CC BY
78
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:616.995.132.6:636:612.017
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ РЕАКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИГЕНОВ ЛИЧИНОК ЕВРОПЕЙСКОГО ШТАММА Trichinella spiralis И АРКТИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ T. nativa ПРИ СЕРОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ В ОЧАГАХ ТРИХИНЕЛЛЕЗА НА СЕВЕРНЫХ ТЕРРИТОРИЯХ РФ
И.М. ОДОЕВСКАЯ кандидат биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28, e-mail: [email protected]
Проведены сравнительные испытания диагностической эффективности в ИФР экскреторно-секреторных антигенов Trichinella spiralis и T. nativa с сыворотками крови мышей линии СВА, экспериментально зараженных трихинеллами, выделенными из мышц диких плотоядных животных. Показано, что при использовании антигена из личинок T. nativa в ИФР для анализа титров специфических антител у животных, зараженных трихинеллами, циркулирующими в природных биоценозах Крайнего Севера, результативность теста значительно повышается.
Ключевые слова: трихинеллез, Trichinella spiralis, T. nativa, иммуноферментная реакция, экскреторно-секреторные антигены.
Трихинеллез на территории Российской Федерации является серьезной социально-экономической проблемой, требующей проведения систематического мониторинга этого опасного антропозооноза, разработки эффективных мер профилактики, диагностики и терапии данной болезни. Вирулентность, или инвазионно-биологическая активность различных природных и синан-тропных изолятов трихинелл, часто характеризуется значительной вариабельностью по отношению к разным видам млекопитающих, что обусловливает необходимость детального изучения иммунологических, физиологических и генетических особенностей этих гельминтов [1, 2, 4].
Жизнь в арктических условиях обусловливает единый тип питания коренных северных народностей как на территории Российской Федерации, так и на территории Арктической Канады, Аляски, острова Гренландии.
В последние годы все чаще регистрируют случаи массового инвазирова-ния трихинеллами людей в результате употребления в пищу продуктов охотничьего промысла [8, 14, 16, 18]. Как правило, такие вспышки вызваны различными вариететами так называемых «природных» трихинелл, относящихся к виду Trichinella паНуа. Эпизоотическая ситуация по трихинеллезу в районах Крайнего Севера издавна характеризуется стойким неблагополучием. Так, в Канадской Арктике экстенсивность инвазии у моржей колеблется от 1 до 22 %, белых медведей от 24,2 до 60,9, лисиц и волков - до 33, песцов - до 89 % [9, 17, 19].
В ходе эпизоотического мониторинга на территории Чукотки в 2010 г. было выявлено 8 видов млекопитающих - носителей трихинелл. Экстенсив-
ность инвазии у бурых медведей составила 80 %, лисиц 66,7, ездовых собак 68,4, кошек домашних 88,9, крыс 20,0, песцов клеточного разведения 72,3 % [1].
Особенностью эпизоотологии трихинеллеза на морских побережьях Арктики является активное участие морских млекопитающих в передаче три-хинеллезной инвазии в синантропный биоценоз [15, 19]. Охота на наземных животных и морской зверобойный промысел - основа социально-экономической структуры поселений коренных жителей Арктики. В некоторых национальных селах имеются небольшие предприятия, на которых перерабатываются продукты морского зверобойного промысла и рыболовства, при этом сохраняется приверженность к этническим способам заготовки мяса морского зверя - солению, квашению, вялению, замораживанию. Продукты животного происхождения - мясо наземных и морских млекопитающих, рыба, морепродукты, занимают основное место в структуре питания коренного населения.
Данные социологических опросов свидетельствуют, что до сих пор, следуя многовековым пищевым традициям, более 50 % опрошенных респондентов из числа коренного населения регулярно употребляют в пищу термически необработанное мясо диких животных, что часто является причиной вспышек трихинеллеза среди местного населения.
В период с 1982 по 1999 гг. в поселениях инуитов, расположенных на восточном побережье Гудзонова залива, произошло 11 групповых вспышек трихинеллеза, причем в 9 случаях доказанными источниками инвазии являлись мясные продукты, приготовленные из мяса морских млекопитающих традиционным способом, без термической обработки [18].
В 2008 г. в Чукотском автономном округе зарегистрировано 8 случаев трихинеллеза, связанных с употреблением мяса моржа в вяленом виде, трое из числа заболевших умерли [2].
Сероэпидемические исследования, связанные с употреблением коренным населением в пищу зараженного трихинеллами мяса моржа, проводились канадскими учеными на восточном побережье Баффиновой Земли. Используя ИФР, было установлено, что среди лиц из сообщества инуитов, систематически употреблявших в пищу термически не обработанное инвазиро-ванное личинками трихинелл мясо морских млекопитающих, 36 % респондентов имели положительные титры антител. Проведенные масштабные сероэпидемические исследования на трихинеллез жителей Северных территорий США, Канады, Дании (о-ва Гренландии) выявили значительное количество (19,6 %) серопозитивных лиц среди коренного населения, не имеющих клинических проявлений трихинеллеза, что свидетельствует о наличии остаточных антител после перенесенных не диагностированных случаев заболевания [8, 10-12].
В России в рамках федеральной целевой программы «Дети Севера» в 1994-1995 гг. проводились выборочные сероэпидемиологические скрининго-вые обследования на трихинеллез коренных народов Севера. Антитела к антигенам трихинелл были выявлены у 1,6 % детей и 3,1 % из числа взрослых респондентов [5-7]. В 2006 г. в результате выборочного сероэпидемического обследования на трихинеллез 437 лиц из числа коренного населения прибрежных поселков Лорино и Лаврентия было выявлено соответственно 6,1 и 1,3 % серопозитивных лиц [2].
Полученные результаты значительно отличаются от данных зарубежных исследователей. Вероятно, столь низкие результаты иммунологического скрининга большой группы коренного населения Арктики обусловлены применением в иммуноферментной реакции антигенов европейского штамма ТпскгпвПа ърр., что не позволило достоверно выявить иммунные комплексы в сыворотке крови лиц, инвазированных арктическими изолятами трихинелл. Сравнительно невысокий процент серопозитивных лиц в регионе, где основой существования коренного населения, проживающего в поселках на морских побережьях, является охотничий промысел наземных и морских живот-
ных, по-видимому, не может отражать истинную эпидемическую ситуацию по трихинеллезу.
В рамках Международной программы ВОЗ по безопасности продуктов питания и здоровья коренного населения Арктики в настоящее время проводятся масштабные исследования по изучению биологических особенностей арктических изолятов T. nativa и их молекулярно-генетических свойств. Особое внимание уделяется разработке эффективных мер по профилактике и се-роэпидемическому мониторингу данного антропозооноза среди коренного населения Аляски, о-ва Гренландии, Северной части Канады [8-13]. В связи с этим приоритетное значение имеет изучение патогенности и вирулентности природных изолятов трихинелл, циркулирующих в различных зоогеографи-ческих областях РФ.
До сих пор в России во всех эндемичных по трихинеллезу территориях для сероэпидемиологического мониторинга используют тест-системы (ИФА, РНГА) на основе антигенов, выделяемых из инвазионных личинок европейских штаммов T. spiralis, циркулирующих в биоценозах Северного Кавказа, Краснодарского края, Белоруссии [4, 5].
В связи с вышеизложенным, целью работы было сравнительное изучение диагностической эффективности ИФР при использовании экскреторно-секреторных антигенов от европейского штамма T. spiralis и арктических изолятов T. nativa с сыворотками крови экспериментально зараженных природными арктическими вариететами трихинелл лабораторных животных.
Работа выполнена при финансовой поддержке North Pacific Research Board (NPRB), USA, проект № 914.
Материалы и методы
Исследования проводили на белых беспородных мышах (50 гол.), мышах линии СВА (50 гол.), золотистых хомяках (40 гол.). Для приготовления экскреторно-секреторного антигена использовали следующие штаммы трихинелл:
1. Европейский эталонный штамм T. spiralis, выделенный более 50 лет назад от домашней свиньи из Белоруссии, поддерживающийся с тех пор на лабораторных грызунах;
2. Природные изоляты T. nativa (первоначально были получены в 2008 г. из мышц белого медведя и росомахи, обитавших в Якутии).
Для того, чтобы исключить влияние антигенной мимикрии на результаты исследований, наработку антигена проводили путем заражения золотистых хомяков, а при проведении ИФА использовали сыворотки крови экспериментально инвазированных арктическими трихинеллами мышей. Для получения препаративного количества одновозрастных инвазионных личинок T. nativa и T. spiralis было проведено заражение 40 золотистых хомяков в дозе 500 личинок /голову вышеуказанными вариететами трихинелл.
Убой животных проводили с помощью диэтилового эфира через два месяца после заражения. Методики биохимического переваривания мышечной ткани в ИЖС, подсчет личинок в 1 г костно-мышечного фарша в среднем по каждой группе, получения и очистки экскреторно-секреторных продуктов, определения конечной концентрации белка, сенсибилизации полистироловых планшетов (производства ГОСНИИПОЛИМЕР), постановки ИФР подробно изложены ранее [3].
Экскреторно-секреторные продукты T. spiralis и T. nativa использовали в ИФР в концентрации 5 мкг/мл. Каждый планшет визуально разделяли пополам, лунки 6 стрипов сенсибилизировали антигеном T. spiralis, остальные 6 -антигеном T. nativa в эквимолярной концентрации. В эксперименте использовали сыворотки крови мышей, зараженных природными изолятами арктических трихинелл, в разведении 1 : 100.
Результаты и обсуждение
Интенсивность инвазии T. spiralis в среднем по группе составила 2854 лич./г костно-мышечного фарша. Интенсивность инвазии T. nativa у хомяков двух опытных групп составила 347 лич./г (изолят от белого медведя) и 29,6 лич./г (изолят от росомахи) Всего после очистки и концентрирования ПЭЭГ-8000 было получено антигенов: 678 мкг T. spiralis и 162 мкг T. nativa. При компрессорной микроскопии мышечной ткани экспериментально инвазиро-ванных лабораторных грызунов отмечены существенные морфологические отличия капсул вышеупомянутых изолятов трихинелл.
Результаты исследований показали, что одни и те же сыворотки экспериментально зараженных арктическими трихинеллами мышей по-разному реагируют в ИФР с антигенами T. spiralis и T. тйуа, при этом показатели оптической плотности (ОП) отрицательных контролей (5 проб) при использовании вышеуказанных антигенов оставались практически идентичными (0,073-0,081, т. е. <0,1). Сыворотки крови 12 мышей на 60-63-и сутки инвазии показали при использовании антигена T. тйуа ОП от 0,389 до 0,624, а при использовании антигена T. spiralis - от 0,112 до 0,277. Как видно из приведенных данных, при использовании антигена T. тйуа специфические антитела выявляются у 100 % зараженных животных, в то время как при использовании экскреторно-секреторного антигена европейского штамма T. spiralis только сыворотки четырех животных (33 %) можно отнести к положительным (трехкратное превышение показателей отрицательного контроля), остальные же 8 проб - к сомнительным результатам.
Более высокие показатели ОП при использовании арктического антигена зарегистрированы при анализе титров специфических антител у 10 экспериментально зараженных мышей на 90-е сутки инвазии (0,576-1,187) и в более поздние (4-5 мес) сроки течения инвазии (0,498-0,989) еще у 8 мышей. Чувствительность реакции при использовании «арктического антигена» с сыворотками крови экспериментально зараженных природными изолятами T. тйуа мышей составила 100 %. При испытании экскреторно-секреторного антигена, полученного из штамма T. spiralis, с тем же набором сывороток, показатели ОП были значительно ниже (0,149-0,326), число серопозитивных проб составило 38,8 %.
Результаты вышеуказанных экспериментов, несомненно, следует рассматривать как проявление сложных паразито-хозяинных взаимоотношений между тканевым гельминтом и макроорганизмом млекопитающего. Известно, что патогенез инвазии, вызванной T. nativa, характеризуется сложными взаимоотношениями паразита и хозяина, в первую очередь, основанными на многообразии иммунного ответа макроорганизма.
Для тканевого гельминта наиболее важным для выживания в макроорганизме является приобретение свойств, обеспечивающих преодоление механизмов воздействия иммунной системы хозяина. Факторы патогенности у паразита прежде всего направлены на адаптацию к организму конкретного вида млекопитающего. При этом снижение вирулентности у тканевого гельминта может выступать как один из механизмов его уклонения от факторов защиты хозяина. Важнейшими из всех приспособительных механизмов являются биохимические процессы, препятствующие распознаванию тканевого гельминта, так называемая антигенная мимикрия (подобие синтезируемых паразитом белковых молекул и протеинов хозяина), а также наличие малых, экспонированных на поверхности белковых молекул эпитопных участков, запрещенных к атаке антителами хозяина. Несомненно, что процесс изменения набора поверхностных антигенов тесно связан с адаптацией к воздействию иммунной системы млекопитающих - хозяев трихинелл. Вероятно, именно вышеуказанные процессы, изменяющие иммунологические параметры как поверхностных, так и экскреторно-секреторных антигенов трихинелл,
лежат в основе приспособляемости этих тканевых гельминтов к различному спектру животных-хозяев.
Для выживания возбудителя и в целом паразитарной системы паразит должен варьировать вирулентность таким образом, чтобы обеспечить в хозяине-макроорганизме высокую численность паразита, гарантирующую возможность передачи от одного хозяина к другому. Все вышеизложенными процессы имели место при длительном пассировании «эталонного» европейского штамма трихинелл на лабораторных грызунах. В результате многолетнего искусственного отбора наиболее адаптированных к существованию в организме лабораторных грызунов трихинелл был получен штамм, характеризующийся колоссальным потенциалом воспроизводства и значительно сниженной вирулентностью по отношению к макроорганизму млекопитающего. Классическим примером данных процессов может служить высокая степень приспособленности к паразитированию в лабораторных грызунах эталонного европейского штамма T. spiralis.
Полученные результаты позволяют предположить, что использование в ИФР антигена так называемого «эталонного» европейского штамма T. spiralis для серологического мониторинга в природных очагах трихинеллеза на северных территориях РФ вряд ли позволит получить объективные данные по эпидемиологии трихинеллеза.
Таким образом, результаты эксперимента показывают, что при изучении клинических и биологических особенностей течения «природного» трихинеллеза, а также применение антигена, полученного в результате культивирования инвазионных личинок эталонного лабораторного штамма трихинелл для оценки сероэпидемиологической ситуации в очагах этого природного антропозооноза может привести к недостоверным результатам. Вероятно, следует провести масштабные сравнительные испытания ИФТС с вышеуказанными антигенами и соответствующим набором сывороток крови, а также вывести поправочный коэффициент для скрининговых обследований в очагах природного трихинеллеза, в том числе и на Крайнем Севере РФ.
Литература
1. Букина Л.А. Экологические закономерности циркуляции трихинелл на морских побережьях Чукотки // Мед. паразитол. и паразит. бол. - М., 2010. -№ 4. - С. 39-42.
2. Букина Л.А., Полетаева О.Г. Современная эпидемическая ситуация по трихинеллезу на территории Чукотского района Чукотского автономного округа // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. - 2011. - № 6 (25). - С. 58-62.
3. Одоевская И.М. Диагностическая эффективность экскреторно-секреторных антигенов трихинелл в иммуноферментной реакции // Мед. парази-тол. и паразит. бол. - М., 2007. - № 4. - С. 19-24.
4. Пашук В.П., Бабин А.Ф., Черемицкая М.В. Комплексная оценка эпидемической ситуации по трихинеллезу с учетом персистенции и иммуносупрес-сии возбудителей // Матер. 5-й Всес. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. - Новочеркасск, 1988. - С. 138-140.
5. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н. Эффективность серологических реакций с соматическим антигеном Trichinella spiralis в диагностике трихинеллеза человека, вызываемом при заражении природными синатропными изо-лятами трихинелл // Мед. паразитол. и паразит. бол. - М., 1995. - № 2. - С. 33-35.
6. Полетаева О.Г., Старкова Т.В., Коврова Е.А. и др. Серологические методы в оценке пораженности тканевыми гельминтами детей в экстремальных природных условиях Севера // Мед. паразитол. и паразит. бол. - М., 1998. - № 3.- С. 29-32.
7. Степанова Т.Ф., Пекло Г.Н., Филатов В.Г., Скареднов Н.И. Особенности эпидемиологии трихинеллеза в Тюменской области // Матер. докл. 7-й
науч. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. - М., 1996. - С. 95-98.
8. Bohm J. Epidemiology of trichinellisis in Greenland. In Kim CW, editor. Trichinellosis. Proseedings of the Sixth International Conference on Trichinellosis (Val-Morin, Quebek), Flbany, NY: State University of New York Press, 1985. - Р. 268-273.
9. Eaton R.D. Trichinellosis in the Arctic // Can. Med. Assoc. J. - 1979. - V.-120 (1). - Р. 22.
10. Gajadhar A.A., Forbes L.B. A 10-year wildlife survey of 15 species of Canadian carnivores identifies new hosts or geographic locations for Trichinella genotypes T2, T4, T5 and T6 // Vet. Parasitol. - 2010. - V. 168, № 1. - Р. 78-83.
11. Gottstein B., Pozio E., Nockler K. Epidemiology, diagnosis, treatment and control of trichinellosis // Clin. Microbiol. Rev. - 2009. - V. 22, № 1. - Р. 127145.
12. Kapel CMTrichinella in arctic, subarctic and temperate regions: Greenland, the Scandinavian countries and the Baltic States // Southeast Asian J. Trop. Med. Public. Health. - 1997. - V. 28, № 1. - Р. 14-19.
13. MacLean J.D., Poirier T.W., Gyorkos J.F. et al. Epidemiologic and serologic definition of primary and secondary trichinosis in the Arctic // J. Infect. Dis. - 1992. - V. 169, № 5. - Р. 908-912.
14. MacLean J.D., Viallet J., Law C., Staudt M. Trichinosis in the Canadian Arctic: report of five outbreaks and a new clinical syndrome // J. Infect. Dis. -1989. - V. 160, № 3. - Р. 513-520.
15. Malakauskas A., Kapel C.M. Tolerance to low temperatures of domestic and sylvatic Trichinella spp. in rat muscle tissue // J. Parasitol. - 2003. - V. 89, № 4. - Р. 744-748.
16. Margolis H.S., Middaugh J.P., Burgess R.D. Arctic trichinellosis: two Alaskan outbreaks from walrus meat // J. Infect. Dis. - 1979. - № 139. - Р. 102105.
17. Pozio E., Zarlenga D.S. Recent advances on the taxonomy, systematics and epidemiology of Trichinella // Int. J. Parasitol. - 2005. - V. 35, № 11-12. - Р. 1191-1204.
18. Serhir B., MacLean J.D., Healey S. et al. Outbreak of trichinellosis associated with arctic walruses in northern Canada, 1999 // Can. Commun. Dis. Rep. - 2001. - V. 27, № 4. - Р. 31-36.
19. Forbes L.B. The occurrence and ecology of Trichinella of marine animals // Vet. Parasitol. - 2000. - V. 93. - P. 321-334.
Efficiency of immunoenzyme reactions with use antigens from larva European strain Trichinella spiralis and Arctic strain T. nat^а at serological monitoring in the centers of trichinellosis in Northern territories of the Russian Federation
I.M. Odoevskaja
Comparative tests of diagnostic efficiency in IER excretory-secretory antigens of Trichinella spiralis and T. nativа with blood serum of mice experimentally infected by Trichinella spp., allocated of muscles of wild carnivores are carried out. It is shown that at use of antigen from larva T. nativa in IER for the analysis of level of specific antibodies at animals infected by Trichinella spp., circulating in natural biocenosis of Far North, efficiency of the test considerably raises.
Keywords: trichinellosis, Trichinella spiralis, T. nativа, immunoenzyme reaction, excretory-secretory antigens.
