CC BY
42
ЭФФЕКТИВНАЯ РЕДУКЦИЯ ОПУХОЛИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЛЕЙКОЗЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЦИКЛОФОСФАНА И ЛАЗЕРНОГО ОБЛУЧЕНИЯ
Ю.П. Мешалкин, T.A. Халикова, Е.В. Кулакова, T.A. Короленко
ГУ НИИ физиологии Сибирского отделения РАМН (г. Новосибирск)
В экспериментах на мышах с острым лейкозом Р-388 показано, что комбинация лечения циклофосфаном (ЦФ) с облучением излучением непрерывного аргонового лазера (АЛ) и фемтосекундного излучения титан-сапфирового лазера (ТСЛ) через час после введения препарата существенно увеличивает редукцию опухоли. Методом эквивалентных экспонент рассчитаны индексы эффективности лечения ЦФ - 0,330, ЦФ + АЛ - 0,952, ЦФ + ТСЛ - 1,341, возрастающие с увеличением торможения роста опухоли. Предполагается существование механизмов фотоактивации промежуточных продуктов метаболизма ЦФ излучением АЛ по механизмам линейного поглощения и ТСЛ по двухфотонным механизмам, приводящих к усилению их антиклеточной активности.
EFFECTIVE TUMOR REDUCTION IN MICE WITH ACUTE LEUKOSIS AFTER CYCLOPHOSPHANE
AND LASER RADIATION
Yu. P. Meshalkin, T.A. Khalikova, E.V. Kulakova, T.A. Korolenko Physiology Research Institute, Novosibirsk, Russia
Cyclophosphane (CPH) in combination with continuous argon laser radiation (ALR) and titanium sapphire laser radiation (TSLR) resulted in a significant tumor reduction in mice with acute leukosis. Indices of the treatment efficiency were calculated by the method of equivalent exponents (CPH: 0,330; CPH + ALR: 0,952; CPH + TSLR: 1,341). They were increased with increasing the tumor growth inhibition.
ДНК-алкилирующие агенты на основе азотистого иприта были первыми эффективными противораковыми препаратами и остаются такими и сегодня. Основными среди них являются цикло-фосфан (ЦФ) и изофосфамид (ИФ) — неактивные формы, которые проявляют свою фармакологическую активность лишь после превращения в генотоксичные метаболиты [9, 17, 18]. Цикло-фосфан является №-бис-(бета-Хлорэтил)-№-0-триметиленовым эфиром диамидофосфорной кислоты. Молекула состоит из реакционноактивной хлорэтиламиновой группы и неактивной части, которая выполняет транспортные функции по доставке активной части молекулы до клеточных мишеней.
Начальный этап метаболизма циклофосфана происходит двумя альтернативными путями: 4-гидроксилированием — 90,7—95,7 % от всего ЦФ и ^деалкилированием — 4,3—9,3 % [16] с образованием семи основных метаболитов, из которых функционально активны 4 соединения: 4-гидроксициклофосфамид; акролейн; азот-
ный иприт и фосфарамид иприта (рис. 1). Результатом действия алкилирующих метаболитов является возникновение мутаций (включая замены оснований в нуклеотидных парах, хромосомные аберрации), инициирование апоптоза [8, 19].
Таким образом, препарат может рассматриваться как пролекарство с транспортной функцией, доставляющее активное цитостатическое вещество в опухолевые клетки.
Химиотерапия циклофосфаном нашла широкое применение при мелкоклеточном раке легкого, раке яичников, раке молочной железы, ре-тикулосаркоме, лимфосаркоме, хроническом лимфолейкозе, остром лимфобластном лейкозе, множественной миеломе, опухоли Вильмса, костной ретикулосаркоме, опухоли Юинга, ангиосаркоме.
В целом биотрансформация ЦФ является последовательным процессом, при котором образуются как продукты с антиклеточной активностью, так и неактивные, но токсичные продукты. Поэтому химиотерапия циклофосфаном сопро-
Рис. 1. Циклофосфан (а) и его основные активные метаболиты: фосфарамид иприта (б) и акролейн (в)
вождается рядом негативных побочных явлений. Очевидно, что повышение активности препарата без увеличения его вводимой дозы имеет большой практический интерес.
В настоящей работе показано, что облучение опухоли лазерным излучением через час после введения циклофосфана существенно увеличивает эффективность его действия при экспериментальном лейкозе.
Материалы и методы
Объектом исследования были мыши линии ОБЛ/2 (самцы). Всем мышам в мышцы правого бедра вводились клетки лейкоза Р-388. Дата имплантации клеток опухоли принята за начало временного отсчета. По мере развития опухоли у экспериментальных животных существенно увеличивался размер бедра. Бедро измерялось штангенциркулем в двух проекциях. Третий размер определялся как среднее от двух предыдущих измерений. Произведением трех линейных размеров определялся средний объем опухоли. Так, на
9-й день после имплантации клеток размер опухоли у животных достиг размеров 1,02 ± 0,104 см3.
На 10-й день после имплантации опухоли экспериментальные животные были разделены на несколько групп. В контрольной группе (I) было 15 животных, которые не подвергались лечению. Другим животным с экспериментальной опухолью вводился циклофосфан («Конпо», Россия) из расчета 50 мг на кг веса животного. Была выделена группа из 8 животных (группа II), лечение которых ограничилось введением циклофосфана. Еще одной группе животных (группа III) через час после введения препарата было сделано облучение опухоли излучением аргонового лазера. Следующая группа животных (группа IV) через час после введения циклофосфана была подвергнута облучению сфокусированным излучением фемтосекундного титан-сапфирового лазера.
Для облучения животных использовался аргоновый лазер («Лг-5—150» Инверсия, Россия). Облучение проводилось всеми сине-зелеными линиями в спектральном диапазоне 461—514 нм. Для уменьшения мощности излучения использовались обтюратор и фильтры. Средняя мощность при облучении составила 25 мВт. Облучение проводилось несфокусированным пучком диаметром 4 мм. Время экспозиции — 10 мин. При этом наблюдалось отражение значительной доли
излучения в обратном направлении. Общая энергия облучения составила 120 Дж/см2.
Для облучения животных группы IV использовался фемтосекундный титан-сапфировый лазер («РетшМеё”, Техноскан, Новосибирск) с накачкой аргоновым лазером («Аг-5—150», Инверсия, Новосибирск). Средняя мощность лазера составляла 250 МВт, длительность импульсов — 40 фс, частота следования 89 МГц. Средняя длина волны фемтосекундного излучения составляла 802 нм. Излучение фокусировалось длинноволновой линзой Б=140 мм. Диаметр пятна составлял 100 мкм. Энергия облучения составила 2106 Дж/см2.
Все животные облучались без предварительного усыпления. Облучение проводилось через кожу мыши без удаления волосяного покрова. Излучение направлялось не в одну точку, а сканировалось по поверхности бедра с опухолью.
В дальнейшем животные из всех групп содержались в одинаковых условиях и у них в одно время измерялись размеры опухоли.
Выбор лазерных источников основывался на том, что излучение в сине-зеленой области спектра проходит в биологическую ткань на глубину 0,5— 1,5 мм и в результате поглощения преобразуется в тепло [3]. Для него характерно значительное объемное рассеяние назад, а его непосредственное воздействие как на нормальную биологическую ткань, так и на опухоли без фотосенсибилизаторов ограничивается тепловым действием [20].
Титан-сапфировый лазер является новым для медико-биологических
применений типом лазеров, генерирующих излучение в инфракрасном (ИК) диапазоне со сверхкороткой длительностью импульсов в несколько десятков фемтосекунд (фс = 10-15 с).
Хорошо известно, что свет ближнего ИК диапазона может проникать на несколько сантиметров в глубь биоткани, что делает его перспективным для неинвазивного воздействия на глубоко расположенные очаги патологии [3]. Вместе с тем благодаря короткой длительности импульсов можно получать значительные импульсные мощности, а следовательно, и энергии облучения объекта, которые
4.50 п
4.00
3.50
, 3,00 -
2.50 -
Ї 2,00 Ю
° 1,50
1.00 -0,50 -0,00
расходуются не на тепловое, а на фотохимическое действие. В свою очередь, как следствие высоких импульсных мощностей, взаимодействие фемтосекундного излучения с молекулами может проходить по нелинейным механизмам, в частности по механизмам двухфотонного поглощения [10]. Известно также, что лазерное излучение фемтосекундной длительности может эффективно сдвигать направление элементарных химических реакций в результате многоквантового поглощения энергии короткоживущими промежуточными продуктами химических реакций [2].
Результаты и обсуждение
Все экспериментальные животные первой контрольной группы, не получившие лечения, погибли к концу 2-й нед после имплантации опухоли. У этих животных на 13-й день средний размер опухоли составил 1,84 ± 0,452 см3.
Лечение циклофосфаном было проведено на
10-й день после имплантации опухоли. Через 3 дня после лечения было отмечено значительное снижение объема опухоли у животных второй группы — 0,96 ± 0,125 см3 (рис. 2). Однако еще больший эффект был получен у животных при облучении титан-сапфировым лазером (группа IV) — 0,75 ± 0,243 см3. Облучение животных излучением аргонового лазера даже несколько снизило эффект действия циклофосфана. Средний
1 2 3
1±г |І§ Г4 і
ґПі
13
14 16
время, дни
Рис. 2. Изменение объема опухоли: 1 - контрольная группа, 2 - лечение ЦФ, 3 - лечение ЦФ + аргоновый лазер, 4 - лечение ЦФ + титан-сапфировый лазер
9
В общем случае кинетика роста размеров опухоли описывается экспоненциальным законом [4]:
F = Foe1'
(1)
время, дни
Так как
Рис. З. Кривые кинетики роста опухолей в методе эквивалентных экспонент: 1 - контрольная группа, 2 - лечение ЦФ, 3 - лечение ЦФ + аргоновый лазер, 4 - лечение ЦФ + титан-сапфировый лазер
объем опухоли у животных в третьей группе составил — 1,25 ± 0,128 см3.
В последующее время сохранилась общая тенденция к снижению объема опухоли. На 16-й день после имплантации были отмечены минимальные размеры опухолей у всех животных, получивших лечение (точка минимума). При этом минимальный объем опухоли был у животных из четвертой группы.
Эксперименты не привели к полной регрессии опухолей. По типу кинетической кривой роста они соответствуют кривой с торможением роста. Для таких кинетических кривых характерен последующий повторный рост опухоли по экспоненциальному закону [4]. На 20-й день объем опухоли у животных второй группы составил 2,87 ± 0,62 см3 , что в 3,6 раза превысило размер опухоли у животных из четвертой группы. Кроме того, к 20-му дню во второй группе из 8 животных осталось 5, тогда как в третьей и четвертой группах количество животных осталось неизменным — 3 и 2, соответственно. На 22-й день эксперимента во второй группе осталось 2 животных (из 8) и два животных в третьей группе. К сожалению, из-за первоначальной малочисленности четвертой группы не удалось проследить за динамикой дальнейшего повторного роста опухоли. Тем не менее, на основе имеющихся данных были сделаны следующие обобщения.
где F — размер опухоли;
р - функция, характеризующая удельную скорость роста (р = const).
Для количественной оценки эффективности воздействия методов лечения на опухоли мы воспользовались методом эквивалентных экспонент [4]. При сложных формах кинетических кривых роста опухоли можно сопоставить опыт и контроль, сравнивая пару «эквивалентных» экспонент, проходящих через начальную и конечную точки (рис.3).
Пусть средняя удельная скорость роста на временном интервале (ti, t2)
P(t1, t2) =
1
t2 - t1
2
J p(t)dt •
(2)
1 dF d ln F
p(t) =--------------------------------=-;
F dt dt
(3)
то
P( 12 ) = _L_ J d_^t = ln F (t2) - ln F (t1) . (4) 12 -1^ dt t2 -11
Таким образом, удельная скорость роста, усредненная по всему интервалу {(1,(2), зависит только от значений _Р на концах этого интервала. Величина ^ t ) равна показателю той «эквивалентной экспоненты», которая проходит через
концы кинетической кривой ¥(1) на рассматриваемом интервале времени.
За меру эффективности лечения можно принять отношение средних удельных скоростей роста опухоли в контроле и опыте:
х_ фк (t1* t2) _ ^2оп ^1оп w
л —------------------— х
ln Рк (t2к ) - ln Рк (Нк )
Роп (¿1,¿2 ) 12к - Нк 1п Роп (Ьоп ) - 1п Роп (Чоп )
(5)
В общем случае величина % зависит от выбора обоих временных интервалов усреднения {(1к,(2к) и ^1оп^2ог). В качестве общего начала этих интервалов можно выбрать момент начала лечебного воздействия и экстраполировать кинетическую кривую контрольной группы до момента времени 12оп. В этом случае отношение временных интервалов даст единицу.
В силу того, что при полном торможении роста опухоли роп=0 и эффективность лечения обращается в бесконечность
= 1 - (=Г
X
(6)
Значение х* _ 0 соответствует отсутствию эффекта, при х* > 0 имеет место эффективное торможение опухолевого процесса, а отрицательные значения характерны воздействиям, стимулирующим рост опухоли [4].
В наших экспериментах получены следующие индексы эффективности лечения через 10 сут после начала лечения: циклофосфан — 0,330; циклофосфан + аргоновый лазер — 0,952; циклофосфан + титан-сапфировый лазер — 1,341, т.е. во всех случаях происходит торможение роста опухоли.
Вместе с тем облучение опухоли in vivo через час после введения циклофосфана лазерным излучением значительно повышает эффективность лечения. Причем под действием фемтосекундного излучения титан-сапфирового лазера эффективность лечения заметно повышается.
Основная сложность в выяснении механизма действия лазерного излучения на противоопухолевую активность циклофосфана связана с тем, что алкилирующие агенты действуют только in vivo. Кроме того, многие промежуточные продук-
ты метаболизма СР к настоящему моменту остаются неидентифицированными. Тем не менее, учитывая спектральные и энергетические характеристики используемых лазерных систем, можно предположить, что в основе действия лазерного излучения лежит фотоактивация продуктов метаболизма ЦФ, имеющих поглощение в области 380—460 нм. В этом случае излучение аргонового лазера приводит к их фотоактивации по механизмам однофотонного поглощения в длинноволновый край полосы поглощения, и эта фотоактивация возможна лишь на небольшой глубине, т.е. непосредственно на поверхности опухоли. При облучении излучением титан-сапфирового лазера те же продукты метаболизма ЦФ могут быть фото-активированы по двухфотонному механизму за счет одновременного поглощения двух квантов с суммированием их энергии. В этом случае глубина, на которой возможно подобное взаимодействие в тканях, может быть достаточно большой, но из-за малой вероятности таких взаимодействий необходима высокая плотность энергии.
Возможность использования двухфотонного взаимодействия в лазерной фотодинамической терапии массивных опухолей с использованием мощных лазеров предыдущего поколения обсуждалась еще в 1985 г. [7]. При этом по двухфотонному механизму возбуждались фотосенсибилизаторы, избирательно накапливающиеся в опухолевых клетках. Принципиальная возможность двухфотонного возбуждения была продемонстрирована для ряда фотосенсибилизаторов и в их числе для производных гематопорфирина [6, 7, 13], феофорбида а [13], различных псораленов [14], производных стильбена [5], протопорфири-на IX [11], фталоцианина алюминия [1] и гипок-риллина [12]. Для всех фотосенсибилизаторов противоопухолевый эффект связан с генерацией ими синглетного кислорода в возбужденном состоянии.
В нашем эксперименте циклофосфан фактически не является фотосенсибилизатором. Механизм его цитотоксического действия заключается в модификации ДНК с образованием перекрестных сшивок, заменой оснований в нуклеотидных парах, хромосомных аберраций и иницированием апоптоза. В связи с этим можно предположить три возможных механизма усиления противоопухолевого действия ЦФ при лазерном облучении:
— индуцированный двухфотонным возбуждением сдвиг метаболизма ЦФ в сторону увеличения выхода известных цитотоксических метаболитов;
— двухфотонная фотоактивация короткожи-вущих промежуточных продуктов метаболизма ЦФ, приводящая к образованию новых более эффективных цитотоксических метаболитов;
— усиление цитотоксического действия ЦФ за счет двухфотонного фотодинамического взаимодействия излучения титан-сапфирового лазера с эндогенными порфиринами в опухоли.
Уточнение механизмов повышения эффективности ЦФ под действием лазерного облучения требует дальнейших исследований.
Авторы выражают благодарность сотруднику Института цитологии и генетики СО РАН В.И. Каледину за модель экспериментального лейкоза Р— 388.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мешалкин Ю.П., Алфимов Е.Е., Васильев Н.Е. и др. Двухфотонное возбуждение фталоцианинов алюминия // Квантовая электроника. 1999. Т. 29, № 3. С. 227- 229.
2. Саркисов О.М., Уманский С.Я. Фемтохимия // Успехи химии. 2001. Т. 70, № 6. С. 515-538.
3. Тучин В.В. Лазеры в биомедицинских исследованиях. Саратов, 1998. 384 с.
4. Эмануэль Н.М. Физико-химические основы разработки новых эффективных противоопухолевых препаратов. // Фундаментальные науки - медицине. М.: Наука, 1981. С. 73-84.
5. Bhawalkar J.D., Kumar N.D., Zhao C.F., Prasad P.N. Two-photon photodynamic therapy // J. Clin. Laser. Med. Surg. 1997. Vol. 15. P. 201- 204.
6. Bodaness R.S., Heller D.F., Krasinsky J., King D.S. The two-photon laser-induced fluorescence of the tumor-localizing photosensetizen hematoporphyrin derivative. Resonance enhanced 750 nm two-photon excitation into the near-UV Soret band // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261, № 26. P. 12098-12101.
7. Bodaness R.S., King D.S. The two-photon induced fluorescence of the tumor localizing photo-sensitizer hema-toporphyrin derivative via 1064 nm photons from a 20-ns Q-switched Nd:YAG laser // Biochem. Biophys. Res. Comm.
1985. Vol. 126. P. 346-351.
8. Chen B., Cyr D.G., Hales B.F. Role of apoptosis in mediating phosphoramide mustard-induced rat embryo malformations in vitro // Tetralogy. 1994. Vol. 50. P. 1-12.
9. Colvin M., Chabner B.A. Alkylating Agents // Cancer Chemotherapy. J.B. Lippincott Company: Philadelphia. 1990. P. 276-313.
10. Fisher W.G., Partridge W.P. Jr., Dees C., Wachter E.A. Simultaneous two-photon activation of type I photodynamic therapy agents // Photochem. Photobiol. 1997. Vol. 66. P. 141-145.
11. Goyan R.L., Cramb D.T. Near-infrared two-photon excitation of protoporphyrin IX. Photodynamics and photoproduct generation // Photochem. Photobiol. 2000. Vol. 72. P. 821- 827.
12. Liu J., Zhao Y. W., Zhao J.Q. et al. Two-photon excitation studies of hypocrellins for photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B. 2002. Vol. 68. P. 156- 164.
13. Mashiko S. Two-photon excited visible fluorescence of hematoporhyrin and phiophobide a and in vitro experiments of the photodynamic therapy // J. Opt. Soc. Am. B: Opt. Phys.
1986. Vol. 3. P. 72- 73.
14. Oh D.H., Stanley R.J., Lin M. et al. Two-photon excitation of 4’-hydroxymethyl-4,5’,8-trimethylpsoralen // Photochem. Photobiol. 1997. Vol. 65. P. 91- 95.
15. Panasci L., Paiement J-P., Christodoulopoulos G. et al. Clorambucil drug resistance in chronic lymphocytic leukemia: the emerging role of DNA repair // Clinical Cancer Research. 2001. Vol. 7. P. 454- 461.
16. Ren S., Yang J.S., Kalhorn T.F., Slattery J.T. Oxidation of cyclophosphamide to 4-hydroxycyclophosphamide and deschloroethylcyclophosphamide in human liver microsomes // Cancer Res. 1997. Vol. 57, № 19. P. 4229- 4235.
17. Sladek N.E. Metabolism and pharmacokinetic behavior of cyclophosphamide and related oxazaphos-phorines // In "Anticancer Drugs Reactive Metabolism and Drug Interactions", Pergamon Press, Tarrytown, N.Y., 1994. P. 79-156.
18. Struck R.F., Davis R.L. Jr., Berardini M.D., Loechler E.L. DNA guanine-guanine crosslinking sequence specificity of isophosphoramide mustard, the alkylating metabolite of the clinical antitumor agent ifosfamide // Cancer Chemother. Pharmacol. 2000. Vol. 45, № 1. P. 59- 62.
19. Torchinsky A., Lishanski L., Wolstein O. et al. NF-kB DNA-binding activity in embryos responding to a teratogen cyclophosphamide // BMC Developmental Biology. 2002. Vol. 2. P. 1-11. (http://www.biomedcentral.com/1471-213X /2/2).
20. van Gemert M.J.C., de Kleijn W.J.A., Hulsbergen H.J.P. Temperature behavior of a model port wine stain during argon laser coagulation // Phys. Med. Biol. 1982. Vol. 27. P. 1089-1104.
Поступила 10.01.04
