CC BY
49
DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.60.006 Сабирова А.Р.1, Кравцова О.А.2
1 Магистрант,
2ORCID: 0000-0002-4227-008X, Кандидат биологических наук, доцент ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет, Работа выполнена при финансовой поддержке ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в
научно-технической сфере», №6090ГУ/2015 ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДОВ ПОЛНОГЕНОМНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ПРИ МОЛЕКУЛЯРНО-
ГЕНЕТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ ДРЕВНЕЙ ДНК
Аннотация
В последние несколько лет для молекулярно-генетического анализа образцов ДНК с низким содержанием нуклеиновых кислот (единичные клетки) или высокой степенью деградации (древняя ДНК, ДНК из объектов биологического происхождения в рамках проведения судебно-генетических экспертиз) предложены методы для преамплификации образцов ДНК, или методов полногеномной амплификации (whole genome amplification, WGA). На сегодняшний день известно несколько методологических подходов (напр., MDA, PEP-PCR, DOP-PCR), на основе некоторых из них созданы коммерческие наборы для WGA. Однако, как показывает ряд исследований, не все они являются эффективными при работе именно с древними образцами ДНК, выделенными из костных останков.
В данной работе проведена сравнительная характеристика методов полногеномной амплификации с использованием коммерческих наборов «GenomePlex Complete WGA kit» (Sigma) и «Repli-G Midi kit» (Qiagen) и ранее предложенных методов преамплификации ДНК для молекулярно-генетического анализа на основе секвенирования D-петли митохондриального генома образцов древней ДНК, выделенных из костной ткани человека из погребений, датируемыхXIV-XVвв., обнаруженных на территории Среднего Поволжья.
В данном исследовании показано, что наименьшее количество мисматчей наблюдается при использовании коммерческого набора «GenomePlex Complete WGA kit» и оригинальной методики PEP-PCR, основанной на полимеразной цепной реакции с удлинением продукта предыдущего цикла амплификации.
Ключевые слова: древняя ДНК, полногеномная амплификация, секвенирование митохондриальной ДНК
Sabirova A.R.1, Kravtsova O.A.2
Undergraduate Student, 2ORCID: 0000-0002-4227-008X, PhD in Biology, Associate Professor FSAEI "Kazan (Volga Region) Federal University," Kazan, the Russian Federation The work was carried out with the financial support of the FGB U "Foundation for Assistance to Small Innovative Enterprises in Science and Technology", No. 6090UU/2015 EFFECTIVENESS OF WHOLE GENOME AMPLIFICATION METHODS IN MOLECULAR AND GENETIC
ANALYSIS OF ANCIENT DNA
Abstract
In the past few years, methods for preamplifying DNA samples, or methods of whole genome amplification, WGA, have been proposed for the molecular genetic analysis of DNA samples with a low content of nucleic acids (single cells) or a high degree of degradation (ancient DNA, DNA from objects of biological origin as part offorensic genetic examinations). To date, there are several methodological approaches (eg, MDA, PEP-PCR, DOP-PCR), some of which have commercial sets for WGA. However, several studies show that not all of them are effective when working with ancient DNA samples extracted from calcius.
This paper contains comparative analysis of the methods of whole genome amplification using commercial sets "GenomePlex Complete WGA kit" (Sigma) and "Repli-G Midi kit" (Qiagen) with previously proposed DNA preamplification methods for molecular genetic analysis based on D-loop sequence analysis of mitochondrial genome of ancient DNA samples extracted from human calcius left after burials dating from the fourteenth to fifteenth centuries found in the Middle Volga region.
This study illustrates that the least number of mismatches is observed when using the commercial kit "GenomePlex Complete WGA kit" and the original PEP-PCR technique based on polymerase chain reaction with elongation of the product of the previous amplification cycle.
Keywords: ancient DNA, whole genome amplification, sequence analysis of mitochondrial DNA
Введение. При молекулярно-генетическом анализе образцов биологического происхождения одним из проблемных вопросов является деградация ДНК. Как правило, при работе с такими образцами, основными препятствиями для исследования стандартными молекулярно-генетическими методами являются низкое качество и небольшое количество исходной ДНК-матрицы [1, С. 956-956].
Для преодоления трудностей амплификации, связанных с низкой концентрацией и качеством деградированной ДНК, в последние несколько лет разработаны методы так называемой преамплификации ДНК, или полногеномной амплификации (WGA, whole genome amplification), в результате которых случайным образом амплифицируется весь геном. Основной целью WGA является получение сбалансированной и верной репликации всех хромосомных регионов без потерь или преимущественной амплификации любых локусов или аллелей генома, что особенно актуально при выявлении точечных мутаций или хромосомных аббераций в единичных клетках [2].
Методы WGA также можно использовать и при исследовании малых количеств деградированных ДНК, выделенных, например, из объектов биологического происхождения (при проведении генотипоскопической экспертизы в рамках расследований уголовных дел) [3, C. 1344-1349].
Однако особенно актуальным является разработка и оптимизация методов WGA при генетическом анализе древней ДНК, полученных из археологических источников (костная, зубная ткани человека и животных) [4].
На сегодняшний день описано несколько подходов для WGA, таких как DOP-PCR [5, С. 20-40], PEP-PCR [6, С. 5670] и MDA [7, С. 30-39], при этом рядом компаний (Qiagen, Германия; Sigma-Aldrich, США; New England Biolabs, Англия), являющихся лидерами в области молекулярных исследований, разработаны коммерческие наборы. Однако, эффективность использования преамплификации при генетическом анализе сложных образцов, в том числе и древней ДНК, ограничена небольшим числом исследований [8, С.309-319], [9, С.16-24], [10, С. 35-41].
В связи с этим, в данной работе проведена сравнительная характеристика эффективности использования различных методов WGA (DOP-PCR, PEP-PCR и MDA) и их коммерческих аналогов для последующего секвенирования митохондриальной ДНК в образцах тотальной ДНК, выделенных из костных останков человека из погребений Среднего Поволжья, датируемых XIV-XV вв.
Материалы и методы. Выделение ДНК из костной ткани, измельченной до порошкообразного состояния с помощью гомогенизатора TissueLyser II (Qiagen, Германия), проводили с помощью коммерческого набора QIAamp DNA Investigator Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкции фирмы-производителя.
Количественную оценку выделенных образцов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием коммерческого набора Plexor® HY System (Promega, США). Качество полученных препаратов оценивали спектрофотометрически по соотношению поглощения света образцами при длинах волн 230, 260 и 280 (Implen Nanophotometer, США). Также дополнительными критериями качества и количества полученных образцов древней ДНК служили данные электрофоретического анализа, полученные с помощью BioAnalyzer2100 (Agilent, США).
Полногеномную амплификацию выделенных образцов осуществляли на основе ранее предложенных протоколов полногеномной амплификации: с частично вырожденными праймерами (degenerate oligonucleotide-primed PCR, DOP-PCR) [5, С.20-40], методом полимеразная цепная реакция с удлинением продукта предыдущего цикла амплификации (primer extension preamplification PCR, PEP-PCR) [6, С. 56-70] и амплификация по типу катящегося кольца (multiple displacement amplification, MDA) [7, С. 30-39]. Параллельно оценивали эффективность коммерческих наборов для WGA: «GenomePlex Complete WGA kit» (Sigma Aldrich, США) и «Repli-G Midi kit» (Qiagen , Германия). Реакции проводили согласно протоколу фирмы-производителя.
Для секвенирования участка митохондриальной ДНК (мтДНК) древних образцов до и после энзиматической модификации использовали праймеры F15989 и R16410, амплифицирующих область D-петли размером 430 п.н. Для проведения реакции секвенирования использовали коммерческий набор BigDye Terminator v3.1. (Qiagen, Германия) для ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems). Полученные электрофореграммы анализировали с помощью программы Finch TV (Perkin Elmer, США), выравнивание полученных последовательностей ДНК проводили в программе MAFFT - a multiple sequence alignment program [11]. Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение MS Excel 2010.
Результаты исследования и их обсуждение. В ходе работы было проанализировано 9 образцов ДНК, выделенных из костных останков человека из погребений, обнаруженных на территории средневекового города Болгар. Выделение ДНК проводили из образцов трубчатых костей, любезно предоставленных с.н.с., заведующим биоархеологической лаборатории Института археологии им. А. Х. Халикова Академии Наук РТ, к.и.н., Газимзяновым И. Р.
Результаты спектрофотометрической характеристики выделенных образцов дДНК показали их достаточно высокую чистоту (отношение 260/280 - 1,75±0,15, отношение 260/230 - 1,38±0,68) и, в тоже время, низкую концентрацию (3,56±0,54 нг/мкл), что подтверждается данными количественной ПЦР в реальном времени с использованием PlexorHY (рис. 1).
PCR. Curves | sample Names | Standard Curves | Reports ]
FAM - Auto CO 560
31
Well ▼ Sample Name Cq
23.07 24.56
26.15 29.28 30.75
33.16 36.15
Tm Cone 80,4 5000E01 802 1000E-02 80,2 2000E-03 80,1 4000E-04 80,1 8000E-05 80,1 1600E-05 7243E-09
¡0,2 2148E-07 Yes
8 4332E-07 Yes
0,6 8009E-07 Yes
32.47 37.71 36.93 33.41 36.08 32.11
37.67 32.54 32.58
82,0 2150E-06 Yes
6469E-10 No
81,9 2176E-09 Yes
76,9 5014E-07 Yes
81,5 8133E-09 Yes
81,7 3749E-06 Yes No
81,9 7792E-10 Yes
81,8 6947E-10 81,6 1941E-06 81,8 1821E-06
30.75 82,2 3086E-05 Yes
Рис. 1 - Проведение ПЦР с образцами дДНК с использованием PlexorHY. A - сигналы накопления флюоресценции в ходе ПЦР в реальном времени (канал детекции FAM); B - мелтинг образцов; С - результаты ПЦР (указаны пороговые циклы Сq, температура плавления Tm, и концентрация ДНК в исследуемых образцах, нг/мкл)
Ввиду низкой концентрации дДНК, до амплификации фрагмента гипервариабельного участка 1 (HV1) мтДНК, нами проведены 5 типов реакций полногеномной амплификации: на основе DOP-PCR, PEP-PCR, MDA и с использованием 2-х коммерческих наборов фирм Sigma Aldrich и Qiagen. По результатам электрофоретического разделения продуктов WGA в 1% агарозном геле (рис. 2) и гель-электрофореза на анализаторе BioAnalyzer2100 (рис. 3) показано, что наибольшей эффективностью в отношении увеличении количества и повышении качества образцов дДНК, характеризуются методы на основе PEP-PCR и коммерческого набора «GenomePlex Complete WGA kit» (Sigma Aldrich).
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Рис. 2 - Электрофореграмма, показывающая состояние деградированных образцов после проведения реакций полногеномной амплификации. 1, 15 - положительные контроли для WGA; 2-5 - дДНК после коммерческой реакции «GenomePlex Complete WGA», Sigma; 6-9 - дДНК после коммерческой реакции «REPLI-g Midi», Qiagen; 10-13 -дДНК после DOP-PCR; 16-19 - дДНК после PEP-PCR; 20-23 - дДНК до WGA; 24-27 - дДНК после MDA; 14,28 -маркер молекулярного веса (pUC19/ Kzo 9I, ООО «СибЭнзим», г.Новосибирск)
Assay Class: High Sensitivity DNA Assay
Data Path: C:\...gh Sensitivity DNA Assay_DE13805&44_2015-D2-13_15-42-23.xad Electropherogram Summary Continued ...
Created: 13.02.2015 15:42:22 Modified: 13.02.2015 16:45:43
[FU]
900-
800-
700-
600-
500-
400-
300-
200-
100-
А дДНК
[s]
Assay Class: High Sensitivity DNA Assay
Data Path: C:\...gh Sensitivity DNA Assay_DE13805844_2015-02-13_15-42-23.xad Electropherogram Summary Continued ...
B GenomePlex Complete WGA
Created: Modified:
13.02.2015 15:42:22 13.02.2015 16:45:43
120 [s]
Assay Class: High Sensitivity DNA Assay
Data Path: C:\...gh Sensitivity DNA Assay_DE13805844_2015-02-13_15-42-23.xad Electropherogram Summary Continued ...
С PEP-PCR
[FU] 350 300250200150100500-
Created: Modified:
13.02.2015 15:42:22 13.02.2015 16:45:43
ribviUu
[S]
Рис. 3 - Данные электрофоретического разделения образцов дДНК до (A) и после WGA (B, C) методом
электрофореза на BioAnalyzer 2100
Последующий анализ образцов дДНК заключался в амплификации участка HV1 D-петли мтДНК размером около 420 п.н. для последующего секвенирования методом Сэнгера.
При анализе немодифицированных образцов дДНК амплификация участка мтДНК получена только в 56% случаев (5 образцов из 9), тогда как после проведения WGA эффективность ПЦР возросла до 100% (рис. 4).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Рис. 4 - Электрофореграмма разделения продуктов амплификации участка HV1 мтДНК. Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса (pUC19/ Kzo 9I, ООО «СибЭнзим», г.Новосибирск), 2-10 - образцы дДНК после PEP-PCR, 11-19 - образцы дДНК без энзиматической модификации.
При анализе нуклеотидных последовательностей исследуемых образцов показано, что наибольшая эффективность секвенирования HV1 мтДНК достигнута при проведении преамплификации на основе метода PEP-PCR. В тоже время, как при использовании PEP-PCR, так и коммерческого набора «GenomePlex Complete WGA» в качестве методов WGA, в сиквенсах наблюдалось некорректное определение нуклеотидов, которое составило 0,67% и 1,1% для каждого из методов соответственно.
Полученные нами результаты согласуются с данными разных авторов, в исследованиях которых проведена оценка эффективности использования методов WGA для секвенирования мтДНК [12], а также микросателлитного анализа [13], в которых показана эффективность полногеномной амплификации на основе PEP-PCR и использования набора «GenomePlex Complete WGA» для преамплификации образцов ДНК, подвергшейся выраженной деградации, в том числе и древней ДНК.
Список литературы / References
1. Adlera C. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones /C.J. Adlera, W. Haaka, D. Donlon, A. Coopera,// Journal of Archaeological Science. - 2011. - V. 12. - P. 956-964.
2. Babayan A. Comparative study of whole genome amplification and next generation sequencing performance of single cancer cells / A. Babayan, M Alawi, M. Gormley et al. // Oncotarget. - 2016. doi: 10.18632/oncotarget.10701
3. Barber A.L. The utility of whole genome amplification for typing compromised forensic samples / A.L. Barber, D.R. Foran // Journal of forensic sciences. - 2006. - V. 6. - P. 1344-1349.
4. Hughes-Stamm S. DNA typing methods for highly degraded samples / S. Hughes-Stamm // The degree of Doctor of Philosophy. Sheree Hughes-Stamm; Faculty of Health Sciences & Medicine, Bond University. - 2012. - 402 р.
5. Arneson N. Whole-Genome Amplification by Degenerate Oligonucleotide Primed PCR (DOP-PCR) / N. Arneson, S. Hughes, R. Houlston, S. Done Cold // Spring Harb Protoc. - 2013. - V. 20. - P. 20-40.
6. Arneson N. Whole-Genome Amplification by Improved Primer Extension Preamplification PCR (I-PEP-PCR) / N. Arneson, S. Hughes, R. Houlston, S. Done Cold // Spring Harb Protoc. - 2013. - V. 13. - P. 56-70.
7. Alsmadi O. Specific and complete human genome amplification with improved yield achieved by phi29 DNA polymerase and a novel primer at elevated temperature / O. Alsmadi // BMC Research Notes. - 2009. - V. 10. - P. 30-39.
8. Maciejewska A. Whole genome amplification of degraded and nondegraded DNA for forensic purposes / A. Maciejewska, R. Pawlowski, J. Jakubowska // Int J Legal Med. - 2013. - V. 127(2). - P. 309-319. doi: 10.1007/s00414-012-0764-9
9. Silander K. Whole Genome Amplification with Phi29 DNA Polymerase to Enable Genetic or Genomic Analysis of Samples of Low DNA Yield / K. Silander, J. Saarela // Genomics Protocols. - 2008. - V. 7. - P. 16-24.
10. Ballantyne K.M. Comparison of two whole genome amplification methods for STR genotyping of LCN and degraded DNA samples / K.N. Ballantyne, R.A. van Oorschot, R.J. Mitchell // Forensic Sci Int. - 2007. - V. 166(1). - P. 35-41.
11. Katoh S. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability / S.Katoh // Mol. Biol. and Evol. - 2013. -V. 30. - P. 772-780. - URL: http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/ (дата обращения 21.04.2015).
12. Nara A. Sequence analysis for HV I region of mitochondrial DNA using WGA (Whole Genome Amplification) method / Nara A., Harihara S., Iwadate K., Uemura K. // Leg. Med. (Tokyo). - 2009. - Suppl 1: S.115-118. doi: 10.1016/j.legalmed.2009.01.114.
13. Maciejewska A. Different whole-genome amplification methods as a preamplification tool in Y-chromosome Loci analysis / A. Maciejewska, J. Jakubowska, R. Pawlowski // Am J Forensic Med Pathol. - 2014. - V. 35(2). - P. 140-144. doi: 10.1097/PAF.0000000000000093.
