-mail: lemza.ae@gmail.com
Ткачев В.О. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов физиологии и патологии клетки, e-mail: tkachev_victor@mail.ru
Лузгина Н.Г. - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов физиологии и патологии клетки, e-mail:ngluzgina@gmail.com
Клетки данной линии способны полноценно дифференцироваться и образовывать многорядные упорядоченные пласты [6, 7].
Цель работы - исследовать in vitro клеточные механизмы гиперосмотического стрессирования кератиноцитов человека природными высокоминерализованными водами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клетки линии HaCaT культивировали в среде F12/DMEM с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, США), 4,5 мг/мл глутамина, 50 ЕД/мл пенициллина, 200 мг/мл трептомицина (полная ростовая среда) (Invitrogen, США) при 37 оС в 5 % атмосфере СО2.
Гиперосмотическое воздействие на клетки линии HaCaT моделировали добавлением в куль-туральную среду раствора соли «Рапан» (рР) из рапы озера Малое Островное Краснозерского района Новосибирской области в концентрациях 2, 4 и 8 г/л.
Для определения количества жизнеспособных клеток использовали МТТ-тест. После образования полумонослоя в лунках культураль-ного планшета клетки культивировали в течение 24 ч с рР в диапазоне концентраций 2-8 г/л, после чего добавляли МТТ (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2#-тетразолий, Sigma-Aldrich, США) в концентрации 0,15 мг/мл. Через 3 ч среду удаляли, образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсуль-фоксида (Биолот, Россия) и измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 540 нм, используя планшетный спектрофотометр BioTek ELx808 (Biotek, США).
Для определения пролиферативной активности клеточную суспензию инкубировали в течение 10 мин с 20 мкМ раствором сукцинимидиль-ного эфира карбоксиметилфлуоресцеина (CFSE, Sigma-Aldrich) при 37 оС в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4, Биолот, Россия), содержащем 0,1 % бычьего сывороточного альбумина (BSA, Amresco-Inc., США). После инактивации избытка CFSE PBS клетки ресуспендировали в полной ростовой среде, рассаживали в лунки 96-луноч-ного планшета и культивировали в течение 24 ч с рР в диапазоне концентраций 2-8 г/л, после чего отмывали и меняли культуральную среду. Флуоресценцию CFSE измеряли через 24 и 48 ч после отмывки, используя проточный цитофлуориметр FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Исследование клеточного цикла проводили при помощи йодида пропидия (Sigma-Aldrich, США). После культивирования с рР в течение заданного времени клетки снимали с культураль-
ного пластика, отмывали от культуральной среды PBS и фиксировали в ледяном 70 % этаноле в течение 2 ч, после чего инкубировали в течение 15 мин в гипотоническом растворе йодида про-пидия (PI, Sigma, США) с РНКазой (Invitrogen, США) (10 мл 0,1 % Triton X-100 (Биолот, Россия), 2 мг РНКазы, 20 мкг/мл PI). Флуоресценцию PI определяли с помощью проточного цитофлуори-метра FACSCalibur.
Индукцию апоптоза и некроза определяли по величине трансмембранного митохондриаль-ного потенциала (с помощью флуоресцентного красителя 3,3'-дигексилоксакарбоцианина йодида, DiOC6, Invitrogen, США) и целостности клеточной мембраны (по проницаемости для PI) соответственно. Для этого кератиноциты инкубировали в течение 15 мин при +37 оС в полной культуральной среде, содержащей 40 нМ DiOC6, затем отмывали от избытка красителя раствором PBS и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 10 мкг/мл PI. После однократной отмывки флуоресценцию клеток (A,Em = 520 нм для DiOC6 и Xgm = 670 нм для PI) измеряли c помощью проточного цито-флуориметра FACSCalibur. Клетки с высоким значением интенсивности флуоресценции DiOC6 и неповрежденной клеточной мембраной принимали за жизнеспособные, клетки œ сниженным митохондриальным потенциалом и непроницаемые для PI - за находящиеся на ранних стадиях апоптоза, клетки с нарушенной целостностью мембраны - за некротически измененные клетки.
Индукцию терминальной дифференцировки оценивали по экспрессии филаггрина и лорикри-на при помощи иммунофлуоресцентного окрашивания. Клетки инкубировали на покровных стеклах в течение 24 ч с добавлением различных концентраций рР. После отмывки от рР клетки помещали в полную культуральную среду еще на 48 ч. Препараты фиксировали в 4%-м растворе формалина в PBS, пермеабилизировали в растворе 0,125 % Тритона Х-100 в течение 3 мин, затем 2 раза отмывали PBS (pH 7,4) и инкубировали с блокирующим буфером (2 мг/мл BSA в PBS) в течение 30 мин. Все процедуры проводили при комнатной температуре. Не отмывая, препараты инкубировали в течение 2 ч с разведенными в блокирующем буфере поликлональными антителами кролика к филаггрину и лорикрину (Abcam, Великобритания; ab24584 и ab85679 соответственно), затем отмывали PBS (2 раза по 10 мин), инкубировали с флуоресцентно мечеными антителами к иммуноглобулинам кролика (Abcam, ab15085; ab150087) и вновь отмывали PBS 2 раза по 10 мин. Ядра окрашивали DAPI в антифей-
де ProlongGold (Invitrogen). Последующий анализ готовых препаратов проводили при помощи конфокальной микроскопии на лазерном сканирующем микроскопе LSM710 с использованием программного обеспечения ZEN 2011 (Carl Zeiss, Германия).
Достоверность различия средних величин исследуемых параметров определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Фишера, наличие и степень корреляционной зависимости определяли с помощью критерия Пирсона.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты МТТ-теста (рис. 1, А) свидетельствуют о том, что, начиная с концентрации рР 2 г/л, имело место дозозависимое уменьшение общего количества жизнеспособных клеток, что можно объяснить наличием цитотоксических (индукция апоптоза или некроза) или цитостати-ческих (торможение пролиферации) свойств рР.
Для проверки наличия цитотоксических свойств рР было исследовано количество клеток с признаками различных типов гибели (см. рис. 1, Б). Культивирование кератиноцитов с рР в концентрациях, приводящих к значительному сокращению количества жизнеспособных клеток в культуре, вызывало апоптоз лишь у незначительного количества клеток (8 г/л) либо вовсе не обладало апоптогенным эффектом (4 г/л). Также не наблюдалось усиления некротической гибели кератиноцитов, подвергнутых воздействию рР.
Было проведено исследование темпов пролиферации клеток под действием указанных концентраций рР при помощи трейсерного флуоресцентного красителя CFSE, по степени разведения
которого судили о количестве совершенных за заданное время актов деления (рис. 2, А). Обнаружено, что в экспериментальных группах величина пролиферирующего пула клеток по сравнению с контролем не изменялась, но воздействие рР в концентрациях 4 и 8 г/л приводило к снижению количества клеток, совершивших более одного деления. Этот эффект наблюдался через 24 и 48 ч после начала инкубирования с рР.
При исследовании клеточного цикла клеток НаСаТ было выявлено, что через 24 ч после воздействия рР в концентрациях 4 и 8 г/л количество клеток, находящихся в фазах G0/G1, существенно увеличивалось относительно контроля и, соответственно, снижалось количество кератиноци-тов, находящихся в фазах S и МЮ2. Однако через 48 ч кератиноциты, обработанные рР, восстанавливали нормальный характер распределения по фазам клеточного цикла (см. рис. 2, Б).
При исследовании признаков индукции терминальной дифференцировки наблюдалось заметное усиление экспрессии основных маркеров дифференцировки кератиноцитов - филаггрина и лорикрина, и их накопление в цитоплазме (рис. 3) через 72 ч после начала инкубации клеток с рР в концентрации 8 г/л.
ОБСУЖДЕНИЕ
Изменения клеток линии НаСаТ под влиянием высокоосмотических рР в целом напоминают эффекты, описанные для гиперосмотического стресса. К ним относят арест клеточного цикла, торможение транскрипции и трансляции, деполяризацию митохондриальных мембран с последующей гибелью клеток путем апоптоза или некроза [8].
Б
100-
о с
о
50-
24 ч
Контроль рР 4 г/л
рР 2 г/л рР 8 г/л
о и
f-н rt
к ü Ч <u О IT
i
10 8 6" 4
2
24 ч
Т Г
Ранний Поздний апоптоз апоптоз или некроз
48 ч
läJ
Ранний апоптоз
Поздний апоптоз или некроз
Контроль Ц рР 2 г/л
рР 4 г/л □ рР 8 г/л
0
0
0
Рис. 1. А - жизнеспособность клеток линии НаСаТ через 48 ч после гиперосмотического воздействия растворами соли «Рапан». Здесь и далее * - отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо при р < 0,05. Б - уровень апоптотической и некротической гибели клеток линии НаСаТ через 24 и 48 ч после гиперосмотического воздействия
£ ^ В и
° о Я Н
о
а
№ =
СП
0 К
1
И сл
100-1
50-
0
24 ч
1 г
Пролиферирую- Более Более
щий пул 1 деления 2 делений
100-1
50-
0
X
48 ч
X
Пролиферирую-щий пул
Более 1 деления
Более 2 делений
100-
0 N°
8 о4 2 «
1 8
в а
Ю 5
о
50-
* * гЬ
24 ч
|Ь
* *
т1*_
Б
т * *
\ I г
ООЛ31-фазы в-фаза 02/М-фазы
ЮОп
50-
48 ч
ш
а
(ШЛ-фазы 8-фаза 02/М-фазы
Контроль | | рР 2 г/л
| рР 4 г/л И рР 8 г/л
Рис. 2. А - пролиферативная активность кератиноцитов линии НаСаТ через 24 и 48 ч после гиперосмотического воздействия растворами соли «Рапан»; Б - распределение кератиноцитов линии НаСаТ по фазам клеточного цикла спустя 24 и 48 ч после инкубации с растворами соли «Рапан»
В то же время для гиперосмотического воздействия характерен запуск внутриклеточных механизмов адаптации, направленных на восстановление внутриклеточного ионного гомео-стаза (в частности, усиление экспрессии белков теплового шока). Благодаря этим механизмам при низкой интенсивности гиперосмолярного воздействия возможно восстановление нормальной клеточной структуры и функций, в том числе клеточного цикла [8].
рР в концентрациях 4 и 8 г/л вызывает торможение пролиферации кератиноцитов линии НаСаТ, продолжающееся в течение 48 ч после окончания воздействия. При этом в первые 24 ч возрастает количество клеток, находящихся в фазе G0/G1, что, однако, не приводит в дальнейшем к их смерти. Кроме того, показано увеличение экспрессии лорикрина и филаггрина в цитоплазме клеток через 72 ч после воздействия рР,
что свидетельствует о начале дифференцировки этих клеток. Подобным образом кератиноциты реагируют на различные высокоосмолярные соединения [11], что свидетельствует в пользу гиперосмотического стресса как одного из механизмов воздействия рапы на кератиноциты.
Вероятно, торможение пролиферации обусловлено активацией стресс-активируемой про-теинкиназы р38 МАРК, отвечающей за регуляцию клеточного цикла, в частности, в условиях гиперосмотического стресса [9]. В свою очередь, киназа р38 увеличивает экспрессию белков теплового шока, в том числе HSP27, который участвует в сборке кератинов. Уровень активации HSP27 положительно коррелирует с темпом дифферен-цировки кератиноцитов [10]. К отсроченным эффектам активации р38 относится усиление пролиферации клеток, опосредованное повышением уровня экспрессии рецептора к эпидермальному
Рис. 3. Внутриклеточное распределение филлагрина (А) и лорикрина (Б) кератиноцитами линии HaCaT после воздействия раствором соли «Рапан» (рапа) в концентрации 8 г/л. Фотографии получены на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM710 (Carl Zeiss). Увеличение х 400
фактору роста [9]. В то же время в настоящем исследовании не наблюдалось повышения темпов клеточного деления, а лишь отмечалось восстановление нормальной динамики клеточного цикла.
Вероятно, влияние рР на кератиноциты не может быть объяснено только развитием гиперосмотического стресса. В связи со сложным составом использованной рапы не исключены и другие возможные механизмы ее влияния на пролиферацию
и дифференцировку - в частности, развитие окислительного стресса либо прямое вмешательство компонентов соли в передачу сигналов по внутриклеточным путям, что требует дальнейшего изучения. Более полное представление о механизмах действия рапы на пролиферирующие кератиноци-ты позволит создать эффективные схемы лечения заболеваний кожи, ассоциированных с состояниями воспаления и гиперпролиферации.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 8788 и ГК № 16.552.11.7057)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кунгуров Н.В., Сазонов С.В., КоханМ.М. Особенности пролиферативных процессов в эпидермисе больных с различными типами атопического дерматита // Вестн. дерматол. венерол. 2000. (4). 24-27.
2. Лузгина Н.Г., Шкурупий В.А., Потапова О.В. и др. Особенности морфологических проявлений хронического воспалительного процесса в коже больных атопическим дерматитом при воздействии высокоминерализованными водами // Сибирский консилиум. 2007. (4). 114-115.
3. Лузгина Н.Г., Шкурупий В.А., Потапова О.В. Клинико-морфологические проявления атопического дерматита, ассоциированного с синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани // Рос. иммунол. журн. 2008. 2. (11). 218.
4. Потапова О.В., Лузгина Н.Г., Шкурупий В.А. Патоморфологическая характеристика лихеноид-ных поражений кожи больных атопическим дерматитом при лечении природными высокоминерали-
зованными водами в сочетании с ультрафиолетовым излучением // Дерматология. 2006. (2). 107-111.
5. Boukamp P., Tilgen W., Dzarlieva R.T. et al. Phenotypic and genotypic characteristics of a cell line from a squamous cell carcinoma of human skin // J. Natl. Cancer Inst. 1982. 68. (3). 415-427.
6. Boukamp P., Rupniak H.T., Fusenig N.E. Environmental modulation of the expression of differentiation and malignancy in six human squamous cell carcinoma cell lines // Cancer Res. 1985. 45. 55825592.
7. Boukamp P., PetrussevskaR.T., Breitkreutz D. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line // J. Cell Biol. 1988. 106. (3). S761-771.
8. BurgM.B., Ferraris J.D., DmitrievaN.I. Cellular response to hyperosmotic stresses // Physiol. Rev. 2007. 87. 1441-1474.
9. Garmyn M., Mammone T., Pupe A. et al. Human keratinocytes respond to osmotic stress by p38 map kinase regulated induction of HSP70 and HSP27 // J. Invest. Dermatol. 2001. 117. (5). 1290-1295.
10. Jonak C., Klosner G., Trautinger F. Heat shock proteins in the skin // Int. J. Cosmetic Sci. 2006. 28. 233-241.
11. Mammone T., IngrassiaM., Goyarts E. Osmotic stress induces terminal differentiation in cultured normal human epidermal keratinocytes // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2008. 44. (5-6). 135-139.
EFFECTS OF NATURALLY OCCURING HIGHLY MINERALIZED WATER ON HUMAN KERATINOCYTES IN VITRO
Natal'ya Sergeevna ZAYTSEVA, Anton Vladimirovich CHECHUSHKOV, Petr Mikhaylovich KOZHIN, Anna Evgen'evna LEMZA, Viktor Olegovich TKACHEV, Nalaliya Gennad'evna LUZGINA
Center of Clinical and Experimental Medicine of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
Naturally occurring highly mineralized water is widely used in skin diseases treatment. At the same time, mechanisms underlying its effects on human skin cells are poorly understood. In the present study the brine from Maloe Ostrovnoe Lake in non cytotoxic concentrations had been shown to induce cell cycle arrest in G0/G1 phase followed by attenuation of cell proliferation and increased expression of differentiation markers: loricrin and filaggrin. This observation shows onset of keratinocyte terminal differentiation, and could be used for modulation of inflammatory processes in epidermis associated with dysregulation and/or desynchronisation of cellular proliferation and differentiation.
Key words: mineral water, hyperosmotic stress, keratinocytes, proliferation, differentiation.
Zaytseva N.S. - researcher of laboratory of cell physiology and pathology molecular mechanisms, e-mail: nszaitseva@gmail.com
Chechushkov A.V. - researcher of laboratory of cell physiology and pathology molecular mechanisms, e-mail:achechushkov@gmail.com
Kozhin P.M. - researcher of laboratory of cell physiology and pathology molecular mechanisms, e-mail: kozhinpm@gmail.com
Lemza A.E. - junior researcher of laboratory of cell physiology and pathology molecular mechanisms, e-mail: lemza.ae@gmail.com
Tkachev V.O. - candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of cell physiology and pathology molecular mechanisms, e-mail: tkachev_victor@mail.ru
Luzgina N.G. - candidate of medical sciences, leading researcher of laboratory of cell physiology and pathology molecular mechanisms, e-mail: ngluzgina@gmail.com
