CC BY
0ШКОЛА-КОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ
ФИЗИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ ПРИЛОЖЕНИИ
Эффективное возбуждение и регистрация единичных флуоресцентных молекул в волноводе нулевой моды (ZMW)
Сафонова А.М.1,2, Калмыков А.С.1, Гритченко А.С.1
1 - Институт спектроскопии Российской академии наук, Москва, Троицк 2 - Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики», Москва
Е-mail: amsafonova 1@edu.hse.ru
DOI: 10.24412/cl-35673-2024-1-204-206
Оптическое обнаружение и визуализация одиночных атомов и молекул являются одними из значимых задач нанофотоники. Их решение имеет огромное научное и практическое значение для исследования эффектов квантовой электродинамики [1], разработки одномолекулярных устройств [2], визуализации биологических тканей [3], наблюдения за кинетикой химических реакций внутри клетки [4], исследования внутриклеточной динамики биомолекул [5] и многих других приложений [6].
Рис. 1: а) СЭМ (сканирующая электронная микроскопия) фотография б)-г) — схематическое изображение образца при реализации схем возбуждения под различными углами.
Регистрация флуоресценции единичной молекулы является довольно деликатным измерением, так как требует тщательного выбора интенсивности лазерного излучения, времени экспозиции, подбора схемы возбуждения и т.д. Основным подходом в улучшении регистрации слабых оптических сигналов является снижение
_ SÄSraSS 22-24 октября 2024 г.
А -ПРОКОРОВСКИЕ НЕДЕЛИ-
паразитной засветки. Один из наиболее подходящих подходов для детектирования флуоресценции единичных молекул основан на использовании наноструктур, изготовленных в непрозрачной металлической плёнке — так называемых волноводов нулевой моды (zero mode waveguide, ZMW) [7]. ZMW наноструктуры представляют собой наноотверстия диаметром порядка 100 нм, изготовленные в оптически непрозрачной металлической пленке, толщиной около 100 нм (рис. 1а).
Несмотря на большое количество работ, в которых используются ZMW, вопрос эффективного возбуждения и регистрации флуоресценции единичных молекул в ZMW до сих пор остаётся открытым. В настоящей работе представлены результаты поисковых исследований эффективного возбуждения и регистрации флуоресценции единичных молекул ROX (Rhodamine X) в ZMW диаметром 100 нм изготовленных в плёнке алюминия толщиной 100 нм на основе измерения пропускания света через ZMW (рис. 2а) и измерения флуоресценции молекул в трех схемах возбуждения и регистрации: (1) эпифлуоресцентная схема, (2) возбуждение под углом вблизи угла полного внутреннего отражения света, (3) возбуждение под скользящим углом (рис. 1 б-г).
Как показали результаты измерений, выбор условий для оптической микроскопии единичных молекул в ZMW является критически важным при проведении измерений с большим числом ZMW одновременно (так называемые параллельные измерения). Так, увеличение диаметра лазерного луча позволяет увеличить количество ZMW в которых производятся измерения. Однако, это приводит к катастрофическому росту паразитной люминесценции. Например, в классической эпифлуоресцентной схеме лазерный луч проходит через объектив микроскопа, что приводит к возникновению автофлуоресценции, так что при диаметре луча 300 мкм сигнал флуоресценции от единичных молекул становится сравним с фоновой засветкой (рис. 2б).
Переход к схеме возбуждения под углом позволяет избавиться от паразитной автофлуоресценции объектива, что приводит не только к увеличению соотношения сигнал/шум и проведению большего количества параллельных измерений, но и к возможности детектировать более низкие концентрации аналита.
ФИЗИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ ПРИЛОЖЕНИЙ
а> ——- б)
1 о -
р-лоляризация s-поляризация
■ 0°
• 65° - р-поляриэация л 65° - s-поляризация
то-
го
40
60
80
50 100 150 200 250 300 Диаметр лазерного луча (мим;
Угол падения лазерного излучения (")
Рис. 2: а) Прохождение света различной поляризации через ZMW диаметром 100 нм в зависимости от угла падения лазерного излучения, б) соотношение сигнал/шум в различных схемах возбуждения и регистрации
молекул в зависимости от диаметра и поляризации лазерного луча, сплошные линии - линейная аппроксимация экспериментальных данных.
Проведённые измерения позволили достигнуть высокой эффективности измерения флуоресценции единичных молекул, позволяя измерять кинетики их взаимодействия с поверхностью.
Авторы выражают благодарность Мелентьеву П.Н. и Балыкину В.И. за постановку научной задачи, помощь в измерениях и обсуждение результатов. Исследования проведены при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 23-42-00049.
1. K.P. Nayak, P.N. Melentiev, M. Morinaga, et al., Opt. Express. 2007, 15, 9.
2. J.F. Rossier, Nature Materials. 2013, 12, 480.
3. J.G. Ritter, R. Veith, A. Veenendaal, et al., PLoS ONE. 2010, 5, e11639.
4. T. Yanagida and Y. Ishii, Single Molecule Dynamics in Life Science (John Wiley & Sons, 2008).
5. V. Levi and E. Gratton, Cell Biochemistry and Biophysics. 2007, 48, 1.
6. J. Zlatanova and K. Van Holde, Molecular Cell. 2006, 24, 317.
7. M.J. Levene, J. Korlach, S.W. Turner, et al., Science. 2003, 299, 682.
