CC BY
5schiff-base ligands // Polyhedron. 2018. Т. 154. С. 65-76. DOI: 10.1016/j.poly.2018.07.034
УДК 619:616-006:98:578.828.11 DOI: 10.56660/77368 2023 7 100
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА
А. А. Шевченко - зав. кафедрой микробиологии, эпизоотологии и вирусологии, д-р вет. наук, профессор, ОЯСГО: 0000-0002-6537-2476, БРГЫ-
код: 6454-7621, АиШогГО: 156523
Н. И. Дмитрив - аспирант
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет
имени И.Т. Трубилина», г. Краснодар
О. Ю. Черных - главный научный сотрудник, д-р вет. наук, доцент, ОЯСГО: 0000-0001-8584-8251, БРШ-код: 3611-5160, АиШогГО: 473119
Л. В. Шевченко - д-р вет. наук, доцент, главный научный сотрудник, ОЯСГО: 0009-0002-8413-5959, БРШ-код: 1032-6123, АиШогГО: 144197
В. В. Чекрышева - директор, к.в.н., доцент, ОЯСГО: 0000-0002-2793-321Х,
БРШ-код: 5247-5424, АиШогГО: 810594
А. Е. Святогорова - младший научный сотрудник, к.с.-х.н., ОЯСГО: 00000003-4233-1740, БРШ-код: 2369-0027, АиШогГО: 719399
Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»
Аннотация. Представлены результаты по использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР) при лабораторной диагностике лейкоза у крупного рогатого скота в сравнительном аспекте при использовании иммуноферментного метода и реакции иммунодиффузии. В результате проведенных исследований доказана высокая эффективность ПЦР-диагностики при лабораторной диагностике лейкоза у крупного рогатого
скота. С помощью ПЦР можно выявлять с раннего возраста провирус лейкозной инфекции у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: животные, лейкоз, провирус, вспышка, крупный рогатый скот, вирус, инфекция, чувствительность, метод. THE EFFECTIVENESS OF PCR DIAGNOSIS OF BOVINE LEUKEMIA
A.A. Shevchenko - Head of the Department of Microbiology, Epizootology and Virology, Doctor of Veterinary Sciences, Professor, SPIN-code: 6454-7621,
AuthorlD: 156523
N. I. Dmitriv - PhD student
Federal state budgetary educational institution of higher education "Kuban State Agrarian University named after I.T. Trubilin", Krasnodar
O. Yu. Chernykh - Chief Researcher, Doctor of Veterinary Sciences, Associate Professor, SPIN-код: 3611-5160, AuthorlD: 473119
L. V. Shevchenko - Doctor of Veterinary Sciences, Associate Professor, Chief Researcher, SPIN-code: 1032-6123, AuthorlD: 144197
V. V. Chekrysheva - Director, candidate of veterinary sciences, Associate Professor, ORCID: 0000-0002-2793-321X, SPIN-code: 5247-5424, AuthorlD:
810594
A. E. Svyatogorova - junior researcher, Candidate of Agricultural Sciences, ORCID: 0000-0003-4233-1740, SPIN-code: 2369-0027, AuthorID: 719399
North-Caucasus Zonal Scientific Research Veterinary Institute» - Branch of the Federal State Budget Scientific Institution «Federal Rostov Agricultural Research
Centre»
Annotation. The results on the use of polymerase chain reaction (PCR) in the laboratory diagnosis of leukemia in cattle in a comparative aspect when using the enzyme immunoassay method and the immunodiffusion reaction are presented. As a result of the conducted studies, the high efficiency of PCR diagnostics in laboratory diagnosis of leukemia in cattle has been proven. With the help of PCR, it is possible to detect the provirus of leukemia infection in cattle from an early age.
101
Keywords: leukemia, animals, provirus, outbreaks, cattle, disease, sensitivity, virus, method.
Введение. Лейкоз крупного рогатого скота - вирусное инфекционное заболевание, проявляющееся скрытым хроническим течением, с формированием разрастаний и опухолей в лимфоидных и кроветворных органах, появлением необратимых патологических изменений и основных их функций.
Лейкозную инфекцию у крупного рогатого скота обнаруживают в Российской Федерации и различных зарубежных странах. Так, зараженность вирусом лейкоза ферм крупного рогатого скота в Соединенных Штатах Америки, Канаде и Японии составляет до 80%. Вместе с тем в тех странах, где полностью проводят работу по выполнению ветеринарных и санитарных правил при проведении профилактики и ликвидации лейкозной инфекции на фермах крупного рогатого скота, заболевание ликвидировали. По данным отечественных исследователей в отдельных регионах Российской Федерации, Белоруссии и других странах ближнего зарубежья довольно часто выявляют вирус лейкоза на фермах крупного рогатого скота. В некоторых зарубежных странах из-за отсутствия достоверных сведений по лейкозу эпизоотическая ситуация по лейкозной инфекции животноводческих ферм крупного рогатого скота остается неизвестной, так как некоторые из них не предоставляют достоверную информацию в Международное Эпизоотическое Бюро [1, 2, 3].
В 98% случаев регистрировали в хозяйствах республики Беларусь, до 80% в России в прошлом столетии лейкозную инфекцию у крупного рогатого скота. Диагностика на это заболевание была основана на результатах гематологического исследования.
После инфицирования вирусом лейкозной инфекции у этих животных вырабатывается определенная защита и образуются специфические антитела к структурным белкам возбудителя, которые в течение всей их жизни сохраняются в организме инфицированных. Поэтому для лабораторной
102
диагностики вируса лейкозной инфекции крупного рогатого скота чаще применяют методы серологических исследований (РДП, ИФА).
При лабораторной диагностике вируса лейкозной инфекции крупного рогатого скота в ветеринарных лабораториях чаще используют при серологическом исследовании реакцию иммунодиффузии, это позволило выявлять зараженных животных уже на первой стадии образования антител, а внедрение этого метода при оздоровлении животноводческих ферм крупного рогатого скота в различных хозяйствах разных групп возрастов животных (6, 12, 18 и 24 мес.) и последующего выделения РИД+ животных из этих групп, позволило в целом улучшить динамику по лейкозу.
На первоначальном этапе осуществления оздоровительных ветеринарно-санитарных мероприятий в стране каждый год выявляли и выводили из оборота путем убоя РИД+ животных на бойне более 45 000 зараженных вирусом лейкозной инфекции животных [4, 5, 6].
В Российской Федерации неблагополучными хозяйствами по лейкозной инфекции у крупного рогатого скота считаются животноводческие фермы с зараженностью от 0,2% до 25%. С учетом этого возможно эпизоотическое неблагополучие тенденцию к широкому распространению заболевания лейкозной инфекции у крупного рогатого скота, которая может причинить скотоводству страны значительные убытки.
При ранней диагностике лейкозной инфекции у крупного рогатого скота использование серологического метода (РИД) не всегда позволяет выявлять зараженных животных на ранних стадиях болезни (инкубационный период) при инфекционном процессе и в период образования антител.
Поэтому необходимо проводить исследования по совершенствованию лабораторной диагностики, ветеринарно-санитарных, профилактических мероприятий и оздоровлению животноводческих хозяйств от лейкозной инфекции крупного рогатого скота. Имеются неопровержимые научные данные исследователей по опасности для человека вирусной лейкозной инфекции животных. Поэтому имеется постоянно возможность
инфицирования людей через животноводческие продукты, полученных от зараженного крупного рогатого скота вирусом лейкозной инфекции. На организм человека негативно могут влиять вредные метаболиты (триптофан и другие вредные вещества), которые могут накапливаться у инфицированных животных в молоке и мясе. Использование зараженных животных вирусом лейкоза при производстве биологических препаратов.
В лабораторных условиях вирус лейкоза выращивают в различных перевиваемых и перевиваемых клеточных культуральных системах животных многих видов (свиней, овец, крыс, крупного рогатого скота, собак, обезьян, летучих мышей и человека). В организме животных вирус лейкоза связывается с лимфоцитами и пожизненно находиться в клетках инфицированного хозяина, связанный с геномом клетки в виде провируса, не проявляет вредного воздействия и не вызывает образования антител к вирусу. Такое состояние инфицированности животных выявляют только с помощью полимеразной цитоплазматической реакции (ПЦР) [7, 8, 9].
В инкубационном периоде у животных в течение от месяца до 6 лет вирус лейкозной инфекции выявляют в организме инфицированного крупного рогатого скота, в молозиве и молоке коров, в других различных истечениях, которые могут содержат лимфоциты. Чаще всего восприимчивые животные инфицируются вирусом лейкозной инфекции от больных животных зараженными лимфоцитами. В связи с этим для инфицирования крупного рогатого скота достаточно незначительное остаточное количество крови (0,0005 см3) от заболевшего животного. В таком малом количестве может находиться 2500 лимфоцитов, зараженных вирусом. Поэтому нахождение малого количества зараженных лимфоцитов, которое может остаться на различных используемых для манипуляций инструментах. Нарушение санитарных правил при выполнении различных манипуляций на животных (отбор крови, профилактические прививки, проведение татуировок, мечение, обрезка копыт, искусственное осеменение) инфицированных лейкозной инфекцией и здоровых животных служит риском для заражени
распространения инфекции. При лейкозе вирус у крупного рогатого скота могут распространять через доильные аппараты, используемые одновременно для инфицированных и здоровых коров, при попадании крови на кормушки, пол, при нарушении правил отбора крови, при ректальном обследовании и другие. Риск заражения вирусом лейкоза здоровых животных от больных может происходить при укусе членистоногих и кровососущих.
Поэтому в случае нахождения в стаде крупного рогатого скота хотя бы одного больного животного существует опасность инфицирования вирусом лейкоза здоровых животных.
Одним из главных источников распространения возбудителя лейкозной инфекции на ферме и в хозяйстве являются инфицированные вирусом быки-производители, которых используют на ферме для покрытия самок. В связи с этим в сперме вирус сохраняется долго, и она является фактором передачи возбудителя заболевания. В полученной сперме от самцов производителей и быков в инкубационном периоде до 6 лет вирус лейкоза не обнаруживается при отсутствии в полученной крови в объеме до 0,0005 мл и лимфоцитов. Вспышки лейкоза у рогатого скота наносят ущерб племенному скотоводству, служат угрозой для сохранения таких животных, ведения селекционной и племенной деятельности, обмен и продажа животных [10, 11, 12].
Поэтому необходимо проводить работу по совершенствованию лабораторных методов диагностики, разрабатывать новые способы профилактики и меры по ликвидации лейкозной инфекции в животноводческих хозяйствах, что позволит обеспечить эпизоотологическое благополучие и здоровье человека.
Материалы и методы исследований. Сравнительную эффективность лабораторных тестов при диагностике лейкозной инфекции у крупного рогатого скота осуществляли в ГБУ Краснодарского края «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория». При серологическом исследовании предварительно отбирали стабилизированную кровь и сыворотки крови по 100 проб от телят рогатого скота старше 12-месяцев, а также от телят старше
дневного возраста 128 проб крови из неблагополучных ферм по лейкозу рогатого скота ферм.
Для лабораторных исследований использовали методы диагностики: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), реакция иммунодифузии (РИД), конукрентный метод иммуноферментного анализа (ИФА).
Результаты исследований. Опытные образцы проб сыворотки крови использовали при постановке реакции иммунодиффузии, из других сборных проб сыворотки крови брали общий пул 1:10 и затем в каждом конкретном случае применяли при тестировании в ПЦР и методом иммуноферментного анализа.
В результате уставлено, что из тестированных сывороточных проб крови в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) выявляли 15 из 100 проб, в полимеразной цепной реакции (ПЦР) обнаруживали в 17 из 100 проб, а в реакции иммунодиффузии (РИД) 12 из 100 проб. Используемые методы лабораторной диагностики ПЦР и ИФА показали большую чувствительность. С помощью этих реакций можно обнаруживать инфицированных животных и выявлять животных, показавших отрицательные результаты в реакции иммунодиффузии.
Затем проводили тестирование в РИД сборных проб крови, взятых от 10 животных с включением по одной пробе заведомо положительной пробы и 9 проб с отрицательным результатом.
В последующем вносили в каждые 10 лунок панели по одной пробе в заведомо известную положительную пробу крови, но взятой с различной оптической плотностью от зараженных животных в разный стадийный период заболевания лейкозом крупного рогатого скота. Также вносили сыворотки крови в качестве положительной пробы с первой по седьмую лунки панели, взятых от заведомо реагировавших положительно животных в исследованных реакции иммунодиффузии, в реакции ПЦР и ИФА.
106
Затем вносили пробы крови от животного в восьмую лунку, которая в конкурентном методе ИФА и РИД дали отрицательный результат с оптической плотностью 50, которая работала положительно в ПЦР.
В дальнейшем в девятую и десятую лунки вносили кровь от животного, давшего положительный результат реакции в конукрентном методе ИФА и в РИД, имевшей положительный результат при постановке полимеразной цепной реакции с оптической плотностью ниже 50 и выше 50.
Таким образом при исследовании сыворотки крови в реакции ИФА с заведомо внесенной положительной пробой эффективность составила 2,58 -31,57 %.
В результате уставлено, что при исследовании 128 проб сыворотки крови от телят в возрасте 20 дней, полученных из неблагополучных хозяйств, реагирующих положительно в РИД, в реакции ПЦР выявлено 14,8%.
Зараженный крупный рогатый скот остается в стаде до проведения следующего этапа исследования. Согласно действующим «Ветеринарно-санитарным правилам» в благополучных по лейкозу фермах исследования проводят через 2 года, а в неблагополучных хозяйствах проводят исследования через 4 месяца. В результате может происходить заражение здоровых животных вирусом лейкоза и в дальнейшем привести к значительному распространению вируса среди восприимчивых животных. Согласно действующей «Инструкции по использованию набора для диагностических исследований методом ИФА» при исследовании составили объединенные средние пробы от 10 голов в одной лунке. В последние годы применяется иммуноферментный диагностический набор, в котором при тестировании объединенной одной пробы от 50 животных исследуют кровь или молоко. В результате это еще больше повышает возможность нахождения в благополучном стаде не обнаруженных зараженных животных. Данные таблицы 3 видно, что 14,8% молодняка 20 дневного возраста являются носителями провируса и это приводит к дальнейшему перезаражению.
Таким образом для снижения степени распространения вируса лейкозной инфекции у крупного рогатого скота надо внедрять в диагностическую схему лабораторных исследований диагностику с помощью ПЦР. В результате это позволит обнаруживать животных-носителей провируса лейкозной инфекции у крупного рогатого скота, а также молодняк в 5-месячном возрасте. Особенно важным будет применение диагностики с помощью ПЦР при массовом тестировании самцов-производителей, которые часто являются носителями провируса. Выводы
1. При сравнительном исследовании ПЦР, РИД и ИФА для диагностики лейкозной инфекции у крупного рогатого скота установлено, что ПЦР-диагностика является наибольшее чувствительной и эффективной.
2. Установлена низкая чувствительность ИФА не позволяющая выявлять всех зараженных животных вирусом лейкозной инфекции крупного рогатого на ферме.
3. ПЦР-диагностика на лейкозную инфекцию у крупного рогатого скота позволяет выявлять животных-носителей провируса лейкоза в раннем возрасте.
Литература
1. Белов, А. Д. О патогенезе лейкозов крупного рогатого скота / А. Д. Белов, Л. В. Рогожина, Г. В. Сноз // Ветеринария. - 1997. - Т. 2. - С. 16-20.
2. Возможности и ограничения использования ПЦР в диагностике и генотипировании вируса лейкоза крупного рогатого скота / В. А. Белявская [и др.] // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных: сборник трудов. - Ставрополь, 2003. - С. 275-278.
3. Галеев, Р. Ф. Диагностика и профилактика лейкоза КРС / Р. Ф. Галеев, А. А. Руденко, Ф. Р. Валиев // Практик. - 2003. - № 5/6. - С. 44-48.
108
4. Глазко, В. И. Современные направления использования ДНК-технологий / В. И. Глазко, Н. Н. Доманский, А. А. Созинов // Цитология и генетика. - 1998. - Т. 32, № 5. - С. 80-93.
5. Опыт ускоренного оздоровления племенного хозяйства от лейкоза / А. Г. Берзяк [и др.] // Ветеринария. - № 12. - 1990. - С. 13-15.
6. Применение серологических методов и ПЦР для обнаружения вируса лейкоза крупного рогатого скота в образцах крови, молока и носовых истечений / Н.Т. Джапаралиев [и др.] // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику: материалы конференции молодых ученых / Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных. -Владимир: ОКНИИиМС, 2000. - С.127-131.
7. Русинович, А. А. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота, меры борьбы и профилактики в Республике Беларусь: монография / А. А. Русинович. - Витебск: ВГАВМ, 2016. - 264 с.
8. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота: социально-экономическая значимость, диагностика, профилактика и ликвидация болезни / В. Максимович, И. Субботина, Н. Бабахина, Л. Кашпар // Ветеринарное дело.
- 2019. -№ 2. - С. 5-11.
9. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота: социально-экономическая значимость, диагностика, профилактика и ликвидация болезни / В. Максимович, И. Субботина, Н. Бабахина, Л. Кашпар // Ветеринарное дело.
- 2019. - № 3. - С. 4-9. - Окончание.
10. Эпизоотологическая оценка методов прижизненной диагностики лейкоза КРС / М. И. Гулюкин [и др.] // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - № 3. - С. 60-62.
11. Диагностика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных: вирусные заболевания / А.А. Шевченко, О.Ю. Черных, А.Я. Самуйленко [и др.] // Краснодар, КубГАУ. - 2018. - 485 с.
109
12. Experience of diagnostics and containment of foot and mouth disease of cattle in Krasnodar region, Russia. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, December. - 2017, Volume. - 5(6). - р. 786-792.
References
1. Belov, A.D. On the pathogenesis of leukemia in cattle / A.D. Belov, L. V. Rogozhina, G. V. Snoz // Veterinary medicine. - 1997. - Vol. 2. - pp. 16-20.
2. Possibilities and limitations of the use of PCR in the diagnosis and genotyping of the bovine leukemia virus / V. A. Belyavskaya [et al.] // Topical issues of zootechnical science and practice as a basis for improving the productive qualities and health of farm animals : proceedings. - Stavropol, 2003. - pp. 275-278.
3. Galeev, R. F. Diagnosis and prevention of leukemia of cattle / R. F. Galeev, A. A. Rudenko, F. R. Valiev // Praktik. - 2003. - No. 5/6. - pp. 44-48.
4. Glazko, V. I. Modern directions of using DNA technologies / V. I. Glazko, N. N. Domansky, A. A. Sozinov // Cytology and genetics. - 1998. - Vol. 32, No. 5. - pp. 80-93.
5. The experience of accelerated recovery of breeding farms from leukemia / A. G. Berzyak [et al.] // Veterinary medicine. - No. 12. - 1990. - pp. 1315.
6. Application of serological methods and PCR for detection of bovine leukemia virus in blood, milk and nasal discharge samples / N.T. Dzhaparaliev [et al.] // Achievements of young scientists - in veterinary practice : materials of the conference of Young Scientists / All-Russian Scientific Research Institute for Animal Protection. - Vladimir : OKNIIiMS, 2000. - pp.127-131.
7. Rusinovich, A. A. Enzootic leukemia of cattle, control and prevention measures in the Republic of Belarus : monograph / A. A. Rusinovich. - Vitebsk : VGAVM, 2016. - 264 p.
8. Enzootic leukemia of cattle: socio-economic significance, diagnosis, prevention and elimination of the disease / V. Maksimovich, I. Subbotina, N. Babakhina, L. Kashpar // Veterinary business. - 2019. - No. 2. - pp. 5-11.
110
9. Enzootic leukemia of cattle: socio-economic significance, diagnosis, prevention and elimination of the disease / V. Maksimovich, I. Subbotina, N. Babakhina, L. Kashpar // Veterinary business. - 2019. - No. 3. - pp. 4-9. - End.
10. Epizootological evaluation of methods of lifetime diagnosis of cattle leukemia / M. I. Gulyukin [et al.] // Bulletin of the Russian Academy of Agricultural Sciences. - 2000. - No. 3. - pp. 60-62.
11. 11. Diagnostics of infectious diseases of farm animals: viral diseases / A.A. Shevchenko, O.Yu. Chernykh, A.Ya. Samuilenko [et al.] // Krasnodar, KubGAU. - 2018. - 485 p.
12. Experience of diagnostics and containment of foot and mouth disease of cattle in Krasnodar region, Russia. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, December. - 2017, Volume. - 5(6). - р. 786-792.
УДК 378/636 DOI 10.56660/77368 2023 7 111
КАЧЕСТВО ВЕТЕРИНАРНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В ВЫСШИХ
УЧЕБНЫХ УЧРЕЖДЕНИЯХ
М.В. Гунько - младший научный сотрудник (аспирант). ОЯСГО 000-0003-0536-8288, Брт-код 9918-0841
Северо - Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»
Т.Н. Чумакова - кандидат педагогических наук, доцент.
Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования «Донской государственный аграрный университет», поселок Персиановский,
Ростовская область, Россия.
Аннотация. В данной статье мы раскроем основные причины снижения качества ветеринарного образования в высших образовательных учреждениях.
111
