Научная статья на тему 'Эффективность создания делеции CCR5delta32 методом CRISPR-Cas9 в эмбрионах человека'

Эффективность создания делеции CCR5delta32 методом CRISPR-Cas9 в эмбрионах человека Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
503
106
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
CRISPR-CAS9 / РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА / ЭМБРИОН ЧЕЛОВЕКА / CCR5 / CCR5DELTA32 / УСТОЙЧИВОСТЬ К ВИЧ / GENOME EDITING / HUMAN EMBRYO / HIV RESISTANCE

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Кодылева Т.А., Кириллова А.О., Тыщик Е.А., Макаров В.В., Хромов А.В.

Изменение гена CCR5 путем редактирования генома CD4+-T-клеток является одним из способов предотвращения распространения ВИЧ-1-инфекции. Однако похожая стратегия защиты от ВИЧ может быть использована и для защиты плода ВИЧ-инфицированных женщин со слабым ответом на антиретровирусную терапию. Создание «естественного» аллеля CCR5delta32 на стадии зиготы может защитить плод от ВИЧ-инфекции во время внутриутробного развития и родов. Целью данного исследования была оптимизация системы CRISPR-Cas9 под создание гомозиготной 32-нуклеотидной делеции (аналогичной природному варианту CCR5delta32) в S-фазе зиготы человека. Для редактирования генома были использованы зиготы с аномальным числом пронуклеусов (более двух), непригодные для ЭКО. 16 аномальных зигот от доноров с WT CCR5 были инъецированы разработанной системой CRISPR-Cas9 в S-фазе. После инъекции зиготы помещали в культуральную среду Blastocyst (COOK) и культивировали в течение 5 дней в CO-инкубаторе до стадии бластоцисты (приблизительно 250 клеток). Для анализа эффективности редактирования генома 8 успешно развивавшихся эмбрионов были генотипированы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Из 16 зигот, инъецированных системой CRISPR-Cas9, лишь 8 достигли стадии бластоцисты. ПЦР-генотипирование показало отсутствие исходного варианта WT CCR5 в 5 из 8 бластоцист (100% гомозиготы по CCR5delta32). Два эмбриона продемонстрировали около 3% и один около 20% мозаицизма по WT CCR5. Таким образом, эффективность разработанной CRISPR-Cas9 системы для создания аллеля CCR5delta32 в эмбрионах человека довольно высока: более половины эмбрионов оказываются полностью модифицированными.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Кодылева Т.А., Кириллова А.О., Тыщик Е.А., Макаров В.В., Хромов А.В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The efficacy of CRISPR-Cas9-mediated induction of the CCR5delta32 mutation in the human embryo

The editing of the CCR5 gene in the CD4+ T cell genome is an effective way of preventing HIV-1 proliferation. Very similar strategies can be used to protect the fetus of an HIV-infected female showing a weak response to antiretroviral therapy. Inducing the “natural” CCR5delta32 mutation in a zygote may guard the fetus against HIV infection both in utero and at birth. In this study, we optimize the CRISPR-Cas9 system to induce a homozygous 32-nt deletion similar to the naturally occurring CCR5delta32 allele in the human zygote at the S-phase. Edits were done in the abnormal tripronuclear zygotes unsuitable for IVF. Sixteen tripronuclear zygotes in the S-phase obtained from WT CCR5 donors were injected with an original CRISPR-Cas9 system designed by the authors. Upon injection, the zygotes were transferred into the Blastocyst (COOK) embryo culture medium and cultured for 5 days in a CO-incubator until blastocysts were formed (approximately 250 cells). Eight zygotes that successfully developed into blastocysts were PCR-genotyped to analyze the efficacy of genome editing. Of 16 zygotes injected with CRISPR-Cas9, only 8 reached the blastocyst stage. PCR genotyping revealed the absence of the initial WT CCR5 variant in 5 of 8 blastocysts (100% CCR5delta32 homozygous). Two had about 3% and one about 20% of WT CCR5 mosaicism. This leads us to conclude that the efficacy of the proposed CRISPR-Cas9 system for the induction of the CCR5delta32 mutation in human embryos is very high producing more than 50% of completely modified embryos.

Текст научной работы на тему «Эффективность создания делеции CCR5delta32 методом CRISPR-Cas9 в эмбрионах человека»

ЭФФЕКТИВНОСТЬ СОЗДАНИЯ ДЕЛЕЦИИ CCR5DELTA32 МЕТОДОМ CRISPR-CAS9 В ЭМБРИОНАХ ЧЕЛОВЕКА

Т. А. Кодылева1, А. О. Кириллова1, Е. А. Тыщик1, В. В. Макаров2, А. В. Хромов2, В. А. Гущин2, А. Н. Абубакиров1, Д. В. Ребриков1,3 Г. Т. Сухих1

1 Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова, Москва

2 Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва

3 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва

Изменение гена CCR5 путем редактирования генома С04+-Т-клеток является одним из способов предотвращения распространения ВИЧ-1-инфекции. Однако похожая стратегия защиты от ВИЧ может быть использована и для защиты плода ВИЧ-инфицированных женщин со слабым ответом на антиретровирусную терапию. Создание «естественного» аллеля CCR5delta32 на стадии зиготы может защитить плод от ВИЧ-инфекции во время внутриутробного развития и родов. Целью данного исследования была оптимизация системы CRISPR-Cas9 под создание гомозиготной 32-нуклеотидной делеции (аналогичной природному варианту CCR5delta32) в S-фазе зиготы человека. Для редактирования генома были использованы зиготы с аномальным числом пронуклеусов (более двух), непригодные для ЭКО. 16 аномальных зигот от доноров с WT CCR5 были инъецированы разработанной системой CRISPR-Cas9 в S-фазе. После инъекции зиготы помещали в культуральную среду Blastocyst (COOK) и культивировали в течение 5 дней в COg-инкубаторе до стадии бластоцисты (приблизительно 250 клеток). Для анализа эффективности редактирования генома 8 успешно развивавшихся эмбрионов были генотипированы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Из 16 зигот, инъецированных системой CRISPR-Cas9, лишь 8 достигли стадии бластоцисты. ПЦР-генотипирование показало отсутствие исходного варианта WT CCR5 в 5 из 8 бластоцист (100% гомозиготы по CCR5delta32). Два эмбриона продемонстрировали около 3% и один — около 20% мозаицизма по WT CCR5. Таким образом, эффективность разработанной CRISPR-Cas9 системы для создания аллеля CCR5delta32 в эмбрионах человека довольно высока: более половины эмбрионов оказываются полностью модифицированными.

Ключевые слова: CRISPR-Cas9, редактирование генома, эмбрион человека, CCR5, CCR5delta32, устойчивость к ВИЧ

[23 Для корреспонденции: Денис Владимирович Ребриков

ул. Островитянова, д. 1, г. Москва, 117997; drebrikov@gmail.com

Статья получена: 26.09.2018 Статья принята к печати: 09.10.2018

DOI: 10.24075/vrgmu.2018.052

THE EFFICACY OF CRISPR-CAS9-MEDIATED INDUCTION OF THE CCR5DELTA32 MUTATION IN THE HUMAN EMBRYO

Kodyleva TA1, Kirillova AO1, Tyschik EA1, Makarov VV2, Khromov AV2, Gushchin VA2, Abubakirov AN1, Rebrikov DV1,3 ^ Sukhikh GT1

1 Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow

2 Lomonosov Moscow State University, Moscow

3 Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow

The editing of the CCR5 gene in the CD4+ T cell genome is an effective way of preventing HIV-1 proliferation. Very similar strategies can be used to protect the fetus of an HIV-infected female showing a weak response to antiretroviral therapy. Inducing the "natural" CCR5delta32 mutation in a zygote may guard the fetus against HIV infection both in utero and at birth. In this study, we optimize the CRISPR-Cas9 system to induce a homozygous 32-nt deletion similar to the naturally occurring CCR5delta32 allele in the human zygote at the S-phase. Edits were done in the abnormal tripronuclear zygotes unsuitable for IVF. Sixteen tripronuclear zygotes in the S-phase obtained from WT CCR5 donors were injected with an original CRISPR-Cas9 system designed by the authors. Upon injection, the zygotes were transferred into the Blastocyst (COOK) embryo culture medium and cultured for 5 days in a CO2 incubator until blastocysts were formed (approximately 250 cells). Eight zygotes that successfully developed into blastocysts were PCR-genotyped to analyze the efficacy of genome editing. Of 16 zygotes injected with CRISPR-Cas9, only 8 reached the blastocyst stage. PCR genotyping revealed the absence of the initial WT CCR5 variant in 5 of 8 blastocysts (100% CCR5delta32 homozygous). Two had about 3% and one about 20% of WT CCR5 mosaicism. This leads us to conclude that the efficacy of the proposed CRISPR-Cas9 system for the induction of the CCR5delta32 mutation in human embryos is very high producing more than 50% of completely modified embryos.

Keywords: CRISPR-Cas9, genome editing, human embryo, CCR5, CCR5delta32, HIV resistance

[23 Correspondence should be addressed: Denis V. Rebrikov Ostrovityanova 1, Moscow, 117997; drebrikov@gmail.com

Received: 26.09.2018 Accepted: 09.10.2018

DOI: 10.24075/brsmu.2018.052

Быстрое развитие СИБРЯ-технологий в последние годы значительно расширило сферу их применения и способствовало продвижению в клиническую практику. Редактирование генома СЭ4+-Т-клеток путем нокаута или

модификации гена хемокинового рецептора 5 (ССЯ5) дало обнадеживающие результаты в лечении ВИЧ-1-инфекции [1-5].

Однако кроме изменения гена ССЯ5 в Т-клетках (с целью блокирования развития СПИДа у ВИЧ-инфицированных

пациентов), создание ССЯ5с1е11а32-аллеля может быть использовано как элемент технологии оплодотворения in vitro (IVF) для защиты плода ВИЧ-инфицированных женщин со слабым ответом на антиретровирусную терапию [6, 7].

Введение системы CRISPR-Cas9 на стадии зиготы позволяет модифицировать геном практически во всех клетках организма и это уже продемонстрировано для нескольких наследственных заболеваний [8-12]. Важно отметить, что измененный геном будет передаваться и последующим поколениям.

Модификация, идентичная природному аллелю CCR5Celta32, потенциально защитит плод от ВИЧ-инфекции во время внутриутробного развития, а также во время родов. Дополнительным положительным эффектом может стать пожизненная устойчивость человека к ВИЧ-инфекции.

В этом исследовании мы оптимизировали систему CRISPR-Cas9 с целью создания гомозиготной 32-нуклеотидной делеции (аналогичной природному аллелю CCR5Celta32) в S-фазе зиготы человека. Для редактирования генома были использованы зиготы с аномальным числом пронуклеусов, непригодные для программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Одобрение этическим комитетом и согласие пациентов

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова (Москва) (протокол №2017/45). Все этапы исследования (методы)

проводились в полном соответствии с существующими международными принципами и правилами работы с эмбрионами. Письменное информированное согласие было получено от каждой семейной пары до момента передачи аномальных зигот для исследования. В исследование были включены семейные пары, в которых для обоих партнеров было показано отсутствие варианта CCR5Celta32.

Сбор зигот

Зиготы с аномальным числом пронуклеусов были получены от пациентов, проходящих процедуру ЭКО с сентября 2017 по апрель 2018 годов в НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова. От 11 пар была получена 21 аномальная зигота (16 были инъецированы CRISPR-Cas9 и 5 послужили контролем).

Дизайн, синтез и проверка активности гидовых РНК in vitro

Для дизайна гидовых РНК (гРНК) использовали последовательности гена CCR5 дикого типа (WT) и CCR5Celta32 из базы данных Национального центра биотехнологической информации (США). Для последующего целевого редактирования и введения желаемой делеции брали участок размером 200 пн, на котором выбирали сайты отжига гРНК с PAM-сайтом (рис. 1). Было подобрано девять гРНК с посадкой в местах, удобных для последующего гомологичного восстановления двухцепочечных разрывов (табл. 1).

- HCCR5 d32*>

О СшОО

9-WI CCR5d32jRNA2 (J3i 122-141{F> CCR5(J32_eRNA9 46-65(RC) CCR5d32_gWW3 lOl-lZOtF) CCR5d;j2_gRHA6

О 00

16-35(RC) CCR5d32_gRNAl | L28-147(RC) CCR5d32 gRNA7

95-114(F) CCR5d32_gRNA4

0 0

9 ! -116 и CCR5d3I_gfiNA5 132-151 (F.C) CC Rid 3 2 UNAS

Рис. 1. Расположение гРНК внутри гена CCR5 человека

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов для создания гРНК и ДНК-заплаток

CCR5_BamHI_F GGATCCTAGGTACCTGGCTGTCGTCCATG

CCR5_XbaI_R TCTAGAATGCAGCAGTGCGTCATCC

CCR5d32_gRNA1 TAATACGACTCACTATAGGAAGACCTTCTTTTTGAGATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA2 TAATACGACTCACWAGGTTTACCAGATCTCAAAAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA3 TAATACGACTCACTATAGGGTATGGAAAATGAGAGCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA4 TAATACGACTCACTATAGGGACATTAAAGATAGTCATCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA5 TAATACGACTCACTATAGGACATTAAAGATAGTCATCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA6 TAATACGACTCACTATAGGAAAGATAGTCATCTTGGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA7 TAATACGACTCACTATAGGTGACCATGACAAGCAGCGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA8 TAATACGACTCACTATAGGCAGATGACCATGACAAGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5d32_gRNA9 TAATACGACTCACTATAGGGGTCCTGCCGCTGCTTGTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

CCR5_big_leftpart_F CAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGC

CCR5_big_leftpart_R GGACCAGCCCCAAGATGACTATCTTTAATGTATGGAAAATGAGAGCTGCAGGTGTAA

CCR5_big_rightpart_R GCATAGCTTGGTCCAACCTGTTAG

CCR5_gib_rightpart_F TTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCC

CCR5_small_F GTGATCACTTGGGTGGTGGC

CCR5_small_R TTAGGATTCCCGAGTAGCAGATGAC

CCR5_small_hairpin_R GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGGATTCCCGAGTAGCAGATGAC

Матрицу для транскрипционного синтеза гРНК создавали путем попарного отжига праймеров (Евроген; Россия) с последующей достройкой Taq-полимеразой (Евроген; Россия) в ходе ПЦР. Затем проводили синтез гРНК с использованием Т7 РНК-полимеразы (Сибэнзим; Россия).

Активность полученных гРНК проверяли с помощью тестовой плазмиды, кодирующей последовательность CCR5 дикого типа. Расщепление ДНК in vitro комплексом гРНК и EnGen® Cas9 NLS (New England Biolabs; США) проводили в соответствии со стандартной процедурой, рекомендованной производителем фермента. В качестве наиболее эффективных были выбраны гРНК №1 и №5. Для последующих экспериментов in vivo смесь этих гРНК использовали в соотношении 1:1.

Наработка ДНК-заплатки

Для производства ДНК-заплатки использовали метод стандартной ПЦР с перекрыванием. После сборки конструкции одноцепочечный фрагмент ДНК (хорошо промотирующий переход от негомологичного соединения концов двухцепочечного разрыва (NHEJ) к рекомбинационной репарации) был получен с помощью асимметричной ПЦР с избытком одного из праймеров (с индексом F). Фрагмент имел последовательность: GTGATCACTTGGGTGGTGGCT GTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCA AAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCAT ACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGC TTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAA

Формирование РНП-комплекса

Для получения готовых РНП-комплексов и инъекции их в зиготу использовали следующие исходные компоненты: Cas9 (20 мкМ), 1:1 гРНК №1 и №5 (30 нг/мкл), одноцепочечную ДНК (оцДНК) (100 нг/мкл), буфер для разведения (0,25 мМ ЭДТА /10 мМ TrisHCl; pH 7,4).

Для приготовления инъекционного раствора 0,5 мкл Cas9 (20 мкМ) смешивали с 4,5 мкл буфера для разведения. Затем к 5,34 мкл буфера для разведения добавляли 1,56 мкл полученного раствора Cas9 (2 мкМ), 0,6 мкл смеси гРНК (30 нг/мкл) и 2,5 мкл оцДНК (100 нг/ мкл). Смесь инкубировали при 37 °С в течение 10 мин, затем сразу использовали для инъекций.

Инъекция комплекса CRISPR-Cas9 в зиготу

Инъекцию CRISPR-Cas9 в аномальные зиготы проводили в S-фазе клеточного цикла в соответствии со стандартным протоколом Intra Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) [13]. Объем инъекции составлял 1 нл. После инъекции CRISPR-Cas9 зиготы дважды промывали средой Sydney IVF Cleavage Medium (COOK Medical LLC; США), затем перемещали в среду Sydney IVF Blastocyst Medium (COOK Medical LLC; США) и инкубировали в ОД^инкубаторе Эмбриоплан (Вэсттрейд; Россия) со стандартными параметрами в течение 5 дней до образования бластоцисты (около 250 клеток). После инкубации каждую бластоцисту перемещали в 12 мкл буфера для разведения и сразу анализировали с помощью ПЦР.

ПЦР-генотипирование и анализ данных

ПЦР-генотипирование проводили так же, как описано в [14], на приборе DTprime Real-Time (ДНК-Teхнология;

Россия), однако для выхода из зоны взаимодействия гРНК использовали другой универсальный праймер CCR5_ check2_R: TCATTTCGACACCGAAGCAGA. Результаты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения DTprime v.7.7 ИНК^ехнология; Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из 16 зигот, инъецированных системой CRISPR-Cas9, лишь 8 достигли стадии бластоцисты. Из 5 контрольных зигот (инъецированных буфером для разбавления) 3 достигли бластоцисты. Это стандартная эффективность

Рис. 2. Кривые ПЦР «в реальном времени», полученные для разных генотипов: двух контрольных эмбрионов (Л), двух мозаичных эмбрионов с примерно 3% WT ССЯ5 (Б), двух эмбрионов, гомозиготных по ССЯ5<еКа32 (В)

Таблица 2. Значения пороговых циклов ПЦР для каждого эмбриона

№ эмбриона Cp WT Cp del

Контроль 1 34,1 -

Контроль 2 34,1 -

Контроль 3 36,0 -

Эксп. 1 - 38,1

Эксп. 2 40,8 38,1

Эксп. 3 37,8

Эксп. 4 44,0 37,5

Эксп. 5 - 37,3

Эксп. 6 43,3 37,5

Эксп. 7 - 34,5

Эксп. 8 - 35,0

Примечание: - отсутствие амплификации.

выхода бластоцист для аномальных зигот, и можно сделать вывод, что процедура инъекции не повысила вероятность остановки развития. ПЦР-генотипирование показало отсутствие исходного варианта ^ ССЯ5 в 5 из 8 бластоцист (с образованием эмбрионов, полностью гомозиготных по ССЯ5Се!1а32). Два эмбриона продемонстрировали около 3% и один - около 20% остаточного мозаицизма по исходному варианту ^ ССЯ5 (рис. 2). Значения пороговых циклов Ср для каждого эмбриона указаны в табл. 2. Каждый ПЦР-протокол включал в себя отрицательный контрольный образец (буфер для разбавления) в двух повторностях. Все отрицательные контрольные образцы дали отрицательный результат.

ОБСУЖДЕНИЕ

СИЗРЯ-Саэ^опосредованное редактирование генома зигот человека представляет собой эффективный метод модификации внутриклеточной ДНК, достигающий почти

100%-й элиминации исходной последовательности более чем у половины взятых в исследование эмбрионов [9, 10, 12, 15]. Наши результаты хорошо коррелируют с другими случаями применения систем редактирования генома демонстрируя сопоставимо высокую эффективность.

В течение последних двух лет мы видим чрезвычайно быстрое развитие и обновление ЭБ-систем. Однако главным вопросом на сегодняшний день является степень нецелевой активности систем редактирования генома. Только после однозначного подтверждения безопасности такие методы могут быть применены в реальной клинической практике.

ВЫВОДЫ

В работе продемонстрирована эффективность СИБРЯ-Саэ9-опосредованного создания делеции ССЯ5Се!1а32 в эмбрионах человека. Разработанная система позволила получить более половины полностью модифицированных эмбрионов.

Литература

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1. Yu S, Yao Y, Xiao H, Li J, Liu Q, Yang Y, et al. Simultaneous Knockout of CXCR4 and CCR5 Genes in CD4+ T Cells via CRISPR-Cas9 Confers Resistance to Both X4- and R5-Tropic Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection. Hum Gene Ther. 2018 Jan; 29 (1): 51-67. DOI: 10.1089/hum.2017.032.

2. Xu L, Yang H, Gao Y, Chen Z, Xie L, et al. CRISPR-Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. 2017 Aug 2; 25 (8): 1782-9. DOI: 10.1016/j.ymthe.2017.04.027.

3. Haworth KG, Peterson CW, Kiem HP. CCR5-edited gene therapies for HIV cure: Closing the door to viral entry. Cytotherapy. 2017 Nov; 19 (11): 1325-38. DOI: 10.1016/j.jcyt.2017.05.013.

4. Liu Z, Chen S, Jin X, Wang Q, Yang K, Li C, et al. Genome editing of the HIV co-receptors CCR5 and CXCR4 by CRISPR-Cas9 protects CD4+ T cells from HIV-1 infection. Cell Biosci. 2017 Sep 9; (7): 47. DOI: 10.1186/s13578-017-0174-2.

5. Nerys-Junior A, Braga-Dias LP, Pezzuto P, Cotta-de-Almeida V, Tanuri A. Comparison of the editing patterns and editing efficiencies of TALEN and CRISPR-Cas9 when targeting the human CCR5 gene. Genet Mol Biol. 2018 Jan-Mar; 41 (1): 16779. DOI: 10.1590/1678-4685-GMB-2017-0065.

6. Makokha EP, Songok EM, Orago AA, Koech DK, Chemtai AK, Kobayashi N, et al. Maternal immune responses and risk of infant infection with HIV-1 after a short course Zidovudine in a cohort of HIV-1 infected pregnant women in rural Kenya. East Afr Med J. 2002 Nov; 79 (11): 567-73.

7. French CE, Tookey PA, Cortina-Borja M, de Ruiter A, Townsend CL, Thorne C. Influence of short-course antenatal antiretroviral therapy on viral load and mother-to-child transmission in subsequent pregnancies among HIV-infected women. Antivir Ther. 2013; 18 (2): 183-92. DOI: 10.3851/IMP2327.

8. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, et al. CRISPR-Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015 May; 6 (5): 363-72. DOI: 10.1007/s13238-015-0153-5. Epub 2015 Apr 18.

9. Tang L, Zeng Y, Du H, Gong M, Peng J, Zhang B, et al. CRISPR-Cas9-mediated gene editing in human zygotes using Cas9 protein. Mol Genet Genomics. 2017 Jun; 292 (3): 525-33. DOI: 10.1007/s00438-017-1299-z.

10. Ma H, Marti-Gutierrez N, Park SW, Wu J, Lee Y, Suzuki K, et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 2017 Aug 24; 548 (7668): 413-19. DOI: 10.1038/ nature23305.

11. Fogarty NME, McCarthy A, Snijders KE, Powell BE, Kubikova N, Blakeley P, et al. Genome editing reveals a role for OCT4 in human embryogenesis. Nature. 2017 Oct 5; 550 (7674): 67-73. DOI: 10.1038/nature24033.

12. Liang P, Ding C, Sun H, Xie X, Xu Y, Zhang X, et al. Correction of ß-thalassemia mutant by base editor in human embryos. Protein Cell. 2017 Nov; 8 (11): 811-22. DOI: 10.1007/s13238-017-0475-6.

13. Joris H, Nagy Z, Van de Velde H, De Vos A, Van Steirteghem A. Intracytoplasmic sperm injection: laboratory set-up and injection

procedure. Hum Reprod. 1998 Apr; 13 Suppl 1: 76-86. 14. Kofiadi IA, Rebrikov DV, Trofimov DY, Alexeev LP, Khaitov RM. Allelic distribution of the CCR5, CCR2, and SDF1 gene polymorphisms associated with HIV-1/AIDS resistance in Russian populations. Dokl Biol Sci. 2007 Jul-Aug; (415): 320-3.

15. Kang X, He W, Huang Y, Yu Q, Chen Y, Gao X, Sun X, Fan Y. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 2016 May; 33 (5): 581-588. DOI: 10.1007/ s10815-016-0710-8.

References

1. Yu S, Yao Y, Xiao H, Li J, Liu Q, Yang Y, et al. Simultaneous Knockout of CXCR4 and CCR5 Genes in CD4+ T Cells via CRISPR-Cas9 Confers Resistance to Both X4- and R5-Tropic Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection. Hum Gene Ther. 2018 Jan; 29 (1): 51-67. DOI: 10.1089/hum.2017.032.

2. Xu L, Yang H, Gao Y, Chen Z, Xie L, et al. CRISPR-Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. 2017 Aug 2; 25 (8): 1782-9. DOI: 10.1016/j.ymthe.2017.04.027.

3. Haworth KG, Peterson CW, Kiem HP. CCR5-edited gene therapies for HIV cure: Closing the door to viral entry. Cytotherapy. 2017 Nov; 19 (11): 1325-38. DOI: 10.1016/j.jcyt.2017.05.013.

4. Liu Z, Chen S, Jin X, Wang Q, Yang K, Li C, et al. Genome editing of the HIV co-receptors CCR5 and CXCR4 by CRISPR-Cas9 protects CD4+ T cells from HIV-1 infection. Cell Biosci. 2017 Sep 9; (7): 47. DOI: 10.1186/s13578-017-0174-2.

5. Nerys-Junior A, Braga-Dias LP, Pezzuto P, Cotta-de-Almeida V, Tanuri A. Comparison of the editing patterns and editing efficiencies of TALEN and CRISPR-Cas9 when targeting the human CCR5 gene. Genet Mol Biol. 2018 Jan-Mar; 41 (1): 16779. DOI: 10.1590/1678-4685-GMB-2017-0065.

6. Makokha EP, Songok EM, Orago AA, Koech DK, Chemtai AK, Kobayashi N, et al. Maternal immune responses and risk of infant infection with HIV-1 after a short course Zidovudine in a cohort of HIV-1 infected pregnant women in rural Kenya. East Afr Med J. 2002 Nov; 79 (11): 567-73.

7. French CE, Tookey PA, Cortina-Borja M, de Ruiter A, Townsend CL, Thorne C. Influence of short-course antenatal antiretroviral therapy on viral load and mother-to-child transmission in subsequent pregnancies among HIV-infected women. Antivir Ther. 2013; 18 (2): 183-92. DOI: 10.3851/IMP2327.

8. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, et al. CRISPR-Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015 May; 6 (5): 363-72. DOI: 10.1007/s13238-015-0153-5. Epub 2015 Apr 18.

9. Tang L, Zeng Y, Du H, Gong M, Peng J, Zhang B, et al. CRISPR-Cas9-mediated gene editing in human zygotes using Cas9 protein. Mol Genet Genomics. 2017 Jun; 292 (3): 525-33. DOI: 10.1007/s00438-017-1299-z.

10. Ma H, Marti-Gutierrez N, Park SW, Wu J, Lee Y, Suzuki K, et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 2017 Aug 24; 548 (7668): 413-19. DOI: 10.1038/ nature23305.

11. Fogarty NME, McCarthy A, Snijders KE, Powell BE, Kubikova N, Blakeley P, et al. Genome editing reveals a role for OCT4 in human embryogenesis. Nature. 2017 Oct 5; 550 (7674): 67-73. DOI: 10.1038/nature24033.

12. Liang P, Ding C, Sun H, Xie X, Xu Y, Zhang X, et al. Correction of ß-thalassemia mutant by base editor in human embryos. Protein Cell. 2017 Nov; 8 (11): 811-22. DOI: 10.1007/s13238-017-0475-6.

13. Joris H, Nagy Z, Van de Velde H, De Vos A, Van Steirteghem A. Intracytoplasmic sperm injection: laboratory set-up and injection procedure. Hum Reprod. 1998 Apr; 13 Suppl 1: 76-86.

14. Kofiadi IA, Rebrikov DV, Trofimov DY, Alexeev LP, Khaitov RM. Allelic distribution of the CCR5, CCR2, and SDF1 gene polymorphisms associated with HIV-1/AIDS resistance in Russian populations. Dokl Biol Sci. 2007 Jul-Aug; (415): 320-3.

15. Kang X, He W, Huang Y, Yu Q, Chen Y, Gao X, Sun X, Fan Y. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 2016 May; 33 (5): 581-588. DOI: 10.1007/ s10815-016-0710-8.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.