CC BY
10
УДК: 615.22 Код специальности ВАК: 14.03.06
ЭФФЕКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ СОЕДИНЕНИЙ 2-АМИНОЭТАНСУЛЬФОНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ НЕОБРАТИМОЙ ОККЛЮЗИИ СРЕДНЕЙ МОЗГОВОЙ АРТЕРИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Е. В. Семелева, И. А. Громова, Д. С. Блинов, М. М. Гераськина, А. В. Новиков, Е. В. Блинова, Ю. С. Крайнова, Л. В. Ванькова
ФГБОУ ВО «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва», Медицинский институт, г. Саранск
Блинова Екатерина Валериевна - e-mail: bev-saransk@yandex.ru
Цель: изучение влияния новых соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты на динамику концентрации глутаминовой кислоты, а также течение ишемии головного мозга в эксперименте. Материалы и методы. В опытах на крысах-самцах весом 350-400 г с односторонней необратимой окклюзией левой средней мозговой артерии изучили влияние соединений 2-аминоэтансуль-фоновой кислоты ЛХТ-317 и ЛБК-527 в виде субстанций на динамику концентрации глутаминовой кислоты в плазме крови флюориметрическим методом, неврологического дефицита, а также объем поражения головного мозга индикаторным методом. Результаты и их обсуждение. Внутривенное введение 12 мг/кг ЛХТ-317 и 25 мг/кг ЛБК-527 снижает концентрацию глутаминовой кислоты в крови в течение первых двух часов после формирования мозговой ишемии. Введение соединений в профилактическом режиме приводит к формированию более мягкого неврологического дефицита, чем в контроле. При этом следует обратить внимание, что в серии животных, получавших ЛБК-527 в дозе 25 мг/кг, отмечалось достоверное снижение тяжести неврологических нарушений при сравнении с ЛХТ-317, сопоставимое с препаратом сравнения нимодипином. На фоне введения обоих веществ отмечалась положительная динамика симптомов к 14-м суткам наблюдения. На фоне соединений объем мозгового некроза уменьшался, при этом соединение ЛБК-527 было более эффективным.
Ключевые слова: необратимая окклюзия, средняя мозговая артерия, ишемия, глутаминовая кислота, неврологический дефицит, соединения 2-аминоэтансульфоновой кислоты.
Purpose of the study is to study the effect of new compounds of 2-aminoethanesulfonic acid on the dynamics of glutamic acid concentration, as well as the development of cerebral ischemia in the experiment. Materials and methods. In experiments in male rats 350-400 g with unilateral irreversible occlusion of the left medial cerebral artery, the effect of 2-aminoethanesulfonic acid compounds LHT-317 and LBK-527 as substances on the dynamics of glutamic acid concentration in blood plasma by fluorimetric method, neurological deficit, as well as the extent of brain damage by the method of different stainig. Results and discussion. Intravenous injection of 12 mg/kg LHT-317 and 25 mg/kg LBK-527 reduces the concentration of glutamic acid in the blood during the first 2 hours after the formation of cerebral ischemia. The introduction of compounds in the preventive regimen leads to the formation of a milder neurological deficit than in the control. In this case, it should be noted that in a series of animals treated with LBK-527 at a dose of 25 mg/kg there was a significant decrease in the severity of neurologic disorders when compared with LHT-317 and nimodipine. After both substances introduction there was a positive dynamic of symptoms by the 14th day of observation. Iv administration of the compounds decreases cerebral necrosis volume, while the LBK-527 compound was more effective.
Key words: irreversible occlusion, medial cerebral artery, ischemia, glutamic acid, neurological deficit, and 2-aminoaethansulfonic acid compounds.
Введение
Сосудистые катастрофы головного мозга, травматическое повреждение ЦНС, дегенеративно-дистрофические процессы сохраняют лидирующие позиции по уровню заболеваемости и прогностической значимости в популяции молодых людей и лиц пожилого и старческого возраста [1-3]. До настоящего времени не разработано эффективных консервативных методов лечения и профилактики указанных серьезных заболеваний. Вместе с тем установлена прямая зависимость между уровнем глутаминовой кислоты в экстрацеллюлярной жидкости тканей головного мозга и инсультом, менингитом, травматическим поражением головного мозга, а также хроническими патологическими процессами ЦНС, такими как ВИЧ-ассоциированная деменция, боковой амиотрофический склероз и др. [4-7]. При всех указанных патологиях предотвращение роста концентрации глутаминовой кислоты в мозгу позволяет
Дата поступления 19.03.2018
улучшать последствия указанных патологий как у людей, так и в экспериментах на животных [4, 7].
Цель настоящего исследования: изучение влияния новых соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты на динамику концентрации глутаминовой кислоты, а также течение ишемии головного мозга в эксперименте.
Материалы и методы
Исследование проведено с соблюдением требований приказа Минздрава России № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», основываясь на принципах гуманного обращения с подопытными животными. Протоколы лабораторных экспериментов прошли этическую экспертизу на заседании Локального этического комитета Медицинского института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва» (21 октября 2017 года, протокол № 10). Объектом исследования являлись соединения
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
2-аминоэтансульфоновой кислоты с лабораторным шифром ЛБК-527 (магния бис-ацетаминоэтансульфонат) и ЛХТ-317 (2-ацетаминоэтансульфонат диметилфенилацетамида), синтезированные в АО «ВНЦ БАВ» (Россия) в виде субстанции. В качестве препарата сравнения использовали блока-тор кальциевых каналов из группы производных дигидропи-ридина нимодипин («Нимотоп», раствор для инфузий 10 мг в 50 мл, Bayer, Германия), обладающий высокой церебро-протекторной активностью в эксперименте и клинике [8, 9].
Фокальную необратимую ишемию головного мозга моделировали у нелинейных белых крыс-самцов весом 350-400 г, наркотизированных уретаном в дозе 400 мг/кг внутривенно с помощью перевязки левой средней мозговой артерии по методике, описанной Bederson et al. [10]. В экспериментах были использованы этиконовые нити (США), оперативное пособие осуществлялось на подогреваемых платформах во избежание гипотермии. Ложноопе-рированным животным проводилось хирургическое пособие без перевязки артерии. Послеоперационное содержание животных осуществляли в помещении с поддерживаемой температурой окружающей среды в диапазоне 24...28°С Введение ЛБК-527, ЛХТ-317, а также препарата сравнения осуществляли внутривенно, через установленный в хвостовую артерию катетер G24, при помощи электронного программируемого двухканального инжектора производства «Kent Scientific» (США) за 15 мин до окклюзии мозговой артерии в дозах, составляющих 5% от показателя ЛД50 при данном пути введения: 25 мг/кг, 12 мг/кг и 1,5 мг/кг соответственно. Образцы крови для определения плазменного уровня глутаминовой кислоты забирали через венозный катетер, установленный в хвостовую вену и фиксированный на спине животного перед воспроизведением патологического процесса, а также через 1, 2 и 3 часа после окклюзии артерии в объеме 0,2 мл, восполняемом внутривенным введением 0,9% физиологического раствора хлорида натрия. Морфологическое определение размеров зоны некроза головного мозга проводили через семь суток (по шесть животных в группе) и через 14 суток (по шесть животных в группе) после постановки эксперимента. Определение концентрации глутаминовой кислоты в образце крови проводили флюориметрическим методом по Graham и Aprison [11] на фотометре «Emilite1201» (США) при длине волны активации 350 нм и длине волны регистрации 460 нм. Оценку степени поражения головного мозга проводили индикаторным методом. Срезы головного мозга (ипсила-терального полушария) окрашивали трифенилтетразоли-ем хлоридом («Sigma-Aldrich», Германия) в фосфатном
буфере. В дальнейшем срезы головного мозга крыс фотографировали цветной видеокамерой CCD IRIS (модель DXC-107AP, SONY, Япония), соединенной с микроскопом (Olympus SZ-CTV, Япония). Каждый срез мозга обрабатывался автоматически с помощью программы «Image J» (США). Для расчета объема некроза использовали формулу, учитывающую вклад отека мозга в размер очага поражения. Оценку неврологического дефицита проводили по 8-балльной шкале Bederson et al. (1986) [10]. Учитывали сгибание передних лап, спонтанные перевороты, реакцию на раздражение вибриссов на 7-е и 14-е сутки эксперимента.
Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики [12], использовали параметрические (Ньюмена-Кейлса и Уил-коксона) критерии. Нормальность распределения определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа. Использовали пакет программ по статистике BioStat.
Результаты и их обсуждение
Формирование необратимой ишемии головного мозга сопровождается тенденцией к росту уровня глутаминовой кислоты на всем протяжении периода наблюдения (в течение трех часов), а в точке «1 ч» значения статистически достоверно отличаются от исходных показателей (таблица 1).
Профилактическое внутривенное введение соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты ЛХТ-317 в дозе 12 мг/кг и ЛБК-527 в дозе 25 мг/кг предотвращает рост концентрации глутаминовой кислоты у животных с нарушением мозгового кровообращения в точках «1 ч» и «2 ч», о чем свидетельствуют сниженные при сравнении с контрольной группой животных уровни нейромедиатора в крови (таблица 1). Наиболее эффективно предотвращало элевацию уровня глутаминовой кислоты в крови соединение органической кислоты с магнием ЛБК-527, что проявлялось в выраженной депрессии уровня медиатора эксайтотоксичности на протяжении двух часов после перевязки мозговой артерии при сравнении с исходным уровнем. Однако, статистически значимых различий в проявлении эффекта между исследуемыми веществами мы не установили, как не было значимых развличий и с препаратом сравнения нимодипи-ном. Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что через три часа после формирования экспериментальной патологии уровень глутаминовой кислоты в группе животных, получавших нимодипин, был наименьший.
На 7-е и 14-е стуки после необратимой перевязки средней мозговой артерии произвели исследование динамики неврологического дефицита (рис.).
ТАБЛИЦА 1.
Динамика концентрации глутаминовой кислоты (мкМ/л) в крови животных с необратимой ишемией головного мозга на фоне внутривенного введения ЛБК-527 и ЛХТ-317
№ п/п Соединение Доза, мг/кг Время регистрации уровня глутаминовой кислоты
Исход Окклюзия 1 ч 2 ч 3 ч
1. Контроль - 149±11 173±14 187±11а 175±12 153±10
2. Нимодипин 1,5 151±12 162±12 94±10*а 105±7*а 12 7±11
3. ЛХТ-317 12,0 150±11 157±10 100±11*а 124±9* 142±13
4. ЛБК-527 25,0 148±8 154±8 88±7*а 101±10*а 151±14
Примечание: * - различия при сравнении с контролем статистически значимы при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса); а - различия при сравнении с исходными значениями статистически значимы при р<0,05 (критерий Уилкоксона).
Al
ЭдУД
ТАБЛИЦА 2.
Показатели объема поражения ипсилатерального полушария головного мозга при необратимой окклюзии средней мозговой артерии у животных опытных и контрольной групп (на 14-е сутки опыта в % к общему объему полушария)
РИС.
Значения баллов неврологического дефицита (M±SD), рассчитанных для животных в исследуемых группах, на 7-е и 14-е сутки после формирования ишемии головного мозга. Примечание: * - различия при сравнении со значениями «7 сут.» статистически значимы при р<0,05 (критерий Уилкоксона); А - различия при сравнении с контролем статистически значимы при р<0,05; В - различия при сравнении с ЛБК-527 статистически значимы при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса).
№ п/п Соединение Время измерения
14 сут.
1. Контроль 74±5
2. Нимодипин 28±4*а
3. ЛХТ-317 47±6*
4. ЛБК-527 36±6*А
С помощью регистрации сгибания передних лап, спонтанных переворотов, реакции на раздражение вибриссов и торсионной деформации тела животных рассчитали суммарный балл в диапазоне от 8 (самая глубокая степень поражения) до 0 (неврологический дефицит отсутствует).
Как видно на рисунке, в контрольной группе животных значение суммарного балла по шкале неврологического дефицита на 7-е сутки опыта было равно 7,2, свидетельствуя о глубоком нарушении двигательной и чувствительной сферы животных. К 14-м суткам отмечалось некоторое снижение интенсивности неврологической симптоматики, достигавшее статистической значимости.
Внутривенное введение ЛХТ-317 в дозе 12 мг/кг в профилактическом режиме приводит к формированию более мягкого неврологического дефицита, что косвенно может свидетельствовать о более легком поражении головного мозга при перевязке мозговой артерии. При этом, следует обратить внимание, что в серии животных, получавших ЛБК-527 в дозе 25 мг/кг, отмечалось достоверное снижение тяжести неврологических нарушений при сравнении с 2-аминоэтансульфонатом диметилфенилацетамида (ЛХТ-317). На фоне введения обоих веществ отмечалась положительная динамика симптомов к 14-м суткам наблюдения по сравнению с 7-ми сутками опыта. При этом тяжесть неврологической картины у животных, получавших ЛБК-527, была сопоставима с группой препарата сравнения, в то время как вещество ЛХТ-317 уступало нимодипину.
При оценке глубины и объема поражения ипсилатераль-ного полушария головного мозга крысы при ишемическом процессе были получены следующие результаты (таблица 2). Необратимая перевязка средней мозговой артерии приводила к поражению трех четвертей ткани полушария головного мозга. Внутривенное введение соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты в профилактическом режиме в исследуемых дозах сокращало объем мозгового некроза, при этом соединение ЛБК-527 было более эффективным, чем вещество ЛХТ-317, и не уступало по антиише-мическому эффекту препарату сравнения нимодипину.
Таким образом, проведенное исследования показало, что соединения 2-аминоэтансульфоновой кислоты, содержащие магний и диметилфенилацетамид, обладают цере-
Примечание: * - различия статистически достоверны при сравнении с контролем при р<0,05;А - различия статистически значимы при сравнении с группой животных, получавших ЛХТ-317 при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса).
бропроекторным эффектом на модели необратимой окклюзии левой средней мозговой артерии. Биологическая природа эффекта лежит в плоскости ограничения ишеми-ческого повреждения ткани головного мозга и проявляется снижением выраженности неврологического дефицита. Наибольший профилактический эффект, сопоставимый с препаратом сравнения нимодипином, установлен у маг-нийсодержащего соединения. Возможно, значимую роль в этом играет способность веществ снижать плазменную концентрацию ключевого медиатора эксайтотоксичности -глутаминовой кислоты, а также за счет присутствия в молекуле ЛБК-527 иона магния конкурентно блокировать кальциевые каналы NMDA-рецепторов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Laurer H.L., Lenzlinger P.M., Mcintosh T.K. Models of traumatic brain injury. Eur. J. Trauma. 2010. Vol. 26. P. 95-100.
2. Lloyd-Jones D., Adams R.J., Brown T.M. et al. Heart disease and stroke statistics: a report from the American Heart Association. Circulation. 2010. Vol. 121. № 7. Р. 46-215.
3. Zauner A., Bullock R., Kuta A.J. et al. Glutamate release and cerebral blood flow after severe human head injury. Acta Neurochir. 2006. Suppl. 67. P. 40-44.
4. Castillo J., Davalos A., Naveiro J., Noya M. Neuroexcitatory amino acids and their relation to infarct size and neurological deficit in ischemic stroke. Stroke. 1996. Vol. 27. № 6. P. 1060-1065.
5. Johnston M.V., Trescher W.H., Ishida A., Nakajima W. Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain. Pediatr. Res. 2001. Vol. 49. № 6. P. 735-741.
6. Ferrarese C., Aliprandi A., Tremolizzo L.et al. Increased glutamate in CSF and plasma of patients with HIV dementia. Neurology. 2001. Vol. 57. № 4. P. 671-675.
7. Zhang H., Zhang X., Zhang T., Chen L. Excitatory amino acids in cerebrospinal fluid of patients with acute head injuries. Clin. Chem. 2001. Vol. 47. № 8. P. 1458-1462.
8. Gelmers H.J. The effects of nimodipine on the clinical course of patients with acute ischemic stroke. Acta Neurol. Scand. 1984. Vol. 69. № 4. P. 232-239.
9. Bielenberg G.W., Beck T., Sauer D. et al. Effect of cerebroprotective agents on cerebral blood flow and on postischemic energy metabolism in the rat brain. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 1987. Vol. 7. P. 480-488.
10. Bederson J., Pitts L., Tsuji M. et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurological examination. Stroke. 1986. Vol. 17. P. 472-476.
11. Graham L.T. Jr., Aprison M.H. Fluorometric determination of aspartate, glutamate, and gamma-aminobutyrate in nerve tissue using enzymic methods. Anal. Biochem. 1966. Vol. 15. P. 487-497.
12. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: «Практика», 1999. 467 с.
Glanc S. Mediko-biologicheskaya statistika. M.: «Praktika», 1999.467s. \
