CC BY
312
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 3, с. 361-368
Экологические основы создания микробных препаратов
УДК 632.937:579.64:579.26 doi:10.15389/agrobiology.2015.3.361rus
ЭФФЕКТИВНОСТЬ БАЦИКОЛА НА ОСНОВЕ НОВОГО ШТАММА Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 ПРОТИВ ВРЕДИТЕЛЕЙ-ФИТОФАГОВ И ФИТОПАТОГЕНОВ*
С.Д. ГРИШЕЧКИНА, В.П. ЕРМОЛОВА
Получение экологически чистой продукции — одна из важных задач сельского хозяйства. Для производства биологических препаратов, патогенных для насекомых-вреди-телей, используют микроорганизмы различного происхождения. Наибольший интерес представляют препараты, изготовленные на основе энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis (Bt), обладающих селективностью действия, безопасностью для человека, теплокровных животных, полезных насекомых и окружающей среды. В Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ, г. Санкт-Петербург— Пушкин) хранятся бактерии Bt, у которых изучены культурально-морфологические, физиолого-биохимические, технологические, энтомоцидные и другие свойства. Один из приоритетных штаммов коллекции — B. thuringiensis var. darmstadiensis (BtHio) № 25, служащий основой препарата бацикол, обладающего специфическим действием на жесткокрылых насекомых, а также антигрибной активностью по отношению к ряду фитопатогенных грибов. Штамм BtHio № 25 депонирован в коллекции ВКСМ под регистрационным номером RCAM 01490 (патент на изобретение № 2514023, 2014). Для получения качественного препарата с максимальным накоплением экзотоксина и высоким титром необходимо создать оптимальные условия культивирования и усовершенствовать рецептуры питательных сред для микроорганизмов-продуцентов. Цель наших исследований заключалась в том, чтобы подобрать питательные среды, отработать режимы культивирования (аэрация, температура, рН, дозы, формы и возраст посевного материала) штамма BtHi0 № 25 и определить его технологичность, энтомоцидную и антифунгальную активность, а также степень экзотоксинообразования на тест-объектах. Наилучшие показатели были получены на среде с гороховой мукой, заменяющей соевую: титр спор в культуральной жидкости — 4*109/мл, активность для комнатной мухи (содержание экзотоксина) в ЛК50 — 3,1 мкл/г корма, ингибирующая активность для Fusarium oxysporum — 70,0 %, для Botrytis cinerea — 75,0 %. Установлено, что для накопления препарата можно использовать ячменную, овсяную муку и смеси соевой и ячменной муки. Оптимальное развитие культуры наблюдалось при соотношении объема среды к воздуху 1:30 и 1:15, рН питательной среды 6,65-7,20. В качестве посевного материала можно использовать культуральную жидкость и смыв споровой культуры. Лабораторная и полевая оценка препарата выявила его высокую эффективность против вредителей-фитофагов (79100 %) и фитопатогенов (70-90 %). Так, активность штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против личинок листоедов на разных культурах в 1,3-1,4 раза превосходила активность штамма-прототипа B. thuringiensis var. darmstadiensis № 109.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, штамм, бацикол, питательные среды, эффективность.
Основная цель биологизации защиты растений состоит в стабильном получении полноценной и экологически безопасной сельскохозяйственной продукции, обеспечивающей восполнение ресурсов биосферы (1). Для производства биологических препаратов, патогенных для насекомых — вредителей сельскохозяйственных культур, используют микроорганизмы различного происхождения. В настоящее время интенсивно разрабатывается направление по применению бактерий, выполняющих фитозащитные функции. Так, патогенными свойствами в отношении вредных насекомых-фитофагов и фитопатогенов обладают бактерии из рода Bacillus (2-14). Среди микробиологических средств защиты растений лидерство принадлежит биопрепаратам, созданным на основе Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) (1). В отличие от ядохимикатов эти препараты обладают селективным,
* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 14.604.21.0024, RFMEFI60414X0024).
361
специфически избирательным действием только на насекомых-вредителей. Особенно важно, что они безвредны для человека, теплокровных животных, полезных насекомых и окружающей среды (15-17).
Отметим, что спорообразующие бактерии Вt — наиболее распространенные агенты микробиологического контроля численности насекомых. Препараты на их основе содержат следующие действующие вещества: споры, кристаллический эндотоксин белковой природы, метаболиты, в некоторых случаях — термостабильный экзотоксин.
Во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург—Пушкин) созданы биопрепараты энтомопатогенного действия: битоксибациллин — на основе B. thuringiensis var. thuringiensis (ВШД, который используется преимущественно против чешуекрылых (1); бацикол — на основе B. thuringiensis var. darmstadiensis (ВШю), обладающий специфическим действием на жесткокрылых (18), а также антигрибной активностью по отношению к ряду фитопатогенных грибов (19); бактокулицид — на основе B. thuringiensis var. israelensis (ВШ14), высокоэффективный против комаров, мошек, рисового и шампиньонного комариков (20, 21).
Разработке биопрепаратов предшествовали исследования по поиску, выделению, идентификации бацилл группы thuringiensis. Выделенные штаммы, у которых изучены культурально-морфологические, физиологобиохимические, технологические, энтомоцидные и другие свойства, хранятся в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ, г. Cанкт-Петербург—Пушкин). Они представляют коммерческий интерес и могут быть использованы в качестве продуцентов биопрепаратов для контроля численности вредителей сельскохозяйственных растений.
Один из приоритетных штаммов коллекции — штамм B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25, выделенный из трупов колорадского жука в Ленинградской области и служащий продуцентом микробиологического препарата бацикол. Он депонирован в коллекции ВКСМ под регистрационным номером RCAM01490 (22).
В процессе разработки биопрепаратов необходимо создавать и совершенствовать рецептуры питательных сред для микроорганизмов. Кроме того, для получения качественного препарата требуется оптимизация аэрации, температуры, рН, а также правильные дозы, формы и возраст посевного материала.
Целью настоящего исследования был подбор питательных сред, отработка оптимальных режимов культивирования штамма Bacillus thur-ingiensis var. darmstadiensis № 25, определение его технологичности, энтомо-цидной активности, содержания экзотоксина и антифунгального действия.
Методика. Для культивирования штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 готовили питательные среды различного состава (pH до стерилизации 7,4-7,6), разливали в колбы Эрленмейера по 40-50 мл, стерилизовали в автоклаве при температуре 125 °С в течение 30 мин. После стерилизации рН составляла 6,8-7,2. Охлажденную до 30-35 °С питательную среду засевали культурой, выращенной на скошенном рыбном агаре (РА), и культивировали в колбах на качалке при 220 об/мин и температуре 29 °С в течение 56-70 ч до полного созревания, образования спор и кристаллического эндотоксина.
Определение числа клеток и энтомоцидной активности, выраженной в ЛК50 для личинок колорадского жука Leptinotarsa deсemlineata Say. природной популяции, а также содержания экзотоксина, выраженного в
362
ЛК50 для личинок комнатной мухи Musca domestica Linn., осуществляли согласно методике (23).
Антифунгальную активность B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 изучали в чашках Петри с использованием метода агаровых блоков (24). Тест-культурами служили грибы Fusarium oxysporum и Botrytis cinerea. Культуральную жидкость B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 (концентрация 5 %) вносили в расплавленную среду Чапека, охлажденную до 40 °С, и разливали в чашки Петри. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 10-суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Диаметр колоний гриба измеряли через 5 сут. Ингибирующую активность B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 рассчитывали по формуле Аббота (25):
Дк - До
Степень ингибирования роста колоний гриба = - х 100,
Дк
где Дк и До — диаметр колонии гриба соответственно в контроле и опыте, см.
Лабораторные опыты по определению инсектицидной активности препарата в отношении рапсового, капустного, хренового, восточного горчичного, ильмового листоедов (Chrysomelidae) проводили следующим образом. Препарат разводили дистиллированной водой до концентраций 1,0; 0,2 и 0,04 % и обрабатывали им листья рапса, хрена, горчицы, капусты, ильма. После подсушивания черенки листьев закрывали влажным ватным тампоном, помещали в пенициллиновые флаконы с водой и переносили в кристаллизаторы. В каждом варианте опыта на листья сажали по 25 личинок соответствующего вида листоеда, кристаллизаторы закрывали бязевой салфеткой (повторность по вариантам 3-кратная). Инсектицидность оценивали по концентрации препарата, вызывающей гибель 50 % личинок (ЛК50) на 5-е сут опыта.
Полевые опыты проводили в разных областях Российской Федерации против ряда вредителей-фитофагов на различных растениях.
На картофеле против колорадского жука испытания проводили в хозяйствах Ленинградской, Новосибирской областей и Ставропольского края. Посадки картофеля площадью 200 м2, заселенные колорадским жуком, обрабатывали препаратом из расчета 12 л/га и расходом рабочей жидкости 400 л/га. Учеты осуществляли на 25 растениях, отобранных по диагонали участка, до обработки и на 5-10-е сут после нее.
В Ленинградской области на участках площадью 100 м2 обрабатывали землянику сорта Полка в период выдвижения бутонов. Норма применения препарата — 10 л/га. Поврежденность бутонов землянично-малинным долгоносиком учитывали до обработки, а также на 10-е и 20-е сут на 25 растениях. Поражение ягод серой гнилью оценивали на 20-е сут.
В Ленинградской, Новосибирской, Волгоградской областях испытывали эффективность препарата против крестоцветных блошек, капустного листоеда и капустной совки на участках площадью 50 м2 на брюкве, рапсе, горчице, капусте. Норма применения препарата — 10 л/га. Учеты проводили до обработки, на 5-е и 10-е сут после нее. Просматривали по 20 растений и подсчитывали процент заселенных.
Биологичекую эффективность препарата рассчитывали по формуле Аббота (25).
Математическую обработку полученных данных проводили по Б.А. Доспехову (26).
Результаты. Подбор оптимизированных сред с учетом особенно-
363
стей культивируемого организма необходим для его наилучшего роста и биосинтеза продуктов жизнедеятельности. Специфика отдельных компонентов имеет существенное значение для развития культуры и образования энтомотоксичных метаболитов. Исследованиями, проведенными Н.В. Кандыбиным с соавт. (1), было установлено, что наибольшая энто-моцидная активность штамма-продуцента бацикола проявляется при культивировании на средах с соевой мукой, дрожжами кормовыми, крахмалом кукурузным, а также на среде с сахарозой и мелассой.
1. Титры спор и содержание экзотоксина в образцах препарата на основе штамма Bacillus thuiingiensis var. darmstadiensis № 25 в зависимости от источника азотного питания (M±m, лабораторный опыт)
Источник азота Титр спор, х109/мл культуральной жидкости Содержание экзотоксина, ПК50, мкл/г корма для Musca domestica
Соевая мука 3,40±0,10 3,20±0,20
Ячменная мука Гречневая мука + белково-витаминный 2,70±0,20 2,87±0,10
концентрат 1,96±0,20 3,30±0,10
Гороховая мука 4,00±0,10 3,10±0,10
Овсяная мука 3,10±0,20 3,36±0,15
Экстракт соевой муки 1,20±0,20 3,51±0,15
Соевая мука + гречневая мука 2,30±0,10 2,96±0,10
Соевая мука + ячменная мука 2,90±0,10 2,90±0,20
В наших опытах с B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 мы испытывали разные источники азотного питания — муку ячменную, гороховую, гречневую, овсяную, соевую (23 %) (табл. 1, рис.). В качестве источника углерода использовали кукурузный крахмал.
Наилучшие показатели были получены на среде с гороховой мукой, заменяющей соевую: титр спор в культуральной жидкости (КЖ) — 4*109/мл, активность для комнатной мухи (содержание экзотоксина) в ЛК50 — 3,1 мкл/г корма, ингибирующая активность в отношении F oxysporum — 70,0 %, B. cine-rea — 75,0 %.
Достаточно высокие показатели были зарегистрированы на средах, приготовленных с использованием ячменной, овсяной муки и смесей соевой муки с гречневой и ячменной. Титр спор в КЖ находился в пределах 2,3*109-3,1х109/мл, содержание экзотоксина 2,87-3,36 мкл/г корма. Ингибирующая активность в отношении F oxysporum составляла 39,5-65,0 %, B. cinerea — 42,4-69,2 %.
Дальнейшие исследования по подбору режимов культивирования штамма ВШдо № 25 проводили с использованием среды с гороховой мукой.
Степень аэрации при культивировании Bt в колбах на качалках за-
Антагонистическая активность образцов препарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 в отношении Fusarium oxysporum (а) и Botrytis cinerea (б) в зависимости от источника азотного питания: 1 — соевая мука, 2 — ячменная мука, 3 — гречневая мука + белково-витаминный концентрат, 4 — гороховая мука, 5 — овсяная мука, 6 — экстракт соевой муки, 7 — соевая мука + гречневая мука, 8 — соевая мука + ячменная мука (лабораторный опыт).
364
висит от числа оборотов качалки в минуту и от соотношения объема среды к воздуху в колбе. В наших опытах объем среды в колбах емкостью 750 мл варьировал от 25 до 200 мл. Оптимальное развитие культуры наблюдалось при соотношении объема среды к воздуху 1:30 и 1:15 (25 и 50 мл среды в колбе).
Изменения активной кислотности (рН) среды могут зависеть как от ее состава, так и от физиологических особенностей. Мы установили, что максимальный титр спор (3,2»109-4,02х109/мл) обеспечивала питательная среда с рН 6,65-7,2, что согласуется с данными О.А. Дрегваль (27) и Y. Icgen (28).
При изучении влияния дозы, формы и возраста посевного материала на продуктивность штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 использовали объем питательной среды 50 мл. В качестве посевного материала применяли смыв с 7-суточной споровой культуры, выращенной на скошенном рыбном агаре; споровую культуральную жидкость; смыв культуры разного возраста (3-30 сут) с РА.
Доза посевного материала в пределах 0,1-0,5 мл на 50 мл среды, что соответствовало 0,2-1,0 %, не оказывала существенного влияния на продуктивность штамма. Культуру в возрасте от 3 до 30 сут можно было использовать в качестве посевного материала без технологических потерь. Наши данные совпадают с результатами исследований Н.М. Барбашовой и М.Г. Чеверды для B. thuringiensis var. thuringiensis (29).
На основе штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 были созданы опытные образцы препарата, проверенные в лабораторных экспериментах. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют об эн-томоцидной активности штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против личинок листоедов. При этом активность штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 в 1,3-1,4 раза превосходила активность штамма-прототипа B. thuringiensis var. darmstadiensis № 109.
2. Инсектицидная активность штаммов Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 в отношении разных видов листоеда (M+m, лабораторный опыт)
ЛК50 (%) для личинок листоедов на 5-е сут после обработки
Штамм- продуцент восточный горчичный листоед (Co-laphellus hofti Men.) рапсовый цветоед (Meligethes aene-us F.) капустный листоед (Phaedon coch-leariae F.) ильмовый листоед (Хanthogalemca luteola Midler.)
BtH10 № 25 BtH10 № 109 0,062±0,012 0,086±0,020 0,056±0,010 0,077±0,015 О О О О OX Lrt -Щ о 1+ 1+ о о о о LO о 0,070±0,015 0,090±0,020
Оценка эффективности препарата на основе штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25, проведенная в полевых условиях против вредите-лей-фитофагов, показала его высокую инсектицидную активность (табл. 3).
3. Эффективность жидкого бацикола на основе штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против вредителей-фитофагов (разные регионы Российской Федерации, 2000-2012 годы)
Вид насекомого-вредителя Культура Биологическая эффективность, %
Колорадский жук (Leptinotarsa decemlneata Say.) Картофель 96-100
Крестоцветные блошки комплекса видов из рода Phyllotreta Капуста 94-98
Восточный горчичный листоед (Colaphelushofti Men.) Горчица 98
Хлебная полосатая блошка (Phyllotreta vittula Redt.) Яровые зерновые 92
Злаковая пьявица (Oulema melanopus L.) Зерновые 82-100
Рапсовый цветоед (Meligethes aeneus F.) Рапс 79-86
Капустный листоед (Phaedon cochleariae F.) Капуста 84-99
Ильмовый листоед (Xanthogaleruca luteola Midler.) Капуста 89-93
Трипсы (Thysanoptera) Цветочные культуры 80-90
Примечание. Районы проведения опытов см. в разделе «Методика».
365
Ранее в опытах in vitro мы установили антифунгальное действие препарата на основе B. thuringiensis var. darmstadiensis в отношении патогенных грибов Botrytis cinerea, разных видов рода Fusarium, Rhizoctonia, Bipolaris sorokiniana, Alternaria sp. и др. Антифунгальная активность также подтверждена полевыми испытаниями (19).
В настоящей работе в полевых экспериментах была показана полифункциональная активность препарата на основе штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против землянично-малинного долгоносика An-thonomus rubi и серой гнили Botrytis cinerea (табл. 4).
4. Эффективность препарата (доля пораженных растений) на основе Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против Anthonomus rubi и Botrytis cinerea на землянике сорта Полка (Лениградская обл., 2013 год)
Землянично-малинный долгоносик Серая гниль
Вариант 10-е биологическая 20-е биологическая 20-е биологическая
сут эффективность, % сут эффективность, % сут эффективность, %
BtH10 № 25 4,8 79,3-81,0 7,9 66,5-69,3 4,0 85,2-89,2
Контроль
(без обработки) 17,1 25,1 37,1
Таким образом, проведенные лабораторные и полевые опыты подтвердили высокую эффективность (79-100 %) препарата бацикол на основе нового штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против жесткокрылых фитофагов и фитопатогенов на различных сельскохозяйственных культурах, а также его высокую антифунгальную активность. Для штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 разработаны оптимальные режимы культивирования, его технологичность на среде с гороховой мукой составляет 4*109 спор/мл культуральной жидкости. Следует отметить, что в условиях дефицита биопрепаратов наиболее перспективно направление разработки микробиологических препаратов с полифункциональными свойствами.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., ПатыкаВ.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis. СПб— Пушкин, 2009.
2. Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Полифункциональное действие Bacillus thuringiensis Berliner. Сельскохозяйственная биология, 2011, 3: 123-126.
3. Zhong C.H., Ellar D.J., Bishop A., Jonson C., Lin S.S., Hart E.R. Characterization of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin which is toxic to insects in three orders. J. Invertebrate Pathol., 2000, 76: 131-139.
4. Yoshida S., Hiradate S., Tsukamoto T., Hatakeda K., Shirata A. Antimicrobial activity of culture filtrate of Bacillus amyloliquefaciens Rc-2 isolated from mulberry leaves. Phythopathol., 2001, 91: 181-187(doi: 10.1094/PHYTO.2001.91.2.181).
5. Knaak N., Rohr A., Fiuza L. In vitro effect of Bacillus thuringiensis strains and Cry proteins in phytopathogenic fungi of paddy rice-field. Brazil. J. Microbiol., 2007, 38(3): 526-530 (doi: 10.1590/S1517-83822007000300027).
6. Mojica-Marin V., Luna-Olvera H., S a n d o v a l - C o r o n a d o C., Pereyra-Abferer B., Moreles-Ramos L., H e r n a nd e z - Lu n a C., Alvardo-Gom-ez O. Antagonistic activity of selected strains of Bacillus thuringiensis against Rhizoctonia so-lani of chili pepper. Afr. J. Biotechnol., 2008, 7(9): 1271-1276.
7. Heydari A., Pessarakli M. A review on biological control of fungal plant pathogens using microbial antagonists. J. Biol. Sci., 2010, 1(4): 273-290 (doi: 10.3923/jbs.2010.273.290).
8. Pane C., Villecco D., Campanile F., Zaccardelli M. Novel strains of Bacillus, isolated from compost and compost-amended soils, as biological control agents against soil-borne phytopathogenic fungi. Biol. Sci. Technol., 2012, 22(12): 1373-1388 (doi: 10.1080/09583157.2012.729143).
9. Akram W., Mahboot A., Javed A. Bacillus thuringiensis strain 199 can induce systemic resistance in tomato agains Fusarium wilt. Eur. J. Microbiol. Immunol., 2013, 3: 275-280 (doi:
366
10.1556/EuJMI.3.2013.4.7).
10. Tao A., Pang F., Huang S., Yu G., Li B., Wang T. Characterisation of endophytic Bacillus thuiingiensis strains isolated from wheat plants as biocontrol agents against wheat flag smut. Biocontrol Sci. Tecnol., 2014, 24(8): 901-924 (doi: 10.1080/09583157.2014.904502).
11. Аrora N., Agrawal N., Yerramilli V., Bhatnagar R.K. Biology and applications of Bacillus thuiingiensis in intergrated pest anagement. Integated Management of Plant Pest and Distasis, 2007, 01: 227-244 (doi: 10.1007/978-1-4020-6061-8_9).
12. Liu Q., Roh J.Y., Wang Y., Choi J.Y., Tao X.Y., Kim J.S., Je Y.H. Construction and characterisation of an antifungal recombinant Bacillus thuiingiensis with an expanded host spectrum. J. Microbiol., 2012, 50(5): 874-877 (doi: 10.1007/s12275-012-2201-7).
13. Raddadi N., Cherif A., Ouzari H., Marzorati M., Brusetti L., Bou-dabous A., Daffonchio D. Bacillus thuiingiensis beyond insect biocontrol: plant growth promotion and biosafety of polyvalent strains. Annals of Microbiology, 2007, 57(4): 481-494 (doi: 10.1007/BF03175344).
14. Narayanasamy P. Mechanisms of action of bacterial biological control agents. In: Biological management of diseases of crops. Progress in Biological Control (Book 15). Springer, 2013: 295-429 (doi: 10.1007/978-94-007-6380-7_5).
15. Гулий В.В., Лескова А.Я., Мурза В.И. Штерншис М.В., Иванов Г.М. Вопросы безопасности микробиологических препаратов для здоровья человека и окружающей среды. Информационный бюллетень ВПС МОББ, 1986, 7: 17-45.
16. Рахманин Ю.А., Новиков С.М., Румянцев Г.И., Иванов С.И. Оценка ущерба здоровью человека как одно из приоритетных направлений экологии человека и инструмент обоснования управленческих решений. Гигиена и санитария, 2006, 5: 10-13.
17. Siegel J.P. The mammalian safety Bacillus thuiingiensis based insecticides. J. Invertebrate Pathol., 2001, 77: 13-21 (doi: 10.1006/jipa.2000.5000).
18. Кандыбин Н.В., Смирнов О.В., Барбашова Н.М. Новый энтомоцидный препарат со специфическим действием на жесткокрылых. Мат. Всерос. науч.-произв. совещания (Краснодар, 1994). Пущино, 1994, ч. 2: 179-181.
19. Гришечкина С.Д., Смирнов О.В., Кандыбин Н.В. Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillus thuiingiensis. Микология и фитопатология, 2002, 36(1): 58-62.
20. Ермолова В.П., Кандыбин Н.В. К вопросу регионального производства биопрепаратов на основе Bacillus thuiingiensis. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Биологическая защита растений — основа стабилизации агроэкосистем». Краснодар, 2006, вып. 4: 255-256.
21. Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Стусь А.А. Восприимчивость рисового комарика (Ciicotopus silvestiis Fubr.) к микробным препаратам. Мат. Всес. конф. по микробным средствам защиты растений. Велегож, 1989: 310.
22. Тихонович И.А., Гришечкина С.Д., Ермолова В.П., Романова Т.А. Штамм Bacillus thuiingiensis var. daimstadiensis № 25 в качестве средства комплексного воздействия на вредных жесткокрылых насекомых и фитопатогенные грибы. Патент. СПб, ГНУ ВНИИ сельскохозяйсвтенной микробиологии RU № 2514023 С1, 2014. Заявл. 26.12.12. Опубл. 27.04.14. Бюл. № 12.
23. Гришечкина С.Д., Ермолова В.П., Минина Г.Н., Сафронова В.И., Болотова Е.В. Методика. Коллекция штаммов бактерий — симбионтов вредных насекомых и грызунов, пригодных для биоконтроля численности вредителей сельскохозяйственных растений. СПб, 2014.
24. Методы экспериментальной микологии /Под ред. В.И. Билай. Киев, 1982.
25. Abbott W.S. A method for computing the effectiveness of insecticide. Econom. Entomol., 1925, 18: 265-287 (doi: 10.1093/jee/18.2.265a).
26. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М., 1973.
27. Дрегваль О.А., Черевач Н.В., Винников А.И. Подбор оптимальных режимов кислотности среды и аэрации при глубинном культивировании Bacillus thuiingiensis и Bave-iia bassiana. Вгсник Дтпропетровського ушверситету. Бюлопя, еколопя, 2010, 1(18): 15-19.
28. Icgen Y., Icgen B., Ozcengiz G. Regulation of crystal protein biosynthesis by Bacillus thuiingiensis: I. Effects of mineral elements and pH. Res. Microbiol., 2002, 153(9): 599-604.
29. Барбашова Н.М., Чеверда М.Г. Влияние дозы и возраста посевного материала на развитие культуры Bacillus thuiingiensis var. thuiingiensis штамма 202. В сб.: Бактериальные средства и методы борьбы с насекомыми и грызунами. Л., 1972: 37-41.
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию
микробиологии, 30 марта 2015 года
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, е-mail: [email protected]
367
Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 3, pp. 361-368
EFFICIENCY OF BATSIKOL BASED ON A NEW STRAIN Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 FOR BIOCONTROL OF PHYTOPHAGOUS PESTS AND PHYTOPATHOGENS
S.D. Grishechkina, V.P. Ermolova
All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 3, sh. Podbel’skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail [email protected]
Supported by the Ministry of Education and Sciences of the Russian Federation (Agreement № 14.604.21.0024, RFMEFI60414X0024)
Received March 30, 2015 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.361eng
Abstract
Environmentally friendly products are one of the most important tasks in agriculture. Microorganisms of different origin are used for the production of biological preparations pathogenic to pests. The preparations based on entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) are of the most interest due to their selective action, safety for humans, warm-blooded animals, beneficial insects and the environment. The departmental collection of beneficial microorganisms for agricultural purposes (RCAM collection, St. Petersburg) stores B. thuringiensis with known cultural, morphological, physiological, biochemical, technological, insecticidal and other properties. One of the priorities of collection strains is B. thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10) № 25, which bases the preparation Batsikol and has a specific effect on Coleoptera and antifungal activity against a number of pathogenic fungi. Strain BtH10 № 25 deposited in the RCAM collection under registration number 01490 RCAM (patent № 2514023, 2014). To obtain qualitative preparation with a maximum accumulation of exotoxin and high titer we need to create optimal conditions for cultivation and improve the formulation of nutrient media for microorganisms-producers of biological preparations. The objective of our research was to choose nutrient medium, work out cultivation regimes (aeration, temperature, pH, dosage, form, and age of inoculum) of strain BtH10 № 25, and to determine its technological effectiveness, insecticidal and antifungal activity as well as the extent of exotoxin formation in test objects. The best results were obtained in the pea flour medium, instead of soy flour: spores titer in liquid culture was 4x109/ml, activity to housefly (exotoxin content) was LC50 3.1 mkl/g feed, the inhibitory activity was 70.0 % to Fusarium oxysporum and 75.0 % to Botrytis cinerea. It was found that barley, oat flour, and mixtures of soybean and barley flour could be used for the preparation production. The optimal development of the culture was observed at a ratio of medium volume-to-air from 1:30 to 1:15, and pH of the nutrient medium 6.65-7.20. Liquid culture media and the spore culture rinse can be used as an inoculum. Laboratory and field evaluation of preparation revealed its high efficiency against phytophagous pests (79-100 %) and plant pathogens (70-90 %). Thus, the activity of the strain B. thuringiensis var. darmstadiensis № 25 against the larvae of beetles on different crops is 1.3-1.4 times higher than the activity of strain B. thuringiensis var. darmstadiensis № 109.
Keywords: Bacillus thuringiensis, strain, batcikol, nutrient solutions, efficiency.
Научные собрания
НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ И ШКОЛА МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ»,
посвященная 125-летию Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
(23-27 ноября 2015 года, г. Москва, ИФР РАН)
Организаторы: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Общество физиологов растений России, Научный совет по физиологии растений и фотосинтезу РАН
Тематика:
■ Регуляция экспрессии генома и трансдукция сигналов в процессах клеточной диф-ференцировки и онтогенеза растений
■ Физиология, биохимия и экология фотосинтеза, дыхания и фиксации азота как теоретическая основа продукционного процесса
■ Молекулярные и физиологические основы адаптации растений в связи с экологическими стрессами и глобальными биосферными явлениями
■ Биология фототрофных и гетеротрофных клеток растений как основа развития инновационных биотехнологий
Контакты и информация: [email protected], http://www.ofr.su/ifr125
368
