Эффективность мультиплексного иммуноанализа фосфантмдля серологического подтверждения иксодовых клещевых боррелиозов Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

УДК 616.98:579.834.114-07

ЭФФЕКТИВНОСТЬ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ИММУНОАНАЛИЗА ФОСФАНТМ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕВЫХ БОРРЕЛИОЗОВ

В.Г. Помелова1*, Э.И. Коренберг2, Т.И. Кузнецова3, Т.А. Быченкова1, Т.А. Канаева1, Н.И. Бекман1,

В.И. Фризен3, Н.С. Осин 1ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» Федерального медико-биологического агентства России, Москва Москва Николоямский пер., д. 54 2ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ, Москва Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18а, г. Москва 3Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Пермского края «Пермская краевая клиническая инфекционная больница», Пермь 614000 г. Пермь, ул. Пушкина, 85 Закрытое акционерное общество «ИММУНОСКРИН», Москва 125424, г. Москва,

Шоссе Волоколамское, д 73

В данной работе рассмотрены результаты применения мультиплексного иммуночипового анализа для выявления иммуноглобулинов M и G к пептидным и рекомбинантным антигенам боррелий у больных иксодовыми клещевыми боррелиозами (ИКБ). Проведено сопоставление чувствительности и специфичности этого подхода и иммуноферментных отечественных и зарубежных тест-систем. Сделан вывод о высокой эффективности иммуночипового анализа для серологического подтверждения ИКБ.

Ключевые слова: иксодовые клещевые боррелиозы, мультиплексный анализ, иммуноглобулины M,G.

EFFICACY OF MULTIPLEXING FOSFANTM IMMUNOASSAY FOR IXODID LYME BORRELIOSIS

SEROLOGICAL CONFIRMATION

V.G. Pomelova1, E.I. Korenberg2, T.I. Kuznetsova3, T.A. Bychenkova1, T.A. Kanaeva1, N.I. Bekman1,

V.I. Frizen3, N.S. Osin

1FSBI "State Research Institute of Biological Instruments" Federal Medical-Biological Agency of Russia,

Moscow

2FSBI "N.F. Gamalia's Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology"

of the Ministry of Health, Moscow 3SBHF of Perm Krai "Perm Krai Clinical Hospital of Infectious Diseases", Perm CJC "IMMUNOSKRIN", Moscow

In this paper the results of multiplex immunological analysis to detect immunoglobulin M and G to the peptide and recombinant antigens of Borrelia in patients with Ixodes tick-borne borreliosis (ITB) are presented. A comparison of the sensitivity and specificity of this method is given, along with native and foreign enzyme immunoassay test systems comparison. It is concluded that immunological analysis for serological confirmation of the ITB has high efficacy.

Keywords: Ixodes tick borreliosis, multiplex analysis of immunoglobulins M, G.

Перспективное направление в развитии методов лабораторной диагностики природноочаго-вых инфекций - использование мультиплексных мультиантигенных тестов, позволяющих оценить спектр антител при анализе одной и той же пробы сыворотки [1, 2], в том числе при микст-инфек-

ции [2]. В настоящей работе изложены результаты применения мультиплексного иммуноанализа на основе микропланшетной биочип-технологии ФОСФАНТМ (ЗАО Иммуноскрин, Москва) [3] для выявления иммуноглобулинов М и G к Borrelia burgdorferi sensu lato.

ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)

Цель работы - оценить чувствительность и специфичность тестов на основе мультиплексного иммуноанализа для определения иммуноглобулинов M и G к возбудителям иксодо-вых клещевых боррелиозов (ИКБ) в сравнении с иммуноферментными наборами С6 ELISA (Immunetics, США) и отечественными наборами компании Омникс (г. Санкт-Петербург).

Краткое описание методов. Особенность технологии мультиплексного анализа на основе ФОСФАНТМ - использование стандартных 96-луночных микропланшетов в качестве иммуно-сорбента для иммобилизации специфических антигенов боррелий. Композиции антигенов включали пептид Сб-VlsE из B. burgdorferi sensu stricto, белки OspC и VlsE (определение IgM) или этот пептид и пептиды Сб-VlsE из B.garinii и B.afzelii (для IgG). Антигены были напечатаны в виде отдельных микрозон (диаметром 0,7 мм) на дне лунок стандартных полистироловых микропланшетов. Сигнал фосфоресценции метчика платинакопропорфирина с каждой микрозоны регистрировали на биочип-анализаторе Диа-гемТМ (Иммуноскрин). Оценка чувствительности и специфичности тестов на основе ФОСФАН проведена в сравнении с С6 ELISA Immunetics и наборами компании Омникс в сопоставлении с результатами исследования проб цельной крови от обследованных пациентов методом ПЦР. Был проведен параллельный анализ 661 сыворотки крови пациентов из высокоэндемичного региона России (Пермский край): 351 - от больных эритемной формой ИКБ; 82 - от больных безэри-темной формой ИКБ; 31 - от больных с другими заболеваниями; 197 - от клинически здоровых доноров крови. Проанализирована эффективность применения рекомбинантных и пептидных антигенов для серологического подтверждения ИКБ в зависимости от длительности инкубационного периода после укуса клеща, продолжительности инфекционного процесса и формы заболевания (моно- или микст-инфекция), а также частота выявления антител и сероконверсии при исследовании парных сывороток. Отдельный фрагмент работы посвящен результатам применения ФОС-ФАН для исследования сывороток, собранных в 2009-2010 г.г. в Омской области.

результаты. Чувствительность выявления антител методом ФОСФАН с различными антигенами была примерно одинакова: IgM - в пределах 25,6 - 27,9%, IgG - от 42,5% до 55%. Специфичность при детекции антител обоих классов - от 94,4 до 99,5%. Частота выявления суммарных IgM и/или IgG к пептиду С6-"УкЕ из B. burgdorferi sensu stricto в ФОСФАН достоверно (p<0,05) пре-

вышала частоту их выявления в тесте С6 ELISA при сопоставимой специфичности. Учет IgM и/ или IgG по любому из 6 антигенов достоверно повышал чувствительность ФОСФАН, особенно на ранних сроках заболевания ИКБ, но (при однократном тестировании пробы) существенно снижал специфичность. При исследовании парных сывороток пациентов с эритемной формой ИКБ (в остром периоде заболевания) установлена се-роконверсия IgG и/или IgM и/или не менее чем 2-кратное нарастание коэффициентов серопо-зитивности у подавляющего числа больных (до 96 %), что свидетельствовало об активном инфекционном процессе.

обсуждение. Мультиплексный иммуно-анализ - перспективный подход к определению спектра антител одновременно к нескольким антигенам боррелий. Преимущества ФОСФАН по сравнению с иммуноферментными тестами - способность к одновременному определению спектра антиборрелиозных антител при анализе одной и той же сыворотки, что повышает информативность исследований. Благодаря люминесцентному способу детекции коэффициенты позитивности в ФОСФАН выше, чем в ИФА, что позволяет более эффективно выявлять различия в их значениях при установлении сероконверсии в парных сыворотках. Поскольку ФОСФАН аналогично ИФА проводится в стандартных полистироловых планшетах, это позволяет использовать стандартное лабораторное оборудование (вошеры, шейке-ры и т. п.) и не требует переобучения персонала.

У пациентов с эритемной формой ИКБ (в остром периоде заболевания) для эффективного серологического подтверждения диагноза было достаточно выявить IgM и IgG к пептиду C6-VlsE B. burgdorferi; дополнительное определение IgM к OspC и VlsE у таких пациентов мало влияло на общую чувствительность анализа, однако повышало информативность и надежность серологического исследования в целом.

У пациентов с безэритемной формой ИКБ (в остром периоде заболевания) IgM к OspC и, особенно, к VlsE выявлялись чаще, чем IgM и IgG к пептиду C6-VlsE B. burgdorferi, поэтому их определение вносило существенный вклад в повышение общей чувствительности серологического исследования, особенно на ранних сроках от начала заболевания.

У подавляющего большинства пациентов, в крови которых была выявлена ДНК B. burgdorferi sensu lato, зарегистрирован положительный результат ФОСФАН при определении специфических антител к антигенам боррелий.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

1. Porwancher RB, Hagerty CG, Fan J, et al. Multiplex immunoassay for Lyme disease using VlsE1-IgG and pepC10-IgM antibodies: improving test performance through bioinformatics. Clin Vaccine Immunol, 2011; 18: 851-859.

2. Помелова В.Г., Коренберг Э.И., Осин Н.С. и др. Применение фосфоресцентных иммуночипов для серологической диагностики иксодовых клещевых борре-

HH030B. Эпнflемопогнн h BaKH,HHonpo^nnaKTHKa, 2010;

1: 22-29.

3. Osin NS, Pomelova VG. Multi-array immunophosphorescence technology for the detection of pathogens. In: Georgiev VS, Western KA, McGowan JJ (eds). Frontiers in research. National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Vol 1. Totowa, NJ: Humana Press; 2008: 233-240.

Помелова Вера Гавриловна - доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных методов диагностики ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» Федерального медико-биологического агентства России, Москва.

Быченкова татьяна Александровна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных методов диагностики.

Бекман наталья игоревна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярных методов диагностики.

Канаева Татьяна Анатольевна - научный сотрудник лаборатории молекулярных методов диагностики.

Коренберг Эдуард исаевич - доктор биологических наук, профессор, руководитель отдела природноочаговых инфекций ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ, Москва. Кузнецова татьяна игоревна - врач, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Пермского края «Пермская краевая клиническая инфекционная больница», Пермь.

Фризен Владимир иванович - главный врач, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Пермского края «Пермская краевая клиническая инфекционная больница», Пермь.

осин николай Сергеевич - доктор биологических наук, генеральный директор закрытого акционерного общества «ИММУ-НОСКРИН», Москва.

© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 15 октября 2014 г.

УДК 616-036.21

ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ИНФЕКЦИИ ШЕСТОГО КОНТИНЕНТА: РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ

В.Б. Сбойчаков, А.Л. Панин, А.Б. Белов Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, г. Санкт-Петербург Россия., г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6. Тел. (812) 329-71-03

В последние десятилетия в Антарктиде наблюдается заметная антропогенная трансформация внешней среды, влияющая на условия жизни микроорганизмов. Всё чаще начали выделяться условно патогенные и патогеные бактерии и микромицеты в этих экстремальных условиях. Назрела необходимость в поиске возбудителей инфекционных болезней с природной очаговостью, определению среди них завозных и автохтонных микроорганизмов для территории шестого континента. На основании микробиологического мониторинга на прибрежных территориях в районах расположения объектов Российской антарктической экспедиции к кандидатамв такие патогены можно отнести психрофильных микроорганизмов. Результаты поиска бактерий и микроскопических грибовв объектах окружающей среды показало их весьма широкое разнообразие ипредставительство. Результаты данных исследований дают объективную оценку негативных последствий антропогенного влияния на природу Антарктиды, вносят