ЭФФЕКТ ПРИМЕНЕНИЯ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ КОСТНОЙ ПЛАСТИКЕ КСЕНОГЕННЫМИ БИОМАТЕРИАЛАМИ

Боков Андрей Евгеньевич; Орлинская Наталья Юрьевна; Булкин Анатолий Алексеевич; Алейник Дина Яковлевна; Чарыкова Ирина Николаевна; Егорихина Марфа Николаевна; Антошина Вероника Вячеславовна

DOI: 10.47026/2413-4864-2023-3-58-73

УДК 616.71-003.93:57.089.67 ББК P.251.1

А.Е. БОКОВ, Н.Ю. ОРЛИНСКАЯ, А.А. БУЛКИН, Д.Я. АЛЕЙНИК, И.Н. ЧАРЫКОВА, М.Н. ЕГОРИХИНА, В.В. АНТОШИНА

ЭФФЕКТ ПРИМЕНЕНИЯ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ КОСТНОЙ ПЛАСТИКЕ КСЕНОГЕННЫМИ БИОМАТЕРИАЛАМИ*

Ключевые слова: остеогенез, репарация костной ткани, ксенотрансплантат, костная пластика, клеточные технологии, мезенхимальные стромальные клетки.

В настоящее время сохраняется значительная частота дегенеративных заболеваний позвоночника после оперативных вмешательств с применением костной пластики, особенно у пациентов пожилого возраста. Результаты исследований свидетельствуют о том, что применение стволовых клеток является одним из перспективных направлений, позволяющих повысить эффективность остеоинтеграции.

Цель исследования - оценить эффективность остеогенеза в условиях применения ксенотрансплантатов с нагрузкой стволовыми клетками, а также морфологические особенности остеоинтеграции.

Материалы и методы. Экспериментальное исследование проведено на 22 кроликах-самцах. 2 животных использовались для получения стволовых клеток, остальным животным проводилась имплантация ксеногенного костнозамещающего материала «Остеоматрикс» в крыло подвздошной кости, из них 10 животным имплантировался ксенотрансплантат, не заселенный клетками, а другим 10 животным - идентичный ксе-нотрансплантат, заселенный мезенхимальными стромальными клетками. Вывод из эксперимента выполнялся на 60-е сутки после имплантации. Изучение материала проводилось с применением методов флуоресцентной и световой микроскопии. Для оценки статистической значимости наблюдаемых отличий (оценка пролиферации, неоангиогенеза и остеоинтеграции) в опытной и контрольной группах применялся критерий Манна-Уитни при критической значимости p < 0,05. Результаты. При использовании остеопластического материала, не нагруженного мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками в срок от 60 дней после операции, остеоинтеграция проходит через непрямой остеогенез с образованием в дальнейшем полноценной костной ткани, что увеличивает время полного заживления дефекта. В случае использования остеоматрикса, нагруженного мульти-потентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга, остеоге-нез проходит прямым путем с образованием полноценной костной ткани. Нагрузка остеоматрикса мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками стимулирует неоангиогенез и пролиферативную активность ткани, что способствует активации репаративных процессов костной ткани и стимулирует процессы остеоинтеграции ксенотрансплантатов.

Выводы. Применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при костной пластике с использованием ксенотрансплантатов повышает эффективность остеоинтеграции за счет стимуляции прямого остеогенеза, повышения активности пролиферации и ангиогенеза.

Введение. Дегенеративные заболевания позвоночника являются одними из наиболее частых причин оперативных вмешательств у пациентов пожилого возраста [21, 26]. При дегенеративном стенозе позвоночного канала в сочетании с нестабильностью двигательного сегмента позвоночника наиболее эффективным методом лечения является транспедикулярная фиксация с применением меж-телового спондилодеза [25]. Тем не менее вследствие снижения регенераторного

* Работа выполнена в рамках государственного задания 121030100311-3 «Разработка технологий, повышающих эффективность декомпрессивно-стабилизирующих вмешательств с применением транспедикулярной фиксации и костной пластики у пациентов с дегенеративной патологией и травматическими повреждениями».

потенциала и остеопороза, распространенного среди пациентов пожилого возраста, сохраняется значительная частота неудовлетворительных результатов оперативного лечения [8, 10]. В связи с этим одной из актуальных задач экспериментальной и клинической медицины является оптимизация процессов ре-паративной регенерации костной ткани. Для выполнения оперативных вмешательств в настоящее время активно применяются остеопластические материалы, обладающие остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, тем не менее успех регенерации напрямую зависит от собственных репаративных возможностей организма [20]. Кроме того, по эффективности применение ксе-ногенных и аллогенных костно-пластических материалов значительно уступает трансплантатам из аутологичной кости [3, 22]. Клеточные технологии, в частности с применением мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), являются перспективным направлением, использование которых может увеличить эффективность костной пластики с применением ксено-трансплантатов [1, 2, 17, 29]. Но влияние ММСК на остеоинтеграцию ксено-трансплантатов требует дальнейшего изучения.

Цель данного исследования - оценить влияние ММСК на регенерацию кости в условиях применения имплантатов, не заселенных клетками, и имплан-тов без клеток.

Материалы и методы. В качестве экспериментальной модели использовали кроликов породы шиншилла. Два кролика были использованы для получения ММСК костного мозга, 20 животных - для формирования экспериментального костного дефекта. Для исследования брали взрослых кроликов самцов со средней массой 4 056±935 г.

Животные были разделены на две группы. Животным первой группы осуществлялась имплантация остеопластического материала «Остеоматрикс» в дефект гребня подвздошной кости, второй - в идентичных условиях имплантировался материал «Остеоматрикс» с аллогенными ММСК костного мозга (КМ) «Остеоматрикс» - остеопластический материал, полученный путем высокотехнологичной обработки костей крупного рогатого скота и состоящий на 75% из костных минералов и на 25% из коллагена и костных сульфатиро-ванных гликозаминогликанов («Коннектбиофарм», Россия).

Данное исследование было рассмотрено и утверждено на заседании локального этического комитета федерального государственного бюджетного учреждения высшего образования «Приволжский исследовательский медицинский университет» (ФГБОУ ВО «ПИМУ»), протокол № 4 от 1 марта 2021 г.

ММСК КМ кролика получали из костного мозга бедренных костей животного после эвтаназии под наркозом (КсилаВета (Pharmamagist Ltd, Венгрия) и 1,0 мл Золетила (Virbac Sante Animale, Франция). Очищенные бедренные кости помещали во флакон со стерильным раствором Хенкса с 5-кратным набором антибиотиков (пенициллин-стрептомицин) и доставляли в лабораторию. Дальнейшие работы проводились в условиях ламинарного бокса. Кости многократно промывали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), отсекали эпифизы и осторожно выдували костный мозг при помощи шприца с иглой. После чего взвесь клеток костного мозга тщательно суспендировали в буфере с помощью пипетки и шприца, затем пропускали через стерильный фильтр с диаметром пор 100 микрон. Суспензию центрифугировали 10 мин при 1500 оборотов в минуту. Полученный осадок ресуспендировали в 2 мл питательной среды а-МЕМ (Hyclone, США) с добавлением 15% телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС, Hyclone, США). Количество и жизнеспособность клеток подсчитывали на автоматическом

счетчике клеток Counttess (Invitrogen, США). Для определения доли жизнеспособных клеток использовали прижизненный краситель трипановый синий. Клетки культивировали на пластике «Costar» (США). Дальнейшее очищение ММСК КМ от примеси клеток других типов осуществлялось за счет адгезии МСК к поверхности пластика в процессе культивирования (среда а-МЕМ с добавлением 15% ТЭС, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мм глутамина) в СО2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2, абсолютной влажности. Первая смена среды проводилась не ранее чем на 3-и сутки культивирования. По мере достижения клетками субконфлюэнтного монослоя (до 80%) осуществляли пересев клеток. При этом костномозговые МСК в культуре адгезировались до приобретения фибробластоподобной морфологии и образования клеточных колоний, далее они были отделены от неадгезированных гемопоэтических клеток посредством смены среды и пассирования культуры. В эксперименте использовали культуры III-IV пассажа. Перед введением в эксперимент культуры были охарактеризованы. Они были представлены морфологически однородными фибробластоподобными клетками, формирующими субконфлюэнтный монослой. В присутствии дифференцировочных сред клетки культуры были способны к дифференцировке. Остеогенную дифференцировку (рис. 1) индуцировали с помощью комплекса дифференцировочных добавок: 10-8 M дексаме-тазон, 5 мг/мл аскорбиновой кислоты мг/мл ascorbic acid 2-sphate и 10 мл глицерофосфата. Для индукции адипогенной дифференцировки клетки культивировали в среде с 10-8 M дексаметазона, 2,5 мг/мл инсулина, 100 мкм индоме-тацина и 3,5 мкм розиглитазона. В качестве специфических красителей использовали: для окраски липидных вакуолей - Oil Red (Sigma, США), для выявления солей кальция в процессе дифференцировки в остеобласты - ализариновый красный (Sigma, США). Хондрогенную дифференцировку (рис. 2) индуцировали с использованием дифференцировочной среды, включающей 100 мг/мл пи-рувата натрия, 50 мг/мл 2-фосфат L-аскорбиновой кислоты, 40 мг/мл L-пролина, 10-7 М дексаметазона, 10 нг/мл рекомбинантного человеческого трансформирующего фактора роста - TGF-p3. Хондрогенную дифференцировку подтверждали образование небольших сфероидов в опытных сериях и отложение в них клетками коллагена II типа (поликлональные антитела - Abcam, ab34712) (рис. 3).

Рис. 1. Остеогенная дифференцировка ММСК кролика, III пассаж. Ув. х100. Окраска - ализариновый красный (Sigma, США): а - контроль; б - опыт

- ш

Ä'---t. Га:

pi " .v-^V-^-----' I

.. ■ ...•••"•c'.'/vft V -' 1 ,

of

. ... v- ' --N';^' '

а б

Рис. 2. Адипогенная дифференцировка ММСК кролика, III пассаж. Ув. х100. Окраска - Oil Red (Sigma, США): а - контроль; б - опыт

а б

Рис. 3. Хондрогенная дифференцировка ММСК кролика, III пассаж: а - образованный сфероид. Ув. (Abcam, ab34712; Sigma, США)х40; б - отложение в сфероиде коллгена II типа поликлональными антителами (Abcam, ab34712; Sigma, США). Ув. х400

Фенотип клеток перед вводом в эксперимент определяли с использованием моноклональных антител для CD 44, CD 105, CD 90, CD 45 с соответствующими изотипическими контролями на цитофлуориметре FACS CANTO II (Betman Dickinson, США). Клетки культуры, выделенные из костного мозга кролика, экспрессировали 90% CD 44, 89% CD 105, специфические для ММСК, но не экспрессировали CD 90, характерный для ММСК человека, и не экспрессировали панлейкоцитарный маркер CD 45. Таким образом, полученные клетки соответствовали основным критериям для ММСК: хорошо распластывались на пластике, имели типичную фибробластоподобную форму, были способны к дифференцировке и обладали характерным фенотипом. Жизнеспособность клеток в культурах составляла 97-98%. Культуры были стерильны, микоплазмами и вирусами не контаминированы.

Стерильные образцы «Остеоматрикса» промывали ростовой средой (а-МЕМ с добавлением антибиотиков, глутамина и 15% ТЭС) в течение 15-20 мин, после чего среду отбирали и аккуратно шприцом, стараясь попадать в поры образца, вводили суспензию ММСК 2 млн/мл на образец. Через 2-4 мин добавляли до 3 мл ростовой среды, затем образцы с клетками помещали в СО2 инкубатор при 37°С, 5% СО2, абсолютной влажности на 48 ч.

Через 48 ч необходимое для эксперимента на животной модели количество образцов «Остеоматрикса» с ММСК отмывали в (фосфатно-солевом буфере) PBS и передавали в стерильном биксе для имплантации животным. Одновременно 2 оставшихся образца использовали для прижизненного окрашивания ядер клеток внутри образца с применением флуорохрома Hoechst 33342 (BD Phar-mingen, США; длина волны возбуждения 377 нм и длина волны эмиссии 447 нм), обладающего высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК. В лунку, содержащую образец и 2 мл PBS, добавляли 1 мкл раствора Hoechst 33342 в концентрации 10 мкг/мл. Планшет помещали в термостат и инкубировали в течение 30 мин при 370С. По окончании инкубации образец дважды отмывали PBS. Затем к образцу добавляли 1 мл PBS для предотвращения его пересыхания.

Для маркировки мертвых клеток использовали флуорохром NucGreen™ Dead 488 Invitrogen™ Termo Fisher Scientific, США, окрашивающий ядра погибших клеток ярко зеленым (длина волны возбуждения 477 нм, длина волны эмиссии 525 нм). Указанный флуорохром не способен проникать в цитоплазму жизнеспособных клеток и обладает специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК. Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя.

После этого планшет с образцом переносили в считывающую ячейку фо-тометра-имиджера Cytation™5 (BioTek, США) с применением программного обеспечения Gen5 Imedge+ и оценивали адгезию и жизнеспособность клеток на поверхности материала «Остеоматрикс». Многофункциональный имиджер Cytation™5 на основе использования широкопольной флуоресцентной микроскопии позволяет проводить прижизненное исследование клеток не только на поверхности образцов, но и в их структуре.

Экспериментальным животным выполнялось стандартное оперативное вмешательство - имплантация костнопластического материала в сформированный прямоугольный дефект крыла подвздошной кости.

Обезболивание проводилось препаратами Ксилавета (Pharmamagist ltd, Венгрия) 1,0 и 1,0 мл золетила (virbac sante animale, Франция). Подготовка операционного поля: стрижка, обработка антисептиком «авансепт». Подготовка рук хирурга: спиртовой раствор хлоргекседина, стерильные перчатки. Продолжительность операции 30 мин.

Оперативное вмешательство проводилось следующим образом: доступ осуществляли линейным разрезом длиной 5 см в проекции гребня подвздошной кости слева. После выполнения доступа скелетировали участок гребня на протяжении 1,5 см. С помощью фрезы Synthes needle kit 8g формировали бикортикальный костный дефект размером 1,0 x 0,5 x 0,5 см. В сформированный костный дефект животным первой группы помещали ксенотрансплантат «Остеоматрикс» без клеток, а животным второй группы - ксенотрансплантат «Остеоматрикс», насыщенный стволовыми клетками. Размер образцов «Остеоматрикс» составлял 1,0 x 0,5 x 0,5 см. Образцы фиксировали костным швом нитью викрил 2-0, проводили гемостаз, после чего выполняли послойный шов раны. После имплантации материала «Остеомарикс» с различными типами обогащения клеток выведение животных из эксперимента осуществляли на 60-е сутки.

Экспериментальный материал фиксировался в 10%-ном формалине. После фиксации образцы отправляли в стандартную гистологическую проводку на аппарате «Excelsior ES» (Thermo Scientific, США). Заливку в парафиновые блоки проводили с использованием заливочной станции «HistoStar» (Thermo Scientific, США). После проводки изготавливали парафиновые блоки. Серийные срезы толщиной 4-6 микрон получали на микротоме «Microm HM 325» (Thermo

Scientific, США). Срезы окрашивались гематоксилином и эозином при помощи станции для окраски Gemini AS (Thermo Scientific, США).

Для морфометрической обработки показателей неоангиогенеза, пролифера-тивной активности и остеогенеза, а также создания видеоархива полученного материала использовался микроскоп Leica 2500 (Leyca Biosystems, Германия).

Иммуногистохимическое окрашивание проводили вручную. Протокол окрашивания включал предварительную депарафинизацию срезов и демаскировку в течение 20 мин при температуре 98-99°С. Далее проводили инкубацию срезов с первичными антителами. Были использованы готовые моноклональ-ные мышиные антитела к Ki67, clone MIB-1 (Dako, Дания) и вторичным козьим антимышиным антителам Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluo ® 488 (Abcam, США). Ядра клеток докрашивали красителем DAPI (BD Pharmingen, США).

Подсчет морфометрических показателей (Ki-67 позитивных клеток, CD-31 позитивных клеток) производился в 10 полях зрения на увеличении х400, затем рассчитывалась медиана от общего значения.

Для установления различий по исследуемым параметрам изучали степень согласованности изменений исследуемых параметров, которая определялась по ранговому коэффициенту корреляции Спирмена. Результаты представлены медианой (Ме), первым (25% - Q1) и третьим (75% - Q3) квартилями.

Результаты. Образцы материала «Остеоматрикс», не нагруженного клетками при использовании флуорохрома Hoechst 33342, равномерно окрашиваются синим по всей поверхности (рис. 4, а). На поверхности образцов «Остеоматрикса», на которых клетки культивировались в течение 48 ч, особенно в области предполагаемого введения, отчетливо визуализируется большое количество клеточных ядер, интенсивно флуоресцирующих в зоне синего цвета (рис. 4, в). Известна высокая специфичность Hoechst 33342 к двухцепочечной молекуле ДНК, и фиксируемое окрашивание ядер клеток этим красителем свидетельствует об адгезии ММСК КМ в зонах введения на поверхности и внутри пор образца (рис. 4, b, с, d).

Практически не наблюдали на матрице клеток ядер, окрашенных флуоро-хромом NucGreen™ Dead 488 Invitrogen™ ярко зеленым цветом (погибших клеток). Проведенные нами предварительные исследования показали, что в образцах после инъекции суспензии клеток адгезируется не менее 50% введенных ММСК КМ, т.е. на каждом образце «Остеоматрикса» остается не менее 1 млн клеток. В нескольких экспериментах подсчитывали через 24 ч после введения в материал количество оставшихся клеток в среде и адгезировавшихся на пластике. Полученные в 5 экспериментах с 5 образцами в каждом данные продемонстрировали, что 50% и больше клеток остается на образце материала.

Эти данные свидетельствуют о выраженной адгезии ММСК КМ на поверхности образцов «Остеоматрикса». На образцах, переданных для введения в эксперимент на животных, клетки вводились в те же сроки в той же концентрации и культивировались в аналогичных условиях. Поэтому вполне корректно считать все образцы идентичными по своим качествам и по содержанию МСК.

При гистологическом исследовании экспериментального материала в группе экспериментальных животных с использованием материала «Остео-матрикс» без клеток отмечается образование остеоидных балок, рыхлой волокнистой и соединительной ткани, в которой отмечалась воспалительная инфильтрация разной степени выраженности у разных животных. воспалительные изменения имелись в пяти случаях.

в г

Рис. 4. Остеоматрикс без клеток и после введения клеток при флуоресцентной микроскопии: а - без клеток, ув. *40; б - после введения клеток.

Прижизненное окрашивание ядер клеток внутри образца с применением флуорохрома Hoechst 33342. Ярко окрашенные синим - ядра в зонах введения клеток. Ув. *40; в - через 48 ч после введения клеток (интенсивное свечение в зонах введения -«совмещенное изображение». Ув. *40; г -через 48 ч после введения клеток.

Отчетливо визуализируются флуоресцентно окрашенные синим ядра клеток. Ув.*100

В большинстве случаев отмечалось определенное созревание регенерата, который состоял из остеоидных балок с наличием хондроцитов. Выявлена гетерогенная ткань, в основном состоящая из упорядоченных соединительнотканных волокон, на периферии которых отмечено образование мелких сосудов. Хрящевая ткань занимала около 1/3 объема дефекта, хотя еще оставались участки волокнистой соединительной ткани (рис. 5, а). Наличие большого количества хондроцитов, находящихся в очаге остеообразования в зоне импланта, говорит о том, что дифференцировка костной ткани происходит путем энхондрального остеогенеза (рис. 5, в). Во вновь возникающей мезенхимальной ткани есть островки остеогенеза с наличием новообразованных сосудов. На 25-30% образованная ткань была представлены соединительнотканными волокнами.

При иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к Ki-67 экспериментального материала костной ткани в группе животных с «Остеоматриксом» отмечалась пролиферация хрящевых клеток в костной ткани (рис. 6, а, в).

Рис. 5. Гистологическое исследование костной ткани в группе экспериментальных животных с использованием «Остеоматрикса», не нагруженного клетками: а - окраска гематоксилином и эозином, ув*200; б - окраска гематоксилином и эозином, Ув. х400

т i *<

- • •.

А*

а б

Рис. 6. Иммуногистохимическое окрашивание костной ткани в группе экспериментальных животных с использованием «Остеоматрикса» без клеток. Антитела к Ki-67 - Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluo ® 488: а - ув. *600; б - ув. *400

При гистологическом исследовании зоны импланта экспериментальной группы с использованием «Остеоматрикса», насыщенного стволовыми клетками, в мезенхимальной ткани по периферии зоны постановки импланта отмечается большое количество новообразованных сосудов (рис. 7, а) и наблюдаются фокусы остеогенеза в зоне постановки импланта (рис. 7, в).

При иммуногистохимическом исследовании отмечены Ю-67 позитивные клетки в группе животных с «Остеоматриксом», обогащенным клетками (рис. 8).

Проведено морфометрическое исследование двух экспериментальных групп с использованием МСК в «Остеоматриксе» и без них, изучена площадь просвета сосудов, пролиферативная активность клеток (К1-67), а также выраженность хондрогенеза в каждом из случаев (таблица).

При сравнении двух экспериментальных групп площадь просвета сосудов вокруг импланта превалировала в группе «Остеоматрикса» с клетками МСК и была выше в 1,85 раз (р = 0,021) (рис. 9, а). Количество К1-67 положительных клеток в группе с клетками МСК увеличилась более чем в 1,66 раз (р = 0,028) (рис. 9, б). В группе «Остеоматрикса» с клетками определялся слабый хондро-генез, в то время как при применении данного материала без МСК образование хрящевой ткани было в 1,71 раза выше (р = 0,002) (рис. 9, в).

б

Рис. 7. Гистологическое исследование костной ткани в группе экспериментальных животных с использованием «Остеоматрикса», насыщенного клетками ММСК: а - сосуды в периферии от зоны постановки импланта; б - участки остеогенеза в зоне постановки импланта. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. *200

Рис. 8. Иммуногистохимическое окрашивание костной ткани в группе экспериментальных животных с использованием «Остеоматрикса», обогащенного клетками МСК. Антитела к Ki67 - Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluo ® 488. Ув. *400

Морфометрическое исследование экспериментальных групп

Показатели «Остеоматрикс» без клеток «Остеоматрикс» с клетками МСК

Площадь просвета сосудов вокруг импланта, мкм2 25,0 40,0

Количество К1-67 позитивных клеток в зоне постановки импланта, % 5,0 17,0

Хондрогенез, %% 30,0 17,0

Рис. 9. Морфометрическое исследование экспериментальных групп животных: а - площадь просветов сосудов зоны имплантации в исследуемых группах (р = 0,021); б - индекс пролиферативной активности (К1-67) (р = 0,028); в - площадь новообразованной хрящевой ткани зоны имплантации в исследуемых группах (р = 0,002)

"Остеоматрикс" Бе; МСК "Остеоматрикс" с МСК

Исследуемые группы

б

а

в

Обсуждение. Применение клеточных технологий, основанных на применении стволовых клеток, считается перспективным направлением для улучшения остеоинтеграции костнозамещающих материалов, что подтверждено результатами многочисленных экспериментальных исследований [5, 11, 19]. В настоящее время получены данные, свидетельствующие, с одной стороны, о стимулирующем воздействии стволовых клеток на регенерацию костной ткани за счет иммуномодулирующего действия, секреции таких факторов роста, как EGF, IGF, FGF, TGFp и VEGF [6, 14, 15, 23, 27]. С другой стороны, остео-интеграция ксенотрансплантатов может зависеть от свойств использующегося материала. Наши данные демонстрируют выраженную адгезию МСК на поверхности образцов «Остеоматрикса» при неравномерном их распределении, с преимущественной концентрацией через 48 ч после введения в зонах инъекции клеток. Выраженная адгезия МСК на поверхности образцов «Остеоматрикса»

с сохранением жизнеспособности клеток свидетельствует об отсутствии негативного влияния этого материала на клетки.

Результаты, полученные нами при морфологическом изучении экспериментального материала группы животных с применением «Остеоматрикса» без клеточной нагрузки, показали, что вследствие реорганизации тканей при использовании ненагруженного остеоматрикса в срок от 60 дней после операции образуется костная ткань, состоящая из волокнисто-хрящевой и костной ткани, с преобладанием хрящевого компонента, что позволяет говорить о развитии энхондрального остеогенеза. Само по себе это явление не исключает регенерации костной ткани в итоге эксперимента, однако может влиять на увеличение сроков регенерации костной ткани и ее полного восстановления, что в дальнейшем необходимо учитывать в клинической практике. Иммуногистохи-мическое исследование подтвердило умеренный индекс пролиферации в этой группе исследования (5±0,7) и выраженный хондрогенез в зоне постановки им-планта и остеосинтеза. Воспалительная реакция была выражена слабо и не во всех случаях (п = 5). Вокруг зоны имплантации «Остеоматрикса» образуется достаточно васкуляризированная соединительнотканная капсула. Кость, находящаяся в непосредственном контакте с имплантом без клеток, содержит небольшое количество костных пространств и сосудов.

В группе применения «Остеоматрикса», нагруженного клетками, в срок от 60 дней после операции костная ткань образуется в виде фокусов костной дифференцировки, образование которой проходит путем прямого остеогенеза. Иммуногистохимическое исследование подтвердило, что индекс пролиферации в этой группе выше, чем в группе без клеточной нагрузки (25±1,5% и 40±0,7% соответственно), что может быть обусловлено иммуномодулирую-щим эффектом стволовых клеток. Известно, что за счет применения стволовых клеток снижается секреция таких провоспалительных цитокинов, как ^-1-р, ^-6, TNF-a. В то же время применение стволовых клеток остается без значимого влияния на секрецию цитокинов ^ 10, ^ 13, участвующих в репаративных процессах, [4, 7, 13, 16]. Дополнительным иммуномодулирующим эффектом стволовых клеток может быть ингибирование естественных киллеров, супрессия иммунного ответа, опосредованного В-клетками, стимуляция Т-супрессоров и М2-макрофагов, участвующих в регенеративных процессах [18, 24, 27].

В зоне постановки имплантата и неоостеогенеза отмечена заметная васкуля-ризация соединительной ткани (40±0,7%). Этот эффект обусловлен способностью модифицировать микроокружение имплантированного ксенотрансплантата и стимуляции ангиогенеза [28]. В частности, доказано, что стволовые клетки могут активировать неоангиогенез за счет активации факторов роста семейства VEGF, который стимулирует миграцию микроваскулярных эндотелиальных клеток [9, 14, 30]. Стимуляция ангиогенеза является существенным эффектом применения стволовых клеток, поскольку достаточная васкуляризация является одним из ключевых факторов для дальнейшей эффективной регенерации костной ткани [9, 30]. Кроме того, доказано, что значимую роль в остеогенезе играет паракринное взаимодействие между стволовыми клетками, проходящими остеогенную дифференци-ровку, и микроваскулярными эндотелиальными клетками [12].

Результаты эксперимента показали явное преимущество использования импланта «Остеоматкрикс», насыщенного стволовыми клетками. Очевидными эффектами их применения являются модификация иммунного ответа на им-плантат, препятствующий его инкапсуляции, а также процесса прямого остеогенеза и активации ангиогенеза.

Выводы. 1. Продемонстрирована выраженная адгезия ММСК КМ на поверхности образцов «Остеоматрикса», что свидетельствует о возможности совместного использования этого материала в качестве носителя для МСК при восстановлении дефектов костной ткани.

Реорганизации тканей и остеосинтез при использовании ненагруженного «Остеоматрикса» в срок от 60 дней после операции проходит через непрямой остеогенез с образованием в дальнейшем полноценной костной ткани, что увеличивает время полного заживления дефекта.

Реорганизации тканей и остеосинтез при использовании «Остеомат-рикса», нагруженного ММСК-КМ, в срок от 60 дней после операции проходит путем прямого остеогенеза с образованием полноценной костной ткани.

Нагрузка «Остеоматрикса» стволовыми клетками стимулирует неоангио-генез, что способствует активации репаративных процессов костной ткани и стимулирует процессы остеоинтеграции ксенотрансплантатов.

Нагрузка «Остеоматрикса» стволовыми клетками стимулирует пролифе-ративную активность ткани, что подтверждает рост индекса пролиферации Ki-67, и способствует репаративным процессам костной ткани, а также стимулирует остеоинтеграцию ксенотрансплантатов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Литература

1. Волова Л.Т., Трунин Д.М., Пономарева Ю.Я., Попов Н.В. Исследование биосовместимости и цитотоксичности персонифицированных костных имплантатов с применением клеточных технологии // Вестник медицинского института «РЕАВИЗ» (Реабилитация, врач и здоровье). 2017. № 5. С. 32-39.

2. Тепляшин А.С., Шарифуллина С.З., Чупикова Н.И., Сепиашвили Р.И. Перспективы использования мультипотентных стволовых клеток костного мозга и жировой ткани в регуляции регенерации опорных тканей // Аллергология и иммунология. 2015. Т. 1, № 6. С. 138-148.

3. Athanasiou V.T., Papachristou D.J., Panagopoulos A. et al. Histological comparison of autograft, allograft-DBM, xenograft, and synthetic grafts in a trabecular bone defect: An experimental study in rabbits. Med Sci Monit, 2010, vol. 6(1), pp. 24-31. PMID: 20037482.

4. Bartholomew A., Polchert D, Szilagyi E. et al. Mesenchymal stem cells in the induction of transplantation tolerance. Transplantation, 2009, vol. 87(9), pp. 55-57. DOI: 10.1097/TP.0b013e3181a287e6.

5. Blanco J.F., Villaron E.M., Pescador D. et al. Autologous mesenchymal stromal cells embedded in tricalcium phosphate for posterolateral spinal fusion: Results of a prospective phase I/II clinical trial with long-term follow-up. Stem Cell Res Ther, 2019, vol. 10(1), p. 63. DOI: 10.1186/s13287-019-1166-4.

6. Bueno E.M., Glowacki J. Cell-free and cell-based approaches for bone regeneration. Nat Rev Rheumatol, 2009, vol. 5(12), pp. 685-697. DOI: 10.1038/nrrheum.2009.228.

7. Cao W., Cao K, Cao J., Wang Y., Shi Y. Mesenchymal stem cells and adaptive immune responses. Immunol Lett, 2015, vol. 168(2), pp. 147-153. DOI: 10.1016/j.imlet.2015.06.003.

8. Derman P.B., Singh K. Surgical Strategies for the Treatment of Lumbar Pseudarthrosis in Degenerative Spine Surgery: A Literature Review and Case Study. HSS J., 2020, vol. 16(2), pp. 183-187. DOI: 10.1007/s11420-019-09732-9. Epub 2019 Oct 30.

9. Diomede F, Marconi G.D., Fonticoli L. et al. Functional Relationship between Osteogenesis and An-giogenesis in Tissue Regeneration. Int J Mol Sci, 2020, vol. 21(9), pp. 3242. DOI: 10.3390/ijms21093242.

10. Formica M., Vallerga D., Zanirato A. et al. Fusion rate and influence of surgery-related factors in lumbar interbody arthrodesis for degenerative spine diseases: A meta-analysis and systematic review. Musculoskelet Surg, 2020, vol. 104(1), pp. 1-15. DOI: 10.1007/s12306-019-00634-x.

11. Fu J., Wang Y., Jiang Y. et al. Systemic therapy of MSCs in bone regeneration: a systematic review and meta-analysis. Stem Cell Res Ther., 2021, vol. 12(1), p. 377. DOI: 10.1186/s13287-021-02456-w.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

12. Genova T, Petrillo S., Zicola E. et al. The Crosstalk Between Osteodifferentiating Stem Cells and Endothelial Cells Promotes Angiogenesis and Bone Formation. Front Physiol., 2019, no. 10, p. 1291. DOI: 10.3389/fphys.2019.01291.

13. Granero-Molto F., Weis J.A., Miga M.I. et al. Regenerative effects of transplanted mesenchymal stem cells in fracture healing. Stem Cells, 2009, vol. 27(8), pp. 1887-1898. DOI: 10.1002/stem.103.

14. Katagiri W., Kawai T., Osugi M. et al. Angiogenesis in newly regenerated bone by secretomes of human mesenchymal stem cells. Maxillofac Plast Reconstr Surg., 2017, vol. 39(1), p. 8. DOI: 10.1186/s40902-017-0106-4.

15. Kiernan C.H., Wolvius E.B., Brama P.A.J., Farrell E. The immune response to allogeneic differentiated mesenchymal stem cells in the context of bone tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev., 2018, vol. 24(1), pp. 75-83. DOI: 10.1089/ten.teb.2017.0175.

16. Le Blanc K, Frassoni F., Ball L. et al. Developmental Committee of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: A phase II study. Lancet, 2008, vol. 371(9624), pp. 1579-1586. DOI: 10.1016/s0140-6736(08)60690-x.

17. Lin H., Sohn J., Shen H. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials, 2019, no. 203, pp. 96-110. DOI: 10.1016/j.bi-omaterials.2018.06.026.

18. Liu H, Li D, Zhang Y., Li M. Inflammation, mesenchymal stem cells and bone regeneration. Histochem Cell Biol., 2018, vol. 149(4), pp. 393-404. DOI: 10.1007/s00418-018-1643-3.

19. Makino T, Tsukazaki H., Ukon Y. et al. The biological enhancement of spinal fusion for spinal degenerative disease. Int J Mol Sci., 2018, vol. 19(8), p. 2430. DOI: 10.3390/ijms19082430.

20. Martin V., Bettencourt A. Bone regeneration: Biomaterials as local delivery systems with improved osteoinductive properties. Mater Sci Eng C Mater Biol., 2018, vol. 82(1), pp. 363-371. DOI: 10.1016/j.msec.2017.04.038.

21. Mummaneni P.V., Dhall S.S., Eck J.C. et al. Guideline update for the performance of fusion procedures for degenerative disease of the lumbar spine. Part 11: Interbody techniques for lumbar fusion. J Neurosurg Spine, 2014, vol. 21(1), pp. 67-74. DOI: 10.3171/2014.4.SPINE14276.

22. Pape H.C., Evans A., Kobbe P. Autologous bone graft: Properties and techniques. J Orthop Trauma, 2010, vol. 24(1), pp. 36-40. DOI: 10.1097/bot.0b013e3181cec4a1.

23. Qin Y., Guan J., Zhang C. Mesenchymal stem cells: mechanisms and role in bone regeneration. Postgrad Med J, 2014, vol. 90(1069), pp. 643-647. DOI: 10.1136/postgradmedj-2013-132387.

24. Rahimzadeh A., Mirakabad F.S., Movassaghpour A. et al. Biotechnological and biomedical applications of mesenchymal stem cells as a therapeutic system. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2016, vol. 44(2), pp. 559-570. DOI: 10.3109/21691401.2014.968823.

25. Reisener M.J., Pumberger M., Shue J. et al. Trends in lumbar spinal fusion - a literature review. J Spine Surg, 2020, vol. 6(4), pp. 752-761. DOI: 10.21037/jss-20-492.

26. Resnick D.K., Watters W.C., Sharan A. et al. Guideline update for the performance of fusion procedures for degenerative disease of the lumbar spine. Part 9: Lumbar fusion for stenosis with spondylolisthesis. J Neurosurg Spine, 2014, vol. 21(1), pp. 54-61. DOI: 10.3171/2014.4.SPINE14274.

27. Shin R.L., Lee C.W., Shen O.Y. et al. The Crosstalk between Mesenchymal Stem Cells and Macrophages in Bone Regeneration: A Systematic Review. Stem Cells Int., 2021, no. 14, 8835156. DOI: 10.1155/2021/8835156.

28. Todeschi M.R., El Backly R., Capelli C. et al. Transplanted umbilical cord mesenchymal stem cells modify the in vivo microenvironment enhancing angiogenesis and leading to bone regeneration. Stem Cells Dev., 2015, vol. 24(13), pp. 1570-1581. DOI: 10.1089/scd.2014.0490.

29. Yousefi AM.., James P.F., Akbarzadeh R. et al. Prospect of stem cells in bone tissue engineering: A review. Stem Cells Int., 2016, vol. 2016, 6180487. DOI: 10.1155/2016/6180487.

30. Zigdon-Giladi H., Rudich U., Michaeli Geller G., Evron A. Recent advances in bone regeneration using adult stem cells. World J Stem Cells, 2015, vol. 7(3), pp. 630-640. DOI: 10.4252/wjsc.v7.i3.630.

БОКОВ АНДРЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ - кандидат медицинских наук, заведующий кафедрой травматологии ортопедии и нейрохирургии имени М.В. Колокольцева, заведующий отделением онкологии и нейрохирургии (церебральное подразделение) Института травматологии и ортопедии Университетской клиники, Приволжский исследовательский медицинский университет, Россия, Нижний Новгород (bocov_a@pimunn.net; ОКОЮ: http://orcid.org/0000-0002-5203-0717).

ОРЛИНСКАЯ НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА - доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой патологической анатомии, главный научный сотрудник, заведующий группой патологической анатомии отделения лабораторной диагностики научно-клинического отдела Института травматологии и ортопедии (наука) Университетской клиники, Приволжский исследовательский медицинский университет, Россия, Нижний Новгород (orlinskaya_n@pimunn.net; ОКОЮ: http://orcid.org/0000-0003-2896-2968).

БУЛКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры травматологии ортопедии и нейрохирургии имени М.В. Колокольцева, врач-нейрохирург Университетской клиники, Приволжский исследовательский медицинский университет, Россия, Нижний Новгород (bulkin_a@pumunn.net; ОКОЮ: http://orcid.org/0000-0003-4391-7698).

АЛЕЙНИК ДИНА ЯКОВЛЕВНА - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории регенеративной медицины НИИ экспериментальной онкологии и биомедицинских

технологий, Приволжский исследовательский медицинский университет, Россия, Нижний Новгород (aleynic_d@pimunn.net; ОКОЮ: http://orcid.org/0000-0002-8339-1291).

ЧАРЫКОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА - врач лаборатории биотехнологий Университетской клиники, Приволжский исследовательский медицинский университет, Россия, Нижний Новгород (charikova_i@pimunn.net; ОКОЮ: http://orcid.org/0000-0002-8224-6375).

ЕГОРИХИНА МАРФА НИКОЛАЕВНА - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории регенеративной медицины НИИ экспериментальной онкологии и биомедицинских технологий, Приволжский исследовательский медицинский университет, Россия, Нижний Новгород (egorichina_m@pimunn.net; ОКОЮ: http://orcid.org/0000-0002-8815-9651).

АНТОШИНА ВЕРОНИКА ВЯЧЕСЛАВОВНА - кандидат биологических наук, научный сотрудник группы патологической анатомии отделения лабораторной диагностики научно-клинического отдела Института травматологии и ортопедии (наука) Университетской клиники, Приволжский исследовательский медицинский университет, Россия, Нижний Новгород (antoshina_v@pimunn.net; ОКОЮ: http://orcid.org/0000-0002-8244-3985).

Andrey E. BOKOV, Natalia Yu. ORLINSKAYA, Anatoliy A. BULKIN, Diana Ya. ALEINIK, Irina N. CHARYKOVA, Marfa N. EGORIKHINA, Veronika V. ANTOSHINA

EFFECT OF USING MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS IN BONE GRAFTING WITH XENOGENIC BIOMATERIALS

Key words: osteogenesis, bone tissue repair, xenograft, bone grafting, cellular technologies, mesenchymal stromal cells.

Currently, there is a significant frequency of degenerative diseases of the spine after surgical interventions with the use of bone grafting, especially in elderly patients. The results of the research indicate that the use of stem cells is one of the promising areas to increase the efficiency of osse-ointegration.

The aim of the study was to evaluate the effectiveness of osteogenesis in the conditions of using xenografts loaded with stem cells, as well as morphological features of osseointegration. Materials and methods. An experimental study was conducted on 22 male rabbits. 2 animals were used to obtain stem cells, the remaining animals were implanted with xenogenic bone-substituting material "Osteomatrix" in the iliac wing, of which 10 animals were implanted with a xenograft not populated with cells, and the other 10 animals were implanted with an identical xenograft populated with mesenchymal stromal cells. Withdrawal from the experiment was carried out on the 60th day after implantation. The material's examination was carried out using the methods of fluorescence and light microscopy. To assess the statistical significance of observed differences (evaluation of proliferation, neoangiogenesis and osseointegration) in the experimental and control groups, the Mann-Whitney U test was used with a critical significance of p < 0.05. Results. When using an osteoplastic material that was not loaded with multipotent mesen-chymal stromal cells within 60 days after surgery, osseointegration passes through indirect osteogenesis with formation of full-fledged bone tissue in the future, which increases the time of complete defect healing. In the case of using an osteomatrix loaded with multipotent mes-enchymal stromal cells of the bone marrow, osteogenesis proceeds in a direct way with the formation of a full-fledged bone tissue. Osteomatrix loading with multipotent mesenchymal stromal cells stimulates neoangiogenesis and proliferative activity of the tissue, which promotes activation of bone tissue repair processes and stimulates the processes of xenograft osseointegration.

Conclusions. The use of multipotent mesenchymal stromal cells in bone grafting using xenografts increases the efficiency of osseointegration by stimulating direct osteogenesis, increasing the activity of proliferation and angiogenesis.

References

1. Volova L.T., Trunin D.M., Ponomareva Yu.Ya., Popov N.V. Issledovanie biosovmestimosti i tsitotoksichnosti personifitsirovannykh kostnykh implantatov s primeneniem kletochnykh tekhnologii [assessment of biocompatibility and cytotoxicity of personalized bone implants using cell cultures]. Vestnik meditsinskogo instituta «REAVlZ» (Reabilitatsiya, vrach i zdorov'e), 2017, no. 5, pp. 32-39.

2. Teplyashin A.S., Sharifullina S.Z., Chupikova N.I., Sepiashvili R.I. Perspektivy ispol'zovaniya mul'tipotentnykh stvolovykh kletok kostnogo mozga i zhirovoi tkani v regulyatsii regeneratsii opornykh tkanei [Prospects for the use of multipotent stem cells of bone marrow and adipose tissue in the regulation of regeneration of supporting tissues]. Allergologiya i immunologiya, 2015, vol. 1, no. 6, pp. 138-148.

3. Athanasiou V.T., Papachristou D.J., Panagopoulos A. et al. Histological comparison of autograft, allograft-DBM, xenograft, and synthetic grafts in a trabecular bone defect: An experimental study in rabbits. Med Sci Monit, 2010, vol. 6(1), pp. 24-31. PMID: 20037482.

4. Bartholomew A., Polchert D., Szilagyi E. et al. Mesenchymal stem cells in the induction of transplantation tolerance. Transplantation, 2009, vol. 87(9), pp. 55-57. DOI: 10.1097/TP.0b013e3181a287e6.

5. Blanco J.F., Villaron E.M., Pescador D. et al. Autologous mesenchymal stromal cells embedded in tricalcium phosphate for posterolateral spinal fusion: Results of a prospective phase I/II clinical trial with long-term follow-up. Stem Cell Res Ther, 2019, vol. 10(1), p. 63. DOI: 10.1186/s13287-019-1166-4.

6. Bueno E.M., Glowacki J. Cell-free and cell-based approaches for bone regeneration. Nat Rev Rheumatol, 2009, vol. 5(12), pp. 685-697. DOI: 10.1038/nrrheum.2009.228.

7. Cao W., Cao K., Cao J., Wang Y., Shi Y. Mesenchymal stem cells and adaptive immune responses. Immunol Lett, 2015, vol. 168(2), pp. 147-153. DOI: 10.1016/j.imlet.2015.06.003.

8. Derman P.B., Singh K. Surgical Strategies for the Treatment of Lumbar Pseudarthrosis in Degenerative Spine Surgery: A Literature Review and Case Study. HSS J., 2020, vol. 16(2), pp. 183-187. DOI: 10.1007/s11420-019-09732-9. Epub 2019 Oct 30.

9. Diomede F., Marconi G.D., Fonticoli L. et al. Functional Relationship between Osteogenesis and An-giogenesis in Tissue Regeneration. Int J Mol Sci., 2020, vol. 21(9), pp. 3242. DOI: 10.3390/ijms21093242.

10. Formica M., Vallerga D., Zanirato A. et al. Fusion rate and influence of surgery-related factors in lumbar interbody arthrodesis for degenerative spine diseases: A meta-analysis and systematic review. Musculoskelet Surg, 2020, vol. 104(1), pp. 1-15. DOI: 10.1007/s12306-019-00634-x.

11. Fu J., Wang Y., Jiang Y. et al. Systemic therapy of MSCs in bone regeneration: a systematic review and meta-analysis. Stem Cell Res Ther., 2021, vol. 12(1), p. 377. DOI: 10.1186/s13287-021-02456-w.

12. Genova T., Petrillo S., Zicola E. et al. The Crosstalk Between Osteodifferentiating Stem Cells and Endothelial Cells Promotes Angiogenesis and Bone Formation. Front Physiol., 2019, no. 10, p. 1291. DOI: 10.3389/fphys.2019.01291.

13. Granero-Molto F., Weis J.A., Miga M.I. et al. Regenerative effects of transplanted mesenchymal stem cells in fracture healing. Stem Cells, 2009, vol. 27(8), pp. 1887-1898. DOI: 10.1002/stem.103.

14. Katagiri W., Kawai T., Osugi M. et al. Angiogenesis in newly regenerated bone by secretomes of human mesenchymal stem cells. Maxillofac Plast Reconstr Surg., 2017, vol. 39(1), p. 8. DOI: 10.1186/s40902-017-0106-4.

15. Kiernan C.H., Wolvius E.B., Brama P.A.J., Farrell E. The immune response to allogeneic differentiated mesenchymal stem cells in the context of bone tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev., 2018, vol. 24(1), pp. 75-83. DOI: 10.1089/ten.teb.2017.0175.

16. Le Blanc K., Frassoni F., Ball L. et al. Developmental Committee of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: A phase II study. Lancet, 2008, vol. 371(9624), pp. 1579-1586. DOI: 10.1016/s0140-6736(08)60690-x.

17. Lin H., Sohn J., Shen H. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials, 2019, no. 203, pp. 96-110. DOI: 10.1016/j.bi-omaterials.2018.06.026.

18. Liu H., Li D., Zhang Y., Li M. Inflammation, mesenchymal stem cells and bone regeneration. Histochem Cell Biol., 2018, vol. 149(4), pp. 393-404. DOI: 10.1007/s00418-018-1643-3.

19. Makino T., Tsukazaki H., Ukon Y. et al. The biological enhancement of spinal fusion for spinal degenerative disease. Int J Mol Sci., 2018, vol. 19(8), p. 2430. DOI: 10.3390/ijms19082430.