CC BY
18© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
А.С.Борисенко, О.А.Свитич, Г.Г.Кривцов, В.Ф.Лавров, В.С.Попова, Т.М.Парфенова
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛИКАТИОННЫХ НАНОЧАСТИЦ ПОЛИЭТИЛЕНИМИН-ПОЛИГИДРОЗИД-ХИТОЗАНА (ПЭИ-ПГ-ОХГ) В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА ДЛЯ КОРОТКИХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК, НАПРАВЛЕННЫХ НА ПОДАВЛЕНИЕ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 2 ТИПА
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Оценка противовирусного действия миРНК в составе наночастиц поликати-онного соединения к мРНК белка vp16 (генUL48) вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) in vitro. Материалы и методы. Использованы: 50% водный раствор поиэтиле-нимина (BDH, Великобритания), хитозан, содержащий около 15% N-ацетилированных глюкозаминовых звеньев (Сонат, Россия), гидразин-гидрат и другие химические реактивы (Химмед, Россия); перевиваемая линия клеток Vero, штамм MS ВПГ-2. Клетки Vero культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°C в атмосфере с 5% СО2. Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью витального красителя Neutral Red и МТТ-теста. Праймеры и зонды для ПЦР-РВ были моделированы в компьютерной программе Vector NTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК исследуемых генов (последовательности мРНК взяты в GenBank) и синтезированы в фирме Синтол (РФ). РТ ПЦР-тесты ставили с использованием стандартной процедуры. Синтез комплексов ПЕИ-ПГ-хитозан осуществляли по Кривцову Г.Г. и др. (2010). Результаты. Для изучения влияния киРНК на репликацию ВПГ-2 был осуществлен дизайн и синтез нуклеотидных последовательностей, обладающих интерферирующей активностью по отношению к этому вирусу. При одновременном добавлении к клеткам Vero ВПГ-2 и специфических киРНК в культуре клеток наблюдали значительное (на 4 lg) снижение урожая вируса. Был определен уровень экспрессии мРНК UL48 после воздействия различных вариантов киРНК. Показано, что наиболее выраженный вирусингибирующий эффект вызывал вариант S2 киРНК, нацеленный на центр РНК-мишени (уровень экспрессии исследуемого гена снижался на 0,5 lg). Заключение. Установлено, что киРНК в составе комплексов ПЕИ-ПГ-хитозан обладают in vitro выраженной подавляющей репликацию ВПГ-2 активностью. Полученные результаты могут быть использованы при создании новых терапевтических препаратов против герпесвирусов.
Журн. микробиол., 2015, № 3, С. 31—37
Ключевые слова: короткие интерферирующие РНК, противовирусное действие, вирус простого герпеса 2 типа, поликатионные соединения
A.S.Borisenko, O.A.Svitich, G.G.Krivtsov, V.F.Lavrov, V.S.Popova, T.M.Parfenova
EFFECTIVENESS OF POLYCATIONIC NANOPARTICLES OF POLYETHYLENEIMINE-POLYHYDROZIDE-CHITOSAN (PEI-PG-OCHG) AS A VECTOR FOR SMALL INTERFERING RNA, DIRECTED TO SUPPRESS HERPES SIMPLEX TYPE 2 VIRUS REPLICATION
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Evaluation of an antiviral effect of miRNA in the nanoparticles of a polycationic compound against mRNA of vp16 protein (UL48 gene) of herpes simplex virus type 2 (HSV-2) in vitro. Materials and methods. 50% aqueous solution of polyethyleneimine (BDH, Great Britain), chitosan, containing approximately 15% of N-acetylated glucosamine chains (Sonat, Russia), hydrazine-hydrate and other chemical reagents (Chimmed, Russia); Vero continuous cell line, MS HSV-2 virus were used. Vero cells were cultivated in DMEM medium supplemented by 10% fetal bovine serum at 37°C in the atmosphere of 5% CO2. Cell viability was evaluated by using Neutral Red vital stain and MTT-test. Primers and probes for RT-PCR were modeled in Vector
NTI 8.0 computer program according to the mRNA sequences of the studied genes (the sequences were obtained from GenBank) and synthesized in Sintol (Russia). RT-PCR tests were set using a standard procedure. Synthesis of PEI-PG-chitosan was carried out by Krivtsov G.G. et al. (2010). Results. A design and synthesis of nucleotide sequences, that have interfering activity against this virus, was carried out to study the effect of siRNA on HSV-2 virus replication. During simultaneous addition of HSV-2 and specific siRNA to Vero cells in cell culture, a significant (by 4 lg) reduction of virus yield was observed. A level of UL48 mRNA expression level was determined after the influence of various siRNA variants. A S2 siRNA variant was shown to cause the most pronounced virus-inhibiting effect, aiming for the center of RNA-target (the level of expression of the studied gene decreased by 0.5 lg). Conclusion. siRNA in the PEI-PG-chitosan complexes were established to possess in vitro pronounced suppressive HSV-2 replication activity. The results obtained could be used in creation of new therapeutic preparation against herpes viruses.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 3, P. 31-37
Key words: small interfering RNA, antiviral effect, herpes simplex virus type 2, polycationic compounds
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы активно разрабатывается принципиально новый генно-терапевтический подход к лечению и профилактике вирусных инфекций, в основе которого лежит использование комплементарно адресованных полинуклеотидов (КАП). К данному типу соединений традиционно относят антисмысловые РНК, ДНК, рибозимы и другие соединения. Открытие Э. Файром и К. Мелло [9] явления РНК-интерференции, т.е. биологического механизма управления активностью генов посредством коротких двухцепочечных РНК и специальных белковых комплексов, вызывающих селективную деградацию определенных мРНК или подавление трансляции многих мРНК в клетке, привело к появлению нового класса КАП — малых интерферирующих РНК. На основе описанного исследователями механизма были разработаны методы направленного подавления активности генов с помощью коротких синтетических РНК-дуплексов, которые могут быть созданы против любой мРНК благодаря тому, что последовательность генома многих макроорганизмов, включая человека, уже известна [10]. В настоящее время активно изучаются перспективы применения РНК-интерференции в медицине с целью лечения заболеваний различной этиологии, включая инфекционные, онкологические и др. [8, 12, 16].
Известно, что репликация значительного числа вирусных агентов, в том числе, вирусов герпеса человека, может подавляться с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК). Герпесвирусные болезни представляют собой серьезную медико-социальную проблему, являясь одними из наиболее распространенных инфекций человека с множественной симптоматикой. Для заболеваний, вызываемых вирусом простого герпеса (ВПГ), характерно пожизненная персистенция возбудителя в латентном состоянии в организме хозяина. При этом, эпизодически, инфекционный процесс приобретает активную форму, поражая различные органы и системы [2, 4]. Характерным для герпесвирусных инфекций является также атипичное течение и развитие вторичного иммунодефицита. При лечении больных герпетической инфекцией основная задача состоит в применении эффективного терапевтического подхода, направленного, в первую очередь, на увеличение срока ремиссии болезни [5]. Исход заболевания, вызванного ВПГ, во многом зависит от реальных возможностей организма противодействовать вирусу с помощью иммунных механизмов, подавляя процессы репликации и реактивации вируса.
При попытках использования генной терапии вирусных инфекций при моделировании in vitro, и особенно in vivo, возникает одна существенная проблема, которую
принято называть «проблема доставки КАП». Дело в том, что нуклеиновые кислоты (НК) обладают отрицательным зарядом, поверхность клеток также несет избыточный отрицательный заряд, поэтому пассивное проникновение НК в клетку-мишень очень затруднительно. Кроме того, НК нуждаются в защите от повреждения нуклеазами. Поэтому одновременно с развитием технологии КАП идет процесс создания для НК различных типов носителей [11].
Ранее нами были синтезированы производные полиэтиленимина, содержащие ацилгидразидные боковые группы (ПЭИ-ПГ). При этом было показано, что молекулы ПЭИ-ПГ образуют с плазмидной ДНК наночастицы, способные эффективно трансфицировать различные клетки млекопитающих in vitro. Было установлено, что молекулы «модельного лиганда» — N-сукцинилированного ограниченно деполиме-ризованного хитозана, содержащие альдегидную группу, способны ковалентно связываться с наночастицами ДНК-ПЭИ-ПГ, при этом эффективность трансфекции in vitro значительно возрастает [3].
Целью работы была оценка противовирусного действия миРНК в составе нано-частиц ПЭИ-ПГ-ОХГ к мРНК белка vp16 (ген UL48) ВПГ-2 in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали: 50% водный поиэтиленимин (BDH, Великобритания), хитозан (Сонат, РФ), содержащий около 15% N-ацетилированных глюкозаминовых звеньев, гидразин-гидрат и другие химические реактивы (Химмед, РФ), а также перевиваемую линию клеток Vero и вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS) из коллекции вирусов лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИВС им. И.И. Мечникова.
К монослою клеток Vero во флаконах (Greiner, Германия) добавляли 1 мл раствора трипсин-версена (1:1). Инкубацию проводили при 37°С в течении 10 минут. Затем во все флаконы добавляли по 2 мл полной культуральной среды DMEM c 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки и с помощью автоматической пипетки доводили суспензию клеток до образования гомогенной клеточной взвеси. Далее к % содержимого флакона добавляли 3/4 полной культуральной среды и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Пересев клеток в культуре Vero проводили каждые 3 — 4 дня.
100 мкл (0,5х106 кл./мл) взвеси клеток из одного флакона вносили в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета, который затем инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 ч. Монослой клеток Vero в лунках планшета однократно отмывали средой Игла, далее в каждую из лунок добавляли по 180 мкл среды DMEM. В первый ряд лунок планшета вносили по 200 мкл исходной вируссодержа-щей жидкости. В следующие ряды лунок вносили по 20 мкл жидкости из ранее заполненных лунок. Инкубацию проводили при 37°С в атмосфере 5% СО2.
Краситель Neutral Red (NR) (3,33 г/л) разбавляли в 3 раза (до конечного объема 1,11мг/мл). На 5 сутки после заражения клеток в каждую лунку, предварительно удалив из них культуральную среду, добавляли по 50 мкл раствора красителя. Далее планшет инкубировали в течение 2 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. После инкубации монослой клеток трижды отмывали средой Игла. В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора (50% EtOH/50%. 01М NH4H2PO4, pH = 3,5) и через 30 минут инкубации оценивали результат с помощью спектрофотометра при длине волны 490 нм.
МТТ-тестирование проводили, используя модифицированную методику, описанную Niks M. и Otto M [6]. В каждую лунку с монослоем клеток вносили по 50 мкл раствора МТТ (1,5 мг/мл) и инкубировали в течении 2 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем монослой клеток трижды отмывали средой Игла от красителя. В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора ДМСО и через 15 мин инкубации оценивали результат на спектрофотометре при длине волны 490 нм.
Праймеры и зонды для ПЦР-РВ были моделированы в компьютерной программе Vector NTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК исследуемых генов (по-
3. ЖМЭИ 3 № 13-2015
33
следовательности мРНК были Таблица 1. Последовательности праймеров, использован-взяты в GenBank) и синтезиро- в работе
ваны в фирме Синтол (РФ) (табл. —г
1). Для приготовления ПЦР-смеси —
Праймер
5'-3' последовательность
Длина
в реакциях использовали Hot Start UL48 Ulf CCC-ACC-CTG-CCC-GCC-AC 22 Taq DNA Polymerase (СибЭнзим, Ulr TTA-GCT-CCC-GCA-GTC-GCC 22
РФ). Для определения экспрессии
гена актина помимо имеющейся системы использовали «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК ß-актина человека» (Синтол, РФ).
Программное обеспечение прибора АНК-32 позволило получить данные по пороговому циклу. Далее с использованием калибровочных прямых получали сведения о количестве копий РНК.
Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов, рассчитывая среднее арифметическое (Х), Х=х1/и; дисперсию (2), 2=(хьХ)2/п; среднее квадратичное отклонение (х), х=(хьХ)2/п, где х1 — значение варианта, n — число экспериментов.
Применяли также компьютерную статистическую программу BioStat и программу Excel. В связи с разным числом наблюдений в каждой из групп для оценки статистической достоверности различий экспрессии генов в исследуемых группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [13].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Для оценки эффективности препарата ПЭИ-ПГ-ОХГ мы проводились эксперименты по определению противовирусного действия миРНК к мРНК гена UL48 ВПГ-2 (штамм MS) в культуре клеток Vero.
С помощью программы Dramacon Co. были подобраны возможные варианты миРНК к последовательности транскрипта гена UL48 ВПГ-2 и синтезированы три варианта миРНК: SRI, SR2, SR3. Последовательности компонентов конструктов представлены в табл. 2.
Известно, что для исследования противовирусного действия различных препаратов часто используют культуру клеток Vero. При этом препараты могут вызывать в культуре цитотоксический эффект. Существует возможность визуального отличия цитотоксического действия препарата от цитопатического действия вируса, в наших исследованиях было решено исключить цитотоксический эффект препарата.
Коллектив авторов предпринял попытку разработки нового подхода для создания универсальных носителей, в которых была бы предусмотрена возможность присоединения необходимых лигандов после получения компактизованных комплексов с ДНК. Было продемонстрировано, что препарат ПЭИ-ПГ-ОХГ отвечает поставленной задаче. Мы провели эксперименты, целью которых была оценка противовирусного действия миRNA к мРНК гена UL48 ВПГ-2 в культуре клеток Vero. С помощью программы Dramacon Co были подобраны возможные варианты миRNA к последовательности гена UL48 ВПГ-2. В дальней-Таблица 2. Последовательность компонентов кон- шем синтезированы три варианта структов миRNA: SRI, SR2, SR3.
В экспериментах по определе-
нию цитотоксичности как комплек-SR-1 5'-uu CUGCAUC UAUACCUCUU dTdT-3' сов, так и отдельных компонентов
было показано, что используемые
Вариант миРНК
Нуклеотидная последовательность
3'-dTdTAAGACGUAGAUAUGGAGAA-5' SR-2 5'-GAGUUUGAACAGAUGUUUA dTdT-3'
3'-dTdTCUCAAACUUGUCUACAAAU-5' SR-3 5'-UGUUGGUCGACGAUCUGUU dTdT-3'
3'-dTdTACAACCAGCUGCUAGACAA-5' миРНК (10 и 40 нг) не оказывают
разведения препарата ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:1000, 1:500, 1:100) и 3 варианта
токсического действия на клетки Vero в культуре. При использовании комплексов ПЭИ-ПГ-ОХГ в соотношении 1:1000 и 1:500 совместно с миРНК цитотоксиче-ского действия также не было выявлено. Исследования комплексов с содержанием ПЭИ-ПГ-ОХГ в соотношении 1:100 с миРНК показало, что цито-токсической активностью обладают комплексы ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:100)^RNA(40 нг).
В дальнейших экспериментах выбранные дозы комплексов были использованы для определения противовирусного действия препаратов.
При исследовании цитотоксичности комплексов с содержанием ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:100) с миRNA лишенными токсичности оказались комплексы ПЭИ-ПГ-ОХГ (1:100)/ миRNA (10 нг), которые также тестировались в культуре клеток Vero на наличие противовирусной активности. В культуральной жидкости (лунки с ВПГ-2, 0,01ТЦД50/кл.) определялся титр вируса — «вирусное потомство». Схема эксперимента представлена на рис. 1.
Логарифм титра ВПГ-2 в контроле составил 5,5 ТЦД50/0,1мл. Титр «вирусного потомства» в контрольных образцах (контроль S1, S2, S3 конструктов, контроль poly) статистически не отличался от контроля вируса, логарифм титра находился в пределах 4,5 — 5,5 ТЦД50/0,1 мл. В опытных образцах с концентрацией конструкций 20 нг/ лунку титр вновь продуцируемого вируса определялся в диапазоне 3,0 — 5,34 ТЦД50/ 0,1 мл. Наиболее выраженный противовирусный эффект был выявлен у конструкции S2.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что конструкции миRNA к вирусному гену UL48 эффективны и обладают выраженным противовирусным действием, которое выражается в снижении титра «вирусного потомства», более чем в 100 раз относительно контроля. Наиболее значительным противовирусным действием обладал конструкт S2, мишень которого была расположена в центре мРНК вирусного белка VP-16 .
Противовирусное действие миРНК основано на деградации мРНК UL48 c помощью интерферирующей РНК. В данной работе помимо противовирусного действия
была изучена экспрессия мРНК UL48 под воздействием различных вариантов миRNA (S1, S2, S3) (рис. 2). Наиболее выраженным блокирующим действием обладал вариант S2 (уровень экспрессии исследуемого гена снижался в 45 раз).
На основании полученных данных можно предполагать, что вариант S2 миРНК, который связывается с центральной областью молекулы мРНК гена UL48, обладает максимально выраженной противовирусной активностью и может в дальнейшем быть использован для определения противовирусного действия. Также следует отметить, что предранний
BÍF-Z
HÜJmiuihküu
t *
VESO ............* кжю- WEHÍJ действие Srtf'í
1, |
Ощчвютеичп нимуйа НГЗГ-2 я культурjпи-ой
Рис. 1. Схема эксперимента по определению противовирусного действия препаратов ПЭИ-ПГ-ОХГ/миРНК.
Вао*н>™ 4 ныд
Рис. 2. Снижение уровня экспрессии гена ^48 при действии миRNA.
Значения достоверно отличаются от контроля ^<0,05).
белок VP16 играет значительную роль в процессе репродукции вируса в клетке (с помощью данного белка происходит транскрипция генов вирусных ферментов) [14].
ОБСУЖДЕНИЕ
Несмотря на определенные успехи, достигнутые в последние годы в лечении и профилактике вирусных инфекций, поиски новых подходов к борьбе с вирусными заболеваниями по-прежнему весьма актуальны. К числу таких подходов, несомненно, относятся технологии создания искусственного противовирусного иммунитета и генной терапии с помощью комплементарно адресованных полинуклеотидов. Ранее основными представителями КАП являлись антисмысловые РНК (асРНК), рибози-мы и антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды (асОДН). Однако в последние годы внимание разработчиков КАП все более сосредоточивается на малых интерферирующих РНК (миРНК) как наиболее прецизионных и мощных противовирусных агентах [17]. Тем не менее, по-прежнему остается актуальной проблема доставки КАП в клетки и ткани-мишени, где разворачиваются основные события репликации вирусов. Для доставки молекул экзогенных нуклеиновых кислот или генов в клетки используются носители (векторы), которые можно разделить на векторы вирусной и невирусной природы. Вирусные векторы обладают высокой эффективностью переноса генов, однако существуют различные, часто неизвестные аспекты безопасности, включающие патогенность, иммуногенность и цитотоксичность. В связи с этим, основное внимание уделяется разработке более безопасных не вирусных векторов. К числу последних относятся различные липидные структуры, в том числе липосомы, катионные липиды и др., которые наряду с относительно высокой трансфицирующей активностью обладают и характерными недостатками — физико-химической нестабильностью, техническими сложностями при хранении и применении. Значительно больший интерес вызывают разработки поликатионных соединений. В 1995 г. Boussif O. et al. [7] удалось достигнуть эффективной трансфекции клеток мышиных фибро-бластов линии 3Т3 и клеток почек обезьян НерG2 с помощью комплексов ДНК с полиэтиленимином (ПЭИ). Известно, что ПЭИ содержит первичные, вторичные и третичные аминогруппы, поэтому нами было принято решение синтезировать препараты хитозана, содержащие N-этил- и N-диметиламиногруппы с целью усиления ионного взаимодействия между хитозаном и ДНК и повышения эффективности трансфекции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что как модифицированный хитозан (mCHIT), так и ПЭИ трансфицируют адгерентные клеточные линии примерно с одинаковой и достаточно высокой эффективностью [1]. Поэтому нами были созданы молекулярные комплексы, содержащие полэтиленимин, с которым через ацил-гидразидные мостики ассоциирован хитозан. Эти комплексы способны компактно связывать ДНК и представляют собой наночастицы, обеспечивающие высокоэффективную трансфекцию клеток млекопитающих различного тканевого генеза [3]. Этот молекулярный комплекс использовался нами как для изучения возможности доставки миРНК в клетки Vero, пермиссивные для вируса простого герпеса 2 типа, так и изучения противовирусного действия миРНК в составе наночастиц ПЭИ-ПГ-ОХГ к мРНК белка vp16 (ген^48) ВПГ-2 in vitro.
Ген UL48, точнее кодируемая им мРНК белка vp16 ВПГ-2, была выбрана в качестве мишени для миРНК не случайно. Этот вирусный белок играет важную роль в процессе репликации и формировании тегумента ВПГ-2.
Ранее Palliser D. et al. [15] удалось показать выраженный протективный противовирусный эффект с помощью миРНК-содержащих микрочастиц. Интравагинальное введение самкам мышей зараженных ВПГ-2, смеси миРНК против генов UL27 и UL29 (кодирующих соответственно поверхностный гликопротеид и ДНК-связывающий белок) с липидами предотвращало гибель мышей от генитальной
ВПГ-2 инфекции. В нашей работе мы впервые использовали для изучения противовирусного действия в качестве носителя поликатионное соединение ПЭИ-ПГ-ОХГ, содержащее миРНК к мРНК белка vp16 (гениЬ48) ВПГ-2. Полученные результаты могут быть использованы при создании новых терапевтических препаратов против герпесвирусов.
Л ИТЕРАТУРА
1. Борисенко А.С., Кривцов Г.Г., Жданов Р.И. Новый трансфекционный агент (модифицированный хитозан) для эффективного переноса генов в клетки крови человека. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2011, 2: 47-50.
2. Кицак В.Я. Вирусные инфекции беременных: патология плода и новорожденных. Кольцово, 2005.
3. Кривцов Г.Г., Файзулоев Е.Б., Лотте В.Д. и др.. Комплексы для трансфекции клеток млекопитающих, позволяющие присоединять лиганды после образования наночастиц. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2010, 7: 47-52.
4. Львов Д.К. Медицинская вирусология. 2008.
5. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей. М., Боргес, 2001.
6. Шпакова А. П., Павлова К. С., Булычева Т. И. МТТ-колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток. Клин. лаб. диагн. 2000, 2: 20-23.
7. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A. et al. A versatile vector for gene and оligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. PNAS. 1995, 92 (16): 7297-7301.
8. Bratkovic T., Glavan G., Strukelj B., Rogelj B. Exploiting microRNAs for cell engineering and therapy. Biotechnol. Adv. 2012, 30 (3): 753-765.
9. Fire A., Xu S., Montgomery M.K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998, 391: 806-811.
10. Jackson A.L., Burchard J., Schelter J. et al. Widespread siRNA «off-target» transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA. 2006,12(7):1179-1187.
11. Katakowski J.A., Palliser D. Optimizing siRNA delivery to the genital mucosa. Discov. Med. 2011, 11 (57): 124-132.
12. Liu J.F., Guan C.P., Tang X., Xu A.E. Study on the inhibition effect of siRNA on herpes simplex virus type 2 ICP4 gene. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. 2010, 24 (3): 199-201.
13. Mann H. B., Whitney D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. Annals of Mathematical Statistics. 1947, 18: 50-60.
14. Oh S. et al. Autophagy evasion in herpesviral latency. Autophagy. 2010, 6 (1): 151-152.
15. Palliser D., Chowdhury D., Wang Q.Y et al. An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection. Nature. 2006, 439 (7072): 89-94.
16. Qing G., Weili W, Fanqin Z. et al. Research of UL54-specific siRNA on herpes simplex virus type II replication. Int. J. Dermatol. 2011, 50 (3): 3626.
17. Sieberts S.K., Schadt E.E. Moving toward a system genetics view of disease. Mamm. Genome. 2007, 18 (6-7): 389-401.
Поступила 17.06.14
Контактная информация: Борисевич А.С.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-49-00
