CC BY
58
Биофизика и медицинская физика
УДК 615.012.8
Н.В. Скворцов, В.О. Самойлов, И.В. Ларионов, А.Г. Болдырев
ЭФФЕКТИВНЫЙ СОРБЕНТ ДЛЯ ЭЛИМИНАЦИИ ЭНДОТОКСИНА В БИОПРЕПАРАТАХ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЕНЕЗА И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
N.V. Skvortsov1, V.O. Samoilov1, I.V. Larionov2, A.G. Boldyrev2
1 St. Petersburg State Polytechnical University, 29 Politekhnicheskaya St., St. Petersburg, 195251, Russia. 2State Scientific-Research Institute of Pure Biochemicals, 7 Pudozhskaya St. St. Petersburg, 197110, Russia.
AN EFFECTIVE SORBENT FOR ELIMINATION ENDOTOXIN IN BIOLOGICAL PRODUCTS OF GENETICALLY ENGINEERED GENESIS
AND BIOLOGICAL LIQUIDS
Разработан сорбент, предназначенный для элиминации эндотоксина в биологических жидкостях и биопрепаратах, полученных методами генной инженерии. В качестве основы сорбента используется высокопроницаемая биосовместимая матрица на основе регенерированной целлюлозы. Оценена эффективность сорбента при сорбции эндотоксина из модельных сред и растворов белка.
СОРБЕНТ, ЭЛИМИНАЦИЯ, ЭНДОТОКСИН, БИОПРЕПАРАТЫ, ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, РАСТВОР БЕЛКА, БИОСОВМЕСТИМАЯ МАТРИЦА.
An effective sorbent designed to eliminate endotoxin from biological fluids and products has been developed. A highly permeable biocompatible matrix based on regenerated cellulose was used as a base of the sorbent. The efficiency of the sorbent for endotoxin from model solutions and protein solutions were estimated.
SORBENT, ELIMINATION, ENDOTOXIN, BIOLOGICAL PRODUCTS, GENETIC ENGINEERING, PROTEIN SOLUTION, BIOCOMPATIBLE MATRIX.
Разработка сорбционных материалов и их разнообразное применение является одним из основных направлений биотехнологии и в смежных науках. В биохимии это выделение и очистка веществ, в области экологии — мониторинг окружающей среды, в медицине и медицинской промышленности это финишная очистка биопрепаратов, приемы эфферентной терапии [1]. Последнее направление следует рассматривать как особую область применения сорбентов, поскольку они в этом случае, в рамках процессов энтеро-, гемо- и ликво-
росорбции, выступают непосредственно в качестве терапевтического средства.
В связи с очень высокими требованиями к чистоте биотехнологических и особенно фармацевтических продуктов, сорб-ционные технологии (хроматографические методы) по существу являются единственным подходом, обеспечивающим достаточный уровень индивидуальности и чистоты препаратов.
Целью данной статьи является описание экспериментов, ориентированных на элиминацию липополисахарида (ЛПС) в био-
^ Научно-технические ведомости СПбГПУ. Физико-математические науки № 3(177) 2013
препаратах и биологических жидкостях, с использованием сорбента Сфероцелл С80. Этот сорбент обладает комплексом свойств, включающим высокую селективность, обратимость и большую емкость сорбции по ЛПС, а также механическую стабильность и способность к многократному использованию.
Основу сорбента составляет универсальная матрица Сфероцелл, разработанная в лаборатории сорбентов и носителей Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов. Матрица характеризуется высокой проницаемостью, достаточной гидродинамической жесткостью, низким уровнем неспецифических взаимодействий. На ее базе создан ряд высокоемких сорбентов ионообменного, аффинного и гидрофобного типов, разработаны эффективные хромато-графические процессы выделения биологически активных веществ [2].
Одной из центральных задач получения высокочистых биопрепаратов генно-инженерного происхождения является элиминация в них высокотоксичного липо-полисахарида (эндотоксина). Фармакопеи Всемирной организации здравоохранения рекомендуют лимитировать содержание эндотоксина в лекарственных формах внутривенного назначения пределом 0,5 ppm (млн-1). Превышение этого предела в препарате может приводить к развитию септического шока у пациентов [3, 4].
В настоящее время этот процесс элиминации ЛПС реализуется, как правило, с помощью уникального сорбента — По-лимиксина Б сефарозы. В этом сорбенте в качестве матрицы носителя (основы сорбента) выступает гранулированный вариант высокопроницаемой сшитой сефарозы-6б, в качестве аффинанта — Полимиксин Б, иммобилизованный на матрицу, — натив-ный вариант бактериального антибиотика. Этот сорбент представляет собой сложный молекулярный фрагмент со специфическим гидрофобно-гидрофильным балансом. По-лимиксин Б является эффективным аф-финантом для связывания ЛПС, при этом адсорбционную активность Полимиксина естественно связать с наличием в нем ги-
дрофобной компоненты. Сфероцелл 80 в качестве аффинанта также включает гидрофобный фрагмент. Именно благодаря ему сорбент демонстрирует высокую эффективность связывания ЛПС, обеспечивает высокие емкостные показатели. Так например, он позволяет получать моноклональные антитела, содержащие менее 0,625 EU/мл ЛПС, из препарата с исходной концентрацией ЛПС от 20 до 100 Eu.
Однако используемый в прототипе аф-финант — Полимиксин Б содержит в своей структуре, наряду с высокоспецифичным гидрофобным молекулярным фрагментом, массивный ионогенный фрагмент, включающий большое количество легко ионизируемых групп NH2, а также карболовых фрагментов, что приводит к значительной фоновой сорбции белков по ионообменному механизму. В результате при очистке бычьей каталазы на сорбенте теряется до 25 % целевого белка, а при очистке БСА — до 20 % [5].
Наряду с указанным недостатком этого сорбента, в качестве дополнительного следует указать на относительно низкий уровень проницаемости матрицы-носителя этого сорбента — сефарозы-6б, что, с учетом склонности ЛПС к образованию сложных ассоциатов с большими надмолекулярными размерами [5], затрудняет сорбцию ЛПС в объем зерна сорбента и, следовательно, существенно ограничивает его емкость.
Сорбент Сфероцелл С80 функционально построен аналогично описаному прототипу (Полимиксин Б сефароза). На нейтральную высокопроницаемую гидрофильную матрицу иммобилизованы аффи-нанты, специфически связывающие ЛПС. При этом используемый лиганд, как будет показано ниже, обладает весьма высоким сродством только к ЛПС.
Оригинальная матрица Сфероцелл, как показал опыт, характеризуется поровой структурой, также эффективной в отношении решаемой задачи.
Особенность высокопроницаемой по-ровой структуры носителя Сфероцелл (см. рисунок) состоит в том, что распределение пор по размерам бимодально. Существуют транспортные поры с характерным размером
Микрофотографии внешней (а) и внутренней (б) структуры одной гранулы сорбента Сфероцелл (получены методом сканирующей электронной микроскопии)
0,1 — 3,0 мкм (соответствующий удельный объем порового пространства для пор этого типа составляет 0,8 — 0,9), а также «хромато-графические» поры с размерами 50 — 300 А (удельный объем порового пространства для пор этого типа составляет 0,35 — 0,40), измеренные методами ртутной порометрии и эксклюзионной хроматографии соответственно. Наличие большого количества транспортных пор обеспечивает эффективный массоперенос в зерне сорбента для крупномолекулярных объектов, а гидрофобные аффинанты конкурентным образом разрушают ассоциаты ЛПС.
Такая структура носителя позволяет эффективно сорбировать молекулярные компоненты в объем зерна сорбента, в широком интервале размеров — от индивидуальных молекул до крупномасштабных ассоциатов, без потери емкости сорбента, что существенно при работе с ассоциирующимся ЛПС.
Гидрофобные радикалы, выбранные в качестве аффинантов, которые по существу представляют собой эквивалент алифатического фрагмента молекулы ЛПС, обеспечивают их эффективное высокоспецифическое связывание. При этом неспецифическая сорбция, обусловленная наличием ионогенной компоненты в структуре аффинанта прототипа, в этом случае, естественно, отсутствует.
В результате указанных особенностей отчистка препаратов на данном сорбенте, в отличие от отчистки на прототипе, практически не сопровождается потерей целевого белка. При хроматографии на Сфероцелле
С80 потери базового белка не превосходят 5 %. Соответствующие потери Полимикси-на Б сефарозы составляют более 25 % [5].
Таким образом, сорбент Сфероцелл С80 по основным целевым эксплуатационным параметрам и характеристикам селективности существенно превосходит свой прототип — Полимиксин Б сефарозу.
В качестве адекватной характеристики сорбента как средства выделения и отчистки целевого компонента удобно использовать коэффициент распределения Кр для данного конкретного компонента. Величину Кр получают расчетным путем на основании данных о концентрации целевого компонента (в данном случае ЛПС) до и после завершения процесса сорбции:
К = C ,/ С., ,
р ext' int 7
где Cxt,, C.nt — равновесные концентрации данного компонента во внешнем растворе и в объеме сорбента соответственно.
Данные о концентрации ЛПС (начальной и конечной) получают с использованием хромогенного LAL-теста. Указанный тест представляет собой определение эндотоксинов; LAL — Limulus Amebocyte Lisate (лизат амебоцитов limulus) [6].
Эксперименты по сорбции проводились в статических условиях путем приготовления растворов ЛПС с определенной кон-центрацей (в качестве исходного варианта) и/или путем прямого определения концентрации раствора ЛПС до и после сорбции с помощью хромогенного LAL-теста. Второй вариант состоит в разведении экспериментальных препаратов до уровня компетенции
4
Научно-технические ведомости СПбГПУ. Физико-математические науки № 3(177) 2013
Коэффициенты распределения K липополисахарида (ЛПС) для сорбента Сфероцелл C80 в альбумине
Условие получения Кр для различных концентраций ЛПС
10 - 100 нг/мл 100 - 1000 нг/мл 1000 - 10 000 нг/мл
Раствор сорбента в альбумине предварительно выдержан 230 70 50
То же без предварительной выдержки 290 230 160
Примечание: концентрация водного раствора альбумина — 10 %
LAL-теста). Определенные таким образом коэффициенты распределения для Сферо-целла С80 представлены в таблице. По статистическим оценкам в рамках нескольких серий измерений погрешность приводимых величин укладывается в интервал ± 5% от номинала.
Сравнение данных таблицы с литературными данными показывает, что в то время как коэффициент распределения, выражающий предельную степень отчистки препарата в системе «сорбент — раствор белка», составляет для Полимиксина Б сефарозы значение Кр = 32 — 160 [4], для сорбента Сфероцелл С80 этот коэффициент достигает значения 290 (см. таблицу). Результаты были получены на основе прямого тестирования проб после сорбции.
Для оценки селективности и эффективности сорбции ЛПС в условиях гемосорб-ции (при наличии в системе сопутствующих и конкурирующих белков) проводилась серия сравнительных экспериментов в 10%-м водном растворе альбумина; и эти данные представлены в таблице (также в статических условиях).
При этом емкость сорбента Сфероцелл С80 по ЛПС в условиях конкуренции с альбумином составляет 37000 нг/мл. Это существенно превышает соответствующую величину, характерную для сорбента прототипа.
Представления о характере конкуренции ЛПС и альбумина за адсорбционные
центры можно получить, сопоставив величины, приведенные в таблице.
Для оценки эффективности кратного использования сорбента Сфероцелл С80 был выполнен эксперимент по его регенерации путем отмывки этанолом в аппарате Сокслета. После восьмичасовой отмывки сорбента и стандартной процедуры — тренировки (уравновешивание сорбента в 0,1N растворе кислоты и 0,1N растворе щелочи с заключительной отмывкой водой до нейтральной реакции) показатели емкости изменились незначительно.
Таким образом, данным исследованием показано, что предлагаемая разработка — ЛПС-связывающий сорбент Сфероцелл С80 убедительно превосходит классический прототип по всем важнейшим эксплуатационным и физико-химическим параметрам. К ним относятся максимальная емкость, селективность сорбции, коэффициент распределения (определяет максимальную остаточную концентрацию ЛПС в препарате). В качестве его дополнительных преимуществ следует указать на возможность его многократного применения (с использованием промежуточной стерилизации). В этой же связи важно отметить отсутствие необходимости стерильной сборки колонок в исходном варианте, что обусловливает более низкую цену соответствующих устройств (разница — на порядок ).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Черкасов, А.Н. Мембраны и сорбенты в рекции [Текст] / А.Г. Болдырев, А.А. Соколов, биотехнологии [Текст] / А.Н. Черкасов, В.А. Н.М. Федорова [и др.] // «Фундаментальные и Пасечник. — Л.:Химия, 1991.—239 с. прикладные проблемы биотехнологии и меди-
2. Болдырев, А.Г. Разработка аффинных цины». Матер. Междунар. конф. — СПб., 2000. сорбентов для экстракорпоральной гемокор- — С. 78—79.
4
Биофизика и медицинская физика
3. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов [Текст]: сорок шестой доклад; пер. с англ. // Всемирная организация здравоохранения (Женева), Комитет экспертов. - Женева: ВОЗ, 1998. - 120 с.
4. Trachsel, S. Association between inflammatory mediators and response to inhaled nitric oxide in a model of endotoxin-induced lung injury [Электронный ресурс] / S. Trachsel, G. Deby-Dupont, E. Maurenbrecher, [et al.] // Critical Care. — 2008. —Vol. 12. —№ 5. — Режим доступа: ccforum.com/
content/12/5/R131
5. Гусаров, Д.А. Способы очистки биофармацевтических белков от эндотоксинов клеточной стенки [Текст] / Д.А. Гусаров// Биофармацевтический журнал. — 2009. —Т. 1. —№ 3. -С. 10-17.
6. Associates of Cape Cod, Inc. Описание фирменного LAL теста и инструкция по работе с ним [Электронный ресурс]. Режим доступа: www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/Chro-moLAL.pdf
REFERENCES
1. Cherkasov A.N., Pasechnik V.A. Membrany i sorbenty v biotekhnologii. Leningrad, Khimiia, 1991, 239 p. (rus)
2. Boldyrev A.G., Sokolov A.A., Fedorova
N.M. et al. Razrabotka affinnykh sorbentov dlia ekstrakorporal'noigemokorrektsii.«Fundamental'nye i prikladnye problemy biotekhnologii i meditsiny». Mater. Mezhdunar. konf, St. Petersburg, 2000, pp. 78-79. (rus)
3. WHO Expert Committee on Biological Standardization: The 46h report. WHO, Geneva, 1998, 120 p.
4. Trachsel S., Deby-Dupont G., Maurenbrecher
E. et al. Association between inflammatory mediators and response to inhaled nitric oxide in a model of endotoxin-induced lung injury. Critical Care, 2008, Vol. 12, № 5. Available at: ccforum.com/ content/12/5/R131.
5. Gusarov D.A. Sposoby ochistki biofarmat-sevticheskikh belkov ot endotoksinov kletochnoi stenki. Biofarmatsevticheskii zhurnal, 2009, Vol. 1, № 3, pp. 10-17. (rus)
6. Associates of Cape Cod, Inc. Chromo-LAL test Product Info Sheet. Available at: http://www. acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/Chromo-LAL.pdf
СКВОРЦОВ Никита Владиславович — аспирант кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 [email protected]
САМОЙЛОВ Владимир Олегович — член-кор. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения медицинской физики и биоинженерии Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 [email protected]
ЛАРИОНОВ Иван Владимирович — аспирант кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 [email protected]
БОЛДЫРЕВ Александр Георгиевич — кандидат технических наук, научный консультант Государственного научно-исследовательского института особочистых биопрепаратов. 197110, г. Санкт-Петербург, Пудожская ул., 7 [email protected]
© Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, 2013
