CC BY
179
эффективность совместного применения il-2 и il-15 для активации цитотоксических лимфоцитов in vitro
Е.В. Абакушина, Ю.В. Маризина, Г.С. Неприна
Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал Национального медицинского исследовательского радиологического центра, Обнинск, Россия
Efficiency of IL-2 and IL-15 combined use for activation of cytotoxic lymphocytes in vitro
E.V. Abakushina, Yu.V. Marizina, G.S. Neprina
A. Tsyb Medical Radiological Research Centre - branch of the National Medical Research Radiological Centre, Obninsk, Kaluga region, Russia
Одним из современных подходов к лечению пациентов со злокачественными новообразованиями является применение иммунотерапии с использованием активированных цитотоксических лимфоцитов . В этой связи актуален поиск методологических подходов для получения активированных лимфоцитов in vitro .
В результате данного исследования был усовершенствован метод активации и длительного культивирования лимфоцитов онкологических больных с использованием цитокинов iL-2 и iL-15 . Культивирование периферических мононуклеарных клеток (ПМК) больных раком желудка, толстой кишки и почки проводили с использованием разных сред на основе RPMi-1640 c iL-2 в течение 10 дней и X-vivo20 с добавлением iL-2 и iL-15 в течение 14 дней . Ци-тофлуориметрическим методом каждые 2 сут оцененива-лись экспрессия маркеров активации (CD38, CD69, CD25, HLA-DR и CD314) и субпопуляционный состав лимфоцитов . При культивировании ПМК в первой среде было отмечено увеличение экспрессии маркеров активации лимфоцитов после 3 дня, а во второй среде после 5 дня Выявлено, что активация лимфоцитов в среде на основе RPMi с iL-2 происходит быстрее, однако пролиферация и жизнеспособность лимфоцитов были несколько ниже, чем во второй среде, поэтому ее можно рекомендовать для быстрого получения лимфокин-активированных клеток киллеров . Среду же на основе X-vivo20 с комбинацией цитокинов iL-2 и iL-15 можно рекомендовать для длительного культивирования и наращивания активированных лимфоцитов . Было показано, что комбинация цитокинов iL-2 и iL-15 позитивно влияет не только на пролиферативную активность клеток и экспрессию маркеров активации, но и на их жизнеспособность
Ключевые слова: культивирование лимфоцитов, активация лимфоцитов in vitro, iL-2, iL-15, маркеры активации, ЛАК-клетки, NK-клетки .
One of the modern approaches for cancer treatment is based on the application of immunotherapy using activated cytotoxic lymphocytes . Search of methodological approaches for the preparation of activated lymphocytes in vitro is relevant . As a result of this study, the method for activation and culturing of lymphocytes for cancer patients have been perfected using cytokine iL-2 and iL-15 . Peripheral mononuclear cells of cancer patients were culture using two different mediums based on RPMi-1640 with iL-2 for 10 days and X-vivo20 supplemented with iL-2 and iL-15 for 14 days . The expression of activation markers (CD38, CD69, CD25, HLA-DR and CD314) and subpopulations of lymphocytes were evaluated by the method of flow cytometry every 2 days The expression of activation markers of lymphocytes increased after 3 days of culture in the first medium and after 5 days in the second one . We revealed that the activation of lymphocytes was faster in medium based on RPMi with iL-2, but the proliferation and viability of lymphocytes were lower than in the second medium The culture medium based on RPMi with iL-2 can be recommended for more quickly obtaining of lymphokine-activated killer cells The medium based on X-vivo20 with a combination of iL-2 and iL-15 can be recommended for a longer cultivation of lymphocytes and for escalating of lymphokine-activated killer cells it has been shown that the combination of cytokines iL-2 and iL-15 not only has a positive influence on the proliferation activity of the lymphocytes and the expression of activation markers, but also on their viability
Keywords: lymphocyte culture, activated lymphocytes in vitro, iL-2, iL-15, activation markers, LAK-cells, NK-cells .
Введение
Ранняя диагностика и эффективное лечение злокачественных новообразований не утратили своей актуальности в настоящее время . Наоборот, наблюдается неуклонный рост больных с данной патологией . Однако применение стандартных подходов лечения, включающих лучевую и химиотерапию, часто сопровождается развитием нежелательных побочных реакций и осложнений, приводящих, в том числе, к иммунодефицитным состояниям . Поэтому актуален поиск путей повышения функции иммунной системы, в том числе для противоопухолевой защиты организма . Хорошо известно, что важная роль защиты организма от злокачественных образований отведена клеточному звену иммунитета, представленному в организме человека рядом эффектор-ных клеток, которые объединяют цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), NKT-клетки и NK-клетки [1—5]. Последнее время все большее значение в терапии онкологических заболеваний приобретают комплексные подходы с использованием методов клеточной
e-mail: abakushina@mail . ru
иммунотерапии на основе культивируемых in vitro цитотоксических лимфоцитов, дендритных клеток, трансгенных опухолевых клеток [6—11]. Наиболее эффективным и перспективным методом увеличения активности иммунной системы у онкологических больных считается адоптивная иммунотерапия активированными цитотоксическими лимфоцитами (NK-клетками и CTL) в сочетании с цитокинами или без них [8, 10—14]. В литературе их называют лимфокин-активированные киллеры (ЛАК-клетки) или цитокин-индуцированные CiK (cytokineinduced killer) клетки киллеры [13—15]. Они могут соответствовать фенотипу клеток естественных киллеров CD3-CD16+/CD56 + или цитотоксических Т-лимфо-цитов (CD3+/CD8 + ) . Полагают, что ЛАК-клетки осуществляют свой эффект за счет одновременного взаимодействия сразу нескольких субпопуляций им-мунокомпетентных клеток с различным фенотипом
Для изучения процесса активации лимфоцитов часто оценивают экспрессию маркеров ранней (CD38, CD69, CD25) и поздней (HLA-DR) активации
[16—18]. NK-клетки несут на своей поверхности активирующий рецептор NKG2D (CD314), который необходим для проведения сигнала внутрь клетки и повышения цитотоксической активности киллеров [2]. Для оценки этапов дифференцировки лимфоцитов часто определяют поверхностный маркер CD45 + RA, который экспрессируется незрелыми Т-клетками, и CD45+R0, который характерен для Т-клеток памяти [16].
На сегодняшний день нет общепринятого метода культивирования лимфоцитов, поэтому разработка протоколов активации и выращивания NK-клеток или пула цитотоксических лимфоцитов является актуальной задачей. Известен «способ получения активированных лейкоцитов для адъювантной адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований» [19]. В нём лейкоциты выделяют из периферической крови, культивируют в среде в течение 48—72 ч . с добавлением гранулоцитар-ного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Основными недостатками способа являются добавление Г-КСФ, который регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток гранулоцитарного ряда, а не лимфоцитов, а также короткие сроки культивирования клеток, не позволяющие проводить адоптивную иммунотерапию в течение длительного периода времени без дополнительного забора крови
Противоопухолевая активность ЛАК-клеток in vitro может быть повышена путем стимуляции лимфоцитов цитокинами, такими как iL-2, iL-12, iL-15 или iL-18 [20—22]. Важную роль в противоопухолевой активности активированных лимфоцитов, как Т-лимфоцитов, так и NK-клеток играют iL-2 и iL-15 [22]. Добавление комбинации iL-2 и iL-15 в полную питательную среду способствует повышению жизнеспособности, пролиферативной активности и функциональной противоопухолевой активности культивируемых лимфоцитов . Цитокины, находящиеся в супернатанте (культуральной среде), положительно влияют на экспрессию поверхностных маркеров активации лимфоцитов периферической крови Описан также способ воздействия на лимфоциты, который основан на активации высокими концентрациями iL-2 (ронколейкин 1000 Ед/мл) 20 мл лейкоцитарной массы путем кратковременной инкубации в термостате [23]. Главными недостатками способа являются использование высоких концентраций iL-2 в среде для культивирования клеток и сроках культивирования клеток, не позволяющих длительно проводить адоптивную иммунотерапию . Другой «способ получения активированных мононуклеарных лейкоцитов» описывает культивирование клеток в питательной среде с добавлением iL-2 и циклодекстрина в течение 18—48 ч . [24]. К недостаткам данного метода относятся короткие сроки культивирования и присутствие макрофагов
Целью нашего исследования явилось усовершенствование метода культивирования лимфоцитов онкологических больных с использованием двух цитокинов iL-2 и iL-15 . Мы предположили, что в отличие от известных способов культивирования клеток, предлагаемый способ получения активированных цитотоксических лимфоцитов с помощью совместного применения iL-2 и iL-15 in vitro может стать более эффективным и безопасным для
проведения иммунотерапии, благодаря низким концентрациям цитокинов (^-2 и ^-15). Важным фактором является то, что данный метод культивирования позволит проводить иммунотерапию полученными активированными клетками пациентам в течение длительного времени, а также он может использоваться для пациентов с выраженным негативным ответом на введение препаратов интер-лейкинов
Материал и методы
Характеристика пациентов
В исследовании приняли участие 70 пациентов с верифицированными онкологическими заболеваниями: почечно-клеточным раком (ПКР), метастатической меланомой кожи и злокачественными новообразованиями абдоминальной области (ЗНАО) (табл . ). После подписания пациентами добровольного информированного согласия у них забирались образцы крови для выделения периферических мононуклеарных клеток (ПМК) с последующей оценкой субпопуляционного состава лимфоцитов
Таблица. характеристика пациентов
Заболевание,стадия Количество пациентов Возраст пациентов, лет
Почечно-клеточный рак, I ст. 6 49-67
Меланома кожи с метастазами, I—IV ст. 42 33-77
Злокачественные новообразования кишечника, I—IV ст. 17 42-78
Рак желудка, IV ст. 2 26 и 49
Рак поджелудочной железы, IV ст. 3 46-56
Выделение периферических мононуклеарных
клеток
Для культивирования использовали ПМК «первичных» больных (без предшествующего лечения) . ПМК выделяли из гепаринизированной крови на градиенте плотности Histopague-1077 (Sigma-Aldrich, Великобритания) по стандартной методике [25] Для этого венозную кровь, разбавленную в 2 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (Gibco by life technologies, Великобритания) центрифугировали при 2000 rpm в течение 20 мин на градиенте Histopague-1077 плотностью 1,077 г/см3 . ПМК, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и двукратно отмывали в ФСБ После каждой отмывки в 10-кратном объеме ФСБ клетки осаждали центрифугированием при 1500 rpm, подсчитывали и ресуспендировали в концентрации 1—2х10в кл/мл в готовой питательной среде
Культивирование клеток
Выделенные ПМК e, hfnm помещали в стерильные пластиковые флаконы по 10 мл и культивировали на протяжении 14 дней в среде № 1: RPMi-1640 c глутамином (GlutaMAX-1), с добавлением гентами-цина 10 мг/мл (Gibco by life technologies, Великобритания), пирувата натрия (100 mM, 11 мкг/мл, Sigma-Aldrich, Великобритания), iL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) (250 МЕ/мл) и 10% эфетальной телячьей сыворотки (ФТС) (Gibco by life technologies, Великобритания); или в среде № 2: X-vivo20 (Lonza, США) с добавлением 5% ФТС (Gibco by life technologies, Великобритания), гентамицина 10 мг/мл (Gibco by life technologies, Великобритания), пирувата натрия (100 mM, 11 мкг/мл, Sigma-Aldrich, Великобритания), iL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) (250 МЕ/мл) и iL-15 (50 нг/мл) (immunoTools, Германия) в СО2 инкубаторе во влажной атмосфере при 37°С . Каждые 72 ч культивирования часть суспензионных клеток собирали для фенотипирования, а 50% питательной среды заменяли новой
Проточная цитометрия
Фенотипирование флуоресцентно меченых лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, США), анализировали не менее 5000 событий в секторе живых клеток [22]. Для оценки чистоты выделения лимфоцитов сразу после выделения ПМК всем больным проводили цитофлуориметрический анализ с использованием антител к CD45 (лимфоциты) и CD14 (моноциты) Также оценивали субпопуляционный состав лимфоцитов (Т-, B-, NK-, NKT-лимфоциты) периферической крови и маркеров активации CD25, CD38, CD69, CD314, HLA-DR, CD45+R0 и CD45+RA на Т- и NK-клетках . Субпопуляционный состав выделенных лимфоцитов и экспрессию маркеров активации лимфоцитов у 10 первичных больных меланомой и 10 первичных больных ЗНАО оценивали также на этапах культивирования на 3, 6, 10 и 14 день культивирования в среде № 1, у 6 первичных пациентов ПКР в среде № 2 после начала культивирования . Также у данной группы больных проводили магнитную сепарацию NK-клеток .
Для фенотипирования выделенные или культивируемые лимфоциты отмывали ФСБ и окрашивали конъюгированными с РЕ или FiTC антителами, которые связываются с антигенами клеточной поверхности, к CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD16, CD20, CD25, HLA-DR, CD38, CD45, CD56, CD69, CD80, CD86 (Beckman Coulter, Франция) и CD314 (eBioScience, США). Экспрессию NKG2D (CD314) анализировали на поверхности лимфоцитов CD56 + с помощью двухпараметрического цитометрического анализа . Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили в ФСБ, содержащем 1% ФТС и 0,02% NaN3 в течение 30 мин при 4°С с последующей двукратной отмывкой ФСБ путем центрифугирования Обработку полученных результатов проводили с помощью программы «CellQuest» .
Выделение субпопуляции ЫК-клеток
с помощью магнитной сепарации
У 6 больных раком почки отделяли NК-клетки от всех активированных ПМК на 9 день культивирования методом магнитной сепарации с помощью набо-
ра Dynabeads Untouched Human NK cells (invitrogen, Норвегия), согласно инструкции производителя . Для этого в суспензию лимфоцитов добавляли биотини-лированные антитела к Т- (анти CD3) и В-клеткам (анти CD19), инкубировали в течение 20 мин . при + 5°С и отмывали центрифугированием . Затем добавляли магнитные частички и инкубировали в течение 15 мин . при комнатной температуре, после чего с помощью магнита и принципа негативной селекции отделяли меченые Т- и В-клетки, а оставшиеся в суспензии NK-клетки повторно отмывали с помощью ФСБ и производили оценку чистоты выделения с помощью проточного цитометра и антител CD3-/ CD16+/CD56 + .
Оценка цитотоксической активности
лимфоцитов
Для оценки цитотоксической активности активированных лимфоцитов использовали не радиоактивный колориметрический ферментативный анализ по выходу лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из мертвых клеток (CytoTox, Promega, США) . Для этого клетки-мишени линии К562 и клетки-эффекторы (активированные лимфоциты) смешивали в различных соотношениях титрованием до конечного соотношения эффектор/мишень: 25:1, 12,5:1 и 6:1 и инкубировали 3 ч . в ППС в СО2 инкубаторе . Выход ЛДГ из перфорированных клеток в супернатант измеряли в 30-минутном ферментативном тесте, где под воздействием диафоразы происходило превращение солей тетразолия в красные продукты формазана Оценку оптической плотности образцов клеточного супернатанта оценивали при длине волны 490 нм на фотометре (ChroMate 4300, США), процент специфического лизиса клеток-мишеней определяли по формуле:
СЛ (%) = [ЭМ-М-(Э-С)]/[Ммах-М]х100,
где СЛ(%) — процент специфического лизиса клеток-мишеней; ЭМ — выход ЛДГ из клеток-мишеней и клеток-эффекторов в экспериментальных точках; Э — фон клеток эффекторов; М — фон клеток-мишеней; С — фон культуральной среды; Ммах — максимальный выход ЛДГ из клеток-мишеней [26].
Оценка пролиферативной активности
и жизнеспособности клеток
Пролиферативную активность и жизнеспособность культивируемых во флаконах клеток оценивали каждые 72 ч . с помощью трипанового синего (Trypan Blue Dye 0,1%, Bio-Rad, Великобритания) в автоматическом анализаторе жизнеспособности клеток TC10 (BioRad, Сингапур). Результат получали как долю мертвых клеток в процентах Количество клеток в 1 мл суспензии пересчитывали на общий объем культуральной среды .
Оценка морфологии клеток
Ежедневно оценивали морфологию клеток в культуре при помощи инвертированного микроскопа (Nikon, Eclipse TS100, Япония) . Производили визуальный анализ изменения формы, размеров, гранулярности и наличия адгезивных свойств у культивируемых лимфоцитов .
Статистический анализ
Статистический анализ данных проводили с помощью программ Microsoft Excel 2003 и Statsoft Statistica 6 . 0 . Данные представляли как среднее по группе ± стандартное отклонение (SD). Для сравнения показателей фенотипа лимфоцитов до и после культивирования использовали t-критерий Стьюден-та . Различия считали значимыми при р<0,05 .
Результаты и обсуждение
Лимфоциты, выделенные из периферической крови первичных больных, культивировали на протяжении 10—14 дней в среде на основе RPMi с добавлением iL-2 (№ 1) и 14—18 дней в среде на основе X-vivo20 (№ 2) с добавлением iL-2 и iL-15 . При оценке морфологии клеток в культуре была за-
мечена адгезия некоторых лимфоцитов к поверхности культурального пластика со 2—3 дня культивирования и формирование групп в процессе роста (рис . 1) . Иммунофенотипирование ПМК сразу после выделения не выявило наличия Сй14+-клеток, т . е . моноцитов Известно, что адгезивными свойствами могут обладать В-лимфоциты и в меньшей степени Т- и NK-кпетки во время активации . Так как этот процесс в организме происходит только в лимфоидных органах, клеткам необходим субстат Отмечено, что в среде № 1 лимфоциты у всех пациентов постепенно начинали изменять форму с круглой на продолговатую и неровную, увеличиваться в размерах со 2 дня культивирования, а в среде № 2 меняли свою форму немного позже — с 3 дня — и сохраняли морфологию больших гранулярных лимфоцитов на протяжении всего периода выращивания (рис . 1В, Г) .
Также было замечено, что в среде № 1 у некоторых пациентов лимфоциты начинали терять адгезионные свойства после 7 дня культивирования, а в среде № 2 после 10 дня, что является неблагоприятным признаком для любых клеточных культур (рис . 1Д, Е). Оценивая фенотип субпопуляции клеток с адгезивными свойствами, которые утратили таковые в среде № 1 к 8 дню культивирования, а в среде № 2 к 11 дню, было показано, что основную долю этих клеток составляют дендритные клетки (более 52%), а также некоторое количество Т-лимфоцитов (около 30%) и NK-клеток (около 15%) . Макрофагов в субпопуляции адгезирующих к пластику клеток обнаружено не было . Переход клеток в суспензию может означать окончание процесса их активации
Так как лимфоциты, циркулирующие в крови, являются специализированными клетками, а про-лиферативная активность у них появляется только после стимуляции и в организме происходит в лим-фоидных органах, в условиях in vitro лимфоциты не пролиферируют без дополнительных факторов активации, таких как цитокины В этой связи активно разрабатываются методы не только краткосрочной активации лимфоцитов in vitro, но и наращивания их количества с сохранением жизнеспособности и нужных свойств .
Первоочередной задачей исследования было определение динамики нарастания экспрессии маркеров активации в культуре ПМК и оценка их про-лиферативной активности в зависимости от среды культивирования
В данной работе при культивировании ПМК в среде № 1 с добавлением только iL-2 отмечено увеличение пролиферативной активности клеток с 6—7 дня культивирования и незначительное нарастание этой активности до 10 дня в среднем лишь на 50% Хорошо известно, что iL-2 способствует дифференциров-ке эффекторных цитотоксических NK-клеток, в то время как в меньшей степени влияет на продукцию ими цитокинов [27] В среде № 2 с добавлением iL-2 и iL-15 увеличение пролиферативной активности к 6-7 дню было незначительное и составило в среднем около 20%, а к 14 дню количество клеток увеличивалось в два раза, т е произошло удвоение популяции, чего не было достигнуто в среде № 1 Подобные результаты описаны в работах зарубежных авторов [28]. Показано, что добавление iL-15 увеличивает степень активации NK-клеток .
Отмечено, что в среде № 2 была выше жизнеспособность культивируемых клеток До 10 дня культивирования она была выше 97%, а на 14 день была не менее 95% При этом в среде № 1 жизнеспособность клеток была несколько ниже Так, на 3 день она в среднем составляла 98±1,5%, на 7 день снизилась до 93±2%, на 10 день была около 89±3%, а на 14 день уменьшилась до 81 ±4,8% . По всей видимости, дополнительные компоненты среды X-vivo20 — инсулин, трансферин и iL-15 обладают не только стимулирующим влиянием на пролиферацию и активацию лимфоцитов, но и способствуют увеличению жизнеспособности клеток . Некоторыми авторами было показано, что iL-15, в отличие от iL-2, обладает более широким спектром биологических эффектов не только на NK-клетки, но и на Т-клетки, увеличивая их пролиферацию и регулируя апоптоз Т-клеток памяти [29, 30, 31].
Для определения субпопуляционного состава лимфоцитов и маркеров активации у больных, было
проведено фенотипирование CD45+-клеток периферической крови и суспензионных ЛАК-клеток больных с разными онкологическими заболеваниями на 0, 3, 6, 10 и 14 день культивирования . Использование комбинации антител к CD45+/CD14+ показало, что лимфоциты составляют более 98% исследуемых клеток . Исходно у 38% больных ЗНАО отмечалось снижение относительного числа В-лимфоцитов, у 42% — повышение содержания Treg-клеток и у 59% — увеличение количества NK-клеток . Количество активированных лимфоцитов (HLA-DR + ) у больных в среднем составило 19,9±6,8%, CD25+ клеток — 12,5±5,6%, CD38 + - 31,3±11,3%, а CD69 + -20,7±10,5% . Среднее содержание рецептора NKG2D на всех лимфоцитах составило 44,3±11,6%, а на NK-клетках — 18,1 ±10,9% . К 3 дню культивирования в среде № 1 на лимфоцитах больных ЗНАО экспрессия а-цепи рецептора iL-2 ^D25) увеличилась в 1,7 раз, HLA-DR — в 1,5 раз, СD314 — в 1,5 раза (р = 0,001), а СD38 — в 1,7 раз (р = 0,02) . Экспрессия раннего активационного маркера CD69, в свою очередь, увеличилась на всех лимфоцитах к 3 дню в 2,9 раз (р = 0,005), а на NK-клетках — в 2,2 раза (р = 0,02) (рис 2) Количество юных форм лимфоцитов (CD45 + RA+) у двух групп больных постепенно уменьшалось, а количество зрелых клеток памяти (CD45 + R0 + ) увеличивалось в процессе культивирования Такая тенденция сохранялась до окончания наблюдения . Доля NK-клеток у больных ЗНАО при этом увеличилась на 2,5%, а доля Т^-клеток значительно не изменилась . У больных меланомой прирост субпопуляций данных лимфоцитов был выше и составил 13% (р = 0,03) и 4,1%, соответственно (рис . 2).
В периферической крови 31% больных мела-номой отмечалось снижение относительного числа В-лимфоцитов и увеличение количества NK-клеток, у 34% — повышение содержания Treg-клеток . Относительное содержание активированных лимфоцитов HLA-DR + составило 19,9±7,2%, что соотносится с фенотипом лимфоцитов больных ЗНАО (рис . 2) . Относительное содержание маркеров ранней активации CD38+ и CD69 + лимфоцитов составило 40,7±15,9% и 16,7±9,8%, соответственно . Уровень экспрессии рецептора NKG2D (CD314+) лимфоцитами составил 42,7±12,7%, а NK-клетками — 14,5±9,1%, что несколько ниже, чем в группе больных ЗНАО . На 3 день культивирования в среде № 1 также наблюдалась тенденция к увеличению уровня экспрессии ак-тивационных маркеров и сохранению данного явления на протяжении всего времени культивирования лимфоцитов больных меланомой . Экспрессия акти-вационных маркеров CD25 увеличилась в 2,2 раза, HLA-DR в 3,2 раза (p = 0,015), СD314 в 1,6 раз (p = 0,01), СD38 в 1,4 раза, CD69 в 4,3 раза (p = 0,005), а CD69 NK-клетками — в 3,6 раз (p = 0,04) (рис . 2Б). Количество незрелых клеток (CD45 + RA+) в культуре уменьшилось пропорционально увеличению доли зрелых (CD45 + R0 + ) (рис . 2) . Такая же тенденция наблюдалась и в последующие дни культивирования Данные изменения свидетельствуют о том, что в процессе культивирования лимфоциты не только пролиферировали и активировались, но еще и дифференцировались в более зрелые формы . Полученные данные о характерных изменениях в морфологии лимфоцитов и их фенотипе говорят о том, что вид онкологического заболевания существенно не влияет на процесс активации и пролиферации лимфоцитов in vitro
А
Б
Blyn
CD6B+T4yn
№lyr>
yj' ■ i } ) '; ': '; ■
HADR CD25(IL2a)
-Octay --3day
LL№T()ni
IKtTiyn
Рис. 2. Изменение экспрессии поверхностных CD культивируемыми лимфоцитами в среде № 1 сразу после выделения и на 3 сут.: А — лимфоциты больных ЗНАО; Б — лимфоциты больных меланомой
Оценивая фенотип клеток больных ПКР, так же как у больных меланомой, было выявлено повышенное содержание Treg-лимфоцитов (CD4+25bright) и CD25+-клеток в периферической крови . У 75% больных отмечалось увеличение количества NK-клеток Относительное содержание активированных лимфоцитов HLA-DR + в среднем составило 19,3±6,1%, CD38+ клеток - 29,7±17,0%, а CD69+ - 20,2±22,1%. Уровень экспрессии рецептора NKG2D (CD314) лимфоцитами составил 45,7±16,6%, а NK-клетками - 21,5±14,5% . При культивировании клеток в среде № 2 было выявлено, что в процессе активации происходит незначительное перераспределение клеточных субпопуляций Так количество В- и Т-лимфоцитов незначительно уменьшалось к 14 дню культивирования . Доля Т- и NKT-клеток начинала увеличиваться с 6 дня . Количество NK-клеток к 10 дню возрастало в 1,4 раза, а Тгед-клеток к 14 дню увеличивалось в 1,7 раз . Лимфоциты активировались in vitro в большей степени после 5 дня культивирования Тенденция к увеличению экспрессии поздних активационных маркеров сохранялась до 14 дня культивирования . Было показано, что содержание маркера ранней активации CD69 в несколько раз увеличивалось на всех лимфоцитах и на NK-клетках на 3 день культивирования . Уровень экспрессии раннего активационного маркера CD38 после 5 дня культивирования всеми лимфоцитами возрастал в 2 раза, а Т-клетками в 3,5 раз . Количество всех активированных HLA-DR+ клеток к 6 дню увеличивалось в 2 раза . Экспрессия рецептора NKG2D лимфоцитами незначительно увеличилась на 10 день культивирования, а NK-клетками — практически не изменялась . Доля СD25 + -клеток максимально возрастала в 1,7 раз только к 14 дню . Таким образом, прослеживается волнообразное нарастание экспрессии активационных рецепторов, начиная от ранних маркеров и заканчивая более поздними Данное явление закономерно и подтверждено нами с использованием метода проточной цитометрии и мониторинга экспрессии маркеров активации на протяжении всего периода культивирования у больных ЗНАО и меланомой в среде № 1 и ПКР в среде № 2 .
Для получения чистой субпопуляции активированных NK-клеток из всех ЛАК-клеток после культивирования и активации in vitro было произведено выделение CD3УCD16+/CD56+-клеток с помощью магнитной сепарации и негативной селекции (рис . 3) . Доля NK-клеток в смеси культивированных лимфоцитов к 9 дню составляла в среднем 30±8% от всех ПМК . В результате сепарации мы получили очищенную субпопуляцию активированных NK-клеток, среди которых 98% имели фенотип CD3-/CD16+/ CD56+ NK-клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD38, CD69) и поздней активации (CD314, HLA-DR) . Данные клетки могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии онкологических заболеваний, а также для изучения функциональных особенностей цитотоксических NK-лимфоцитов .
Рис. 3. Активированные NK-клетки после магнитной сепарации на 9 сут. культивирования в среде Х^Ыо20 с добавлением ^-2 и 15. Ув. х400
Чтобы подтвердить факт активации лимфоцитов, который получили в результате изучения экспрессии маркеров активации, была проведена оценка цитотоксической активности лимфоцитов на 3 день культивирования . Показано, что специфический лизис клеток-мишеней К562 активированными лимфоцитами на 3 день культивирования в среде № 1 увеличился в среднем на 19% по сравнению с не активированными лимфоцитами (р<0,05) . Используя в качестве эффекторов лимфоциты, культивируемые 3 дня в среде № 2, было показано, что специфический лизис клеток-мишеней К562 увеличился в среднем на 28% по сравнению с не активированными лимфоцитами (р<0,05). Таким образом, было доказано, что функциональная активность цитоток-сических лимфоцитов повышается параллельно с увеличением поверхностной экспрессии маркеров активации; в среде № 2 эффекторная функция лимфоцитов выше, чем в среде № 1 Сравнивая пролиферативную активность, жизнеспособность и эффекторные свойства клеточной субпопуляции при культивировании в присутствии iL-2 или при комбинации цитокинов iL-2 и iL-15 для получения большего количества жизнеспособных и в большей степени активированных лимфоцитов целесообразно выбирать среду № 2
Заключение
В результате работы был отработан метод длительного культивирования лимфоцитов человека с использованием iL-2 и iL-15 . Показано, что лимфоциты хорошо пролиферируют и активируются in vitro Добавление цитокина iL-2 усиливает экспрессию активационных маркеров, начиная с 3 дня культивирования . Комбинация iL-2 с iL-15 в большей степени влияет на жизнеспособность и пролифера-
ЛИТЕРАТУРА:
I. Бережной А. Е ., Гнучев Н . В ., Георгиев Г . П . и др . Молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы . Вопр . онкол . 2008; 54(6): 669-83 .
2 . Абакушина Е . В ., Кузьмина Е . Г ., Коваленко Е . И . Основные свойства и функции NK-клеток человека . Иммунол . 2012; 33(4): 220-4
3 . Закеева И . Р ., Бережной А . Е ., Гнучев Н . В . и др . Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их роль в противоопухолевом иммунитете . Вопр . онкол . 2007; 53(2): 140-9 .
4 . Sabry M ., Lowdell M .W . Tumor-primed NK cells: waiting for the green light . Front . Immunol . 2013; 4(408): 1-7 .
5 . Shen Y . , Lu C ., Tian W . et al . Possible association of decreased NKG2D expression levels and suppression of the activity of natural killer cells in patients with colorectal cancer. int . J . Oncol . 2012; 40(4): 1285-90 .
6 . Курилин В . В ., Хантакова Ю . Н ., Облеухова И .А . и др . Стимуляция дендритными клетками in vitro противоопухолевой цитотоксиче-ской активности мононуклеарных клеток больных колоректальным раком . Мед. иммунол . 2013; 15(3): 235-46 .
7 . Нехаева Т . Л . Оптимизация аутологичных дендритно-клеточ-ных вакцин для лечения больных злокачественными новообразованиями . Сиб . онкол . журн . 2013; 57(3): 52-6 .
8 . Титов К . С ., Киселевский М . В ., Демидов Л . В . и др . Внутри-брюшинная биотерапия с использованием ИЛ-2 и донорских ЛАК-клеток при метестатических асцитах у больных раком яичников Росс . биотерапевт . журн . 2011; 10(2): 51-4 .
9 . Георгиев Г . П ., Ларин С . С ., Сащенко Л . П . и др . Вакцинотерапия опухолей модифицированными геном TAG7 опухолевыми клетками . Молекул . мед . 2008; 4: 1-9 .
10 . Cheng M ., Chen Y ., Xiao W . et al . NK cell-based immunotherapy for malignant diseases . Cell . Mol . immunol . 2013; 3(10): 1-23 .
II. Kimura H ., Yamaguchi Y . A phase iii randomized study of interleukin-2 lymphokine-activated killer cell immunotherapy combined with chemotherapy or radiotherapy after curative or noncurative resection of primary lung carcinoma . Cancer 1997; 80(1): 42-9 .
тивную активность лимфоцитов, особенно NK-клеток и Т-клеток. Также сочетание цитокинов планомерно увеличивает поверхностную экспрессию сначала маркеров ранней, а затем и поздней активации лимфоцитов . Данная панель маркеров может быть использована для оценки уровня активации лимфоцитов
В ходе исследования была подобрана панель маркеров активации лимфоцитов и налажен оригинальный метод культивирования лимфоцитов с использованием полной питательной среды, содержащей ростовые факторы (инсулин, трансферин) и цитокины (iL-2 и iL-15), которые обладают стимулирующим влиянием на пролиферацию и активацию цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток .
Проведённые нами исследования свидетельствуют о возможности использования более низких концентраций iL-2 в комбинации с iL-15 в питательной среде для активации лимфоцитов, что позволяет увеличить длительность их культивирования до 14 дней и не уменьшает их эффекторную функцию . Предложенный метод активации лимфоцитов человека даст возможность проводить адоптивную иммунотерапию в течение длительного периода времени без дополнительного забора крови. Он отличается упрощенным методом активации цитотоксических лимфоцитов в пластиковом флаконе без разделения ПМК на фракции и без использования антигенов опухолевых клеток Кроме того, благодаря оптимальной концентрации iL-2 и iL-15 в питательной среде и отсутствия опухолевых антигенов, использование полученных активированных клеток для иммунотерапии больных является безопасным
Полученные данные могут лечь в основу рекомендации использовать предложенный метод культивирования для длительной экспансии и активации лимфоцитов и их применения для иммунотерапии онкологических больных
12 . Todaro M ., Orlando V ., Cicero G . et al . Chemotherapy sensitizes colon cancer initiating cells to Vy9VS2 T cell-mediated cytotoxicity . PloS One . 2013; 6(8): 1-8 .
13 . Sangiolo D ., Martinuzzi E ., Todorovic M . et al . Alloreactivity and anti-tumor activity segregate within two distinct subsets of cytokine-induced killer (CiK) cells: implications for their infusion across major HLA barriers . int . immunol . 2008; 20(7): 841-8 .
14 . Boiardi A., Silvani A., Ruffini P .A. et al . Locoregional immunotherapy with recombinant interleukin-2 and adherent lymphokine-activated killer cells (A-LAK) in recurrent glioblastoma patients . Cancer immunol . immunother . 1994; 39(3): 193-7 .
15 . Wang F . S ., Liu M . X ., Zhang B . et al . Antitumor activities of human autologous cytokineinduced killer (CiK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo . World J . Gastroenterol . 2002; 8(3): 464-8
16 Литвинова Л С , Гуцол А А , Сохоневич Н А и др Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов Мед . иммунол . 2014; 16(1): 7-26 .
17 . Sandoval-Montes C . , Santos-Argumedo L . CD38 is expressed selectively during the activation of a subset of mature T-cells with redused proliferation but improved potential to produce cytokines . Leukocyte Biol . 2005; (77): 513-21.
18 . Clausen J ., Vergeiner B ., Enk M . et al . Functional significance of the activation-associated receptor CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells . immunobiol . 2003; 207(2): 85-93 .
19 . Чикилева И . О ., Анисимова Н . Ю ., Верескунова Н . В . и др .; ЗАО «БИОКАД» . Способ получения активированных лейкоцитов для адъювантной адаптивной иммунотерапии злокачественных новообразований . Патент РФ 2414915 . 27 . 03 . 2011.
20 Киселевский М В Адоптивная иммунотерапия при злокачественных новообразованиях . Вест . РАН . 2003; (1): 40-4 .
21. Koyama S . Augmented human-tumorocytolytic activity of peripheral blood lymphocytes and cells from a mixed lymphocyte/ tumor culture activated by interleukin-12 plus interleukin-2, and the phenotypic characterization of the cells in patients with advanced carcinoma . J . Cancer Res . Clin . Oncol . 1997; 123(9): 478-84 .
22 . Демидов Л . В . , Михайлова И . Н ., Синельников И . Е . и др . Проблемы клинического применения ИЛ-2/ЛАК-терапии . Росс . Биотерапевт. журн . 2005; 4(4): 29-37 .
23 . Яковлев В . Н ., Зыков Д . В ., Алексеев В . Г . и др .; Яковлев В . Н . Способ лечения больных раком легкого . Патент РФ 2500435 . 10 . 12 . 2013 .
24 . Киселевский М . В ., Анисимова Н . Ю . , Соснов А . В .; Российский онкологический научный центр им . Н . Н . Блохина РАМН . Способ получения активированных мононуклеарных лейкоцитов Патент РФ 2402338 . 27 . 10 . 2010 .
25 . Абакушина Е . В . Определение функциональной активности естественных киллеров человека методом проточной цитофлуори-метрии . Клинико-лаб . консил . 2011; 39(3): 17-25 .
26 . Абакушина Е . В . Влияние углеводов, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитолитическую активность естественных киллеров человека [диссертация]. Москва; РГМУ; 2002
27 . De Maria A., Bozzano F ., Cantoni C . et al . Revisiting human natural killer cell subset function revealed cytolytic CD56tdim)CD16 + NK cells as rapid producers of abundant IFN-gamma on activation . PNAS USA . 2011; (108): 728-32 .
28 . Lin S . J ., Lee P . T ., Kuo M . L . Cytokine activation of natural killer cells . Methods Mol . Biol . 2014; (1139): 223-9 .
29 . Rodella L ., Zamai L ., Rezzani R . et al . Interleukin 2 and interleukin 15 differentially predispose natural killer cells to apoptosis mediated by endothelial and tumour cells . Br. J . Haematol . 2001; 115(2): 442-50 .
30 . Naora H ., Gougeon M . Activation, survival and apoptosis of CD45R0+ and CD45R0- T cells of human immunodeficiency virus-infected individuals: effects of interleukin-15 and comparison with interleukin-2 . Immunology 1999; 97(2): 181-7 .
31. Litvinova L . S ., Sokhonevich N .A ., Gutsol A .A . et al . Influence of immunoregulatory cytokines (IL-2, IL-7 and IL-15) in vitro upon activation, proliferation and apoptosis of immune memory T-cells] . Tsitologiia 2013; 55(8): 566-71.
Поступила: 15.02.2015
