CC BY
30
УДК: 591.133.2:612.616:636.4:591.133.13
Корбецький А.Р.2
1нститут бюлогптваринНААН
К1НЕМАТИЧН1 ПОКАЗНИКИ СПЕРМПВ ТА ЗБЕРЕЖЕШСТЬ ÏX АКРОСОМ ЗА ДОДАВАННЯ ОМ'ЯНО! ПЛАЗМИ ДО ДЕКОНСЕРВОВАНО! СПЕРМИ ПС1В
У cmammi наведено результаты дослгдженъ вплыву плазмы спермы доданог до деконсервованог спермы ncie на актывшстъ спермИ'в, выжывашстъ, ктематычш показныкы та збережешстъ акросом спермпв. За eidcornxoM рухлывых спермпв та спермпв з прямол1шыным поступалъным рухом не встановлено вгроггдных ргзныцъ м1ж р1знымы розбавныкамы по цых показныках. OxpeMi ктематычш показныкы спермпв eiposidno вгдргзнялысъ пры выкорыстант ргзныхрозбавнытв, а саме: загалънарухлыв1стъ (р < 0,05), VSL, VCL, ALH, STR i LIN (р < 0,01). Спермп, розбавлеш з ПР малы ныжч1 показныкы VCL (1 i 3 год), ALH (0, 1 i 3 год) i кглъкгстъ спермпв з прямолшыным рухом (0, 1 i 3 год) у nopieHMHHi гз зразкамы, ят розбавлеш з Tris-середовыщем у процеа ткубацп, вказуючы на ныжчыы pieenb спермпв з г1перактывным рухом. Середовыще для деконсервацп не вплывало на стутнь ушкодження акросом - пры выкорыстанш як простатног ргдыны i mpic-буфера для розбавлення показалы прыблызно однаковi результаты.
Крюконсерващя спермив е важливим шструментом для забезпечення генетично! р1зномаштносп i для бютехнологи вщтворення р1зних вид1в тварин. Однак, стан крюконсерваци сперми собак е все ще неоднозначным або незадовшьним. Р1вень результативных оаменшь е надзвичайно вар1абельним i загалом е нижчим, шж при оаменшш св1жою спермою [1]. 1снуе багато фактор1в, як1 впливають на функцюнальне виживання заморожено! сперми собак. Ускладнюе вдосконалення метод1в заморожування те, що сперми вщ р1зних особин можуть показувати р1зну стшккть до заморожування при використанш однакових протокол1в [2, 3].
Простата е единою допом1жною статевою залозою урогештального тракту собак i простатна рщина е практично единим компонентом ам'яно! плазми. Секрет простати в собак мютить дуже низький ршень фруктози [3, 4], також мютить низьку концентрацию кисло! фосфатази, в 10 раз меншу концентрацию, шж в людськш ам'янш плазм1 i дуже високий р1вень аргшшестерази [5]. Бюлопчна функщя цих складниюв потребуе подальшого дослщження [6].
Pi3Hi дослщження демонструють негативний вплив секрету простати на сперми шкубоваш in vitro: розбавлення сперми собак з Ым'яною плазмою (СП) спричиняе зниження рухливосп i юльюсть морфолопчно нормальних cnepMiÏB теля 2 год
2
Науковий кер1вник - доктор сшьськогосподарських наук M. М. Шаран Корбецький А.Р. 2013
116
шкубаци при 37 °C [7]. Секрет простата також чинить шкщливий вплив на збережешсть спермпв, як шсля охолодження до 4 °C [6] так i при крюконсерваци [7]. 1нш1 експерименти показали, що контакт плазми сперми з епщидимальними сперм1ями перед заморожуванням покращив заплщнювашсть теля внутршньоматкового оаменшня [8], також використання СП для розбавлення вщтало! сперми собак призвело до вищо! заплщнюваност1 теля штравагшальних оаменшь [9,10].
Капацитащя i акросомна реакщя, що вщбуваеться в жшочому статевому тракт1 проходять незадовго до заплщнення яйцекл1тини, i якщо воно не вщбуваеться, сперми швидко гинуть. Одшею i3 функцш СП собак е здатшсть вкривати сво1ми бшками мембрани спермпв тим самим маскуючи рецептори прогестерону i затримуючи капацитацш [13]. Оскшьки, процес заморожування-вщтавання спричиняе дестабшзацш мембран спермпв, яка е схожою до капацитаци [14], вважаеться, що присутшсть СП пригшчуе чи нав1ть вщвертае капацитацш спермпв, продовжуючи виживання спермпв.
Тому, метою наших дослщжень було вивчення впливу секрету простата при додаванш до розморожено! сперми nciß та шкубаци з нею на актившсть, цшсшсть цитоплазматичних мембран та акросом спермпв.
Матер1али i методи.
Для дослщжень використовували дев'ять клЫчно здорових статевозрших nciß вжом 2-5 р, р1зних порщ та живою масою, а саме: тварини зм1шано! породи (n=2), що утримувались у вольер1 при 1нститут1 бюлогп тварин НААН (м.Льв1в) та тварини, що приватно утримувались власниками i були систематично залучеш у дослщження, порщ - доберман тнчер (n=1), англшський бульдог (n=3), шмецька в1вчарка (n=2), кавказька в1вчарка (n=1).
Bei маншуляцп з тваринами проводились в дослщнш клшщ1 Лаборатори ф1зюлогп та патологи вщтворення тварин 1нституту бюлоги тварин НААН (м.Льв1в). Сперму вщ пщдослщних neiß вщбирали не частше, шж раз на тиждень i не рщше шж раз на два тижш. Перед взяттям сперми препущальний OTBip очищався ватними дисками змоченими ф1зюлопчним розчином вщ залишюв ceni та шших видимих забруднень. Biflöip сперми проводився мануально, як було описано [12], в ПВХ рукавищ, методом мастурбацп в попередньо пвдгрт до температури 37 °C стерильш лшки та градуйоваш пластиков! проб1рки об'емом 15 мл. Для бшьшост1 дослщжень використовували тшьки другу фракцш еякуляту, третю, простатну фракцш, використовували для вивчення впливу секрету простата на яккть спермпв собак при шкубаци з нею теля деконсерваци. Шсля взяття сперма помщалась у водяний термостат (37 °C ) до оцшки якост1 i подальших технолопчних процедур.
Св1жоотримаш еякуляти оцшювали за об'емом (мл), актившетю (%) та концентращею спермпв. Для заморожування допускались еякуляти з концентращею не менше 100 млн/мл, актившетю не менше 70 % i з кшькктю патолопчних форм не бшьше 15 %. Заморожування сперми здшенювали в соломинках 0,5 мл (IMV, Франщя) на програмному заморожувач1 Planer R 204 (Великобриташя). Шсля заюнчення програми заморожування, соломинки
117
переносили у рщкий азот (-196 °С). Деконсервацш спермпв проводили у водянш баш при 70 °С впродовж 8 с.
Комп'ютерний анал1з руху спермпв проводився в НВЦ "Захщплемресурси" на сисием1 Sperm Vision (Minitube, Шмеччина). Результат зшмався з м1кроскопа Olympus (Япошя) методом позитивного фазового контрасту, при збшьшенш х 200. Пять пол1в зору випадково обиралися та пщраховувалось середне. Швидккть камери налаштовувалась на 20 кадр1в в секунду. Обекти, розмщеш в камер^ розтзнавались як спермп за розм1рами i яскрав1стю.
Цшсшсть акросом спермИв визначали при допомоз1 маркерного фермента акрозину, який знаходиться в неушкоджен1й акросом1 [1]. При порушенш ц1л1сност1 акросомально! мембрани акрозин разом з ¿ншим вм1стимим акросом виходить в оточуюче спермИ! середовище. Зростання активност1 акрозину в середовищ1 прямопропорц1йне ступеню ушкодження акросом. Збережешсть акросом (ЗА) вираховували за формулою:
ЗА% = 100% х (макс_акро - досл_акро) / макс_акро
де:
макс_акро - активн1сть акрозину в середовищ1 при примусовому ушкоджен1 акросом в суспензИ св1жоотриманих спермИв з концентрац1ею 100 х 106 спермп'в/мл при допомоз1 Triton X-100, i вважалось що ушкодилось 100% акросом;
досл_акро - активн1сть акрозину в дослщному зразку.
Статистичну обробку даних зд1йснювали за допомогою пакету програм Statistica 8 (StatSoft, США).
Результата та обговорення.
Статистичним анал1зом не виявлено в1рог1дних р1зниць м1ж р1зними розбавниками за показниками рухливост1 спермпв (табл.1).
Таблиця 1
Ввдсоток рухливих cnepMiiB та спермй' з ППР (%), п1сля розмороження та
шкубацй' з Tris буфером або с1м'яною плазмою (n=9, M±m)
Загальна рухливкть (%) CnepMii з ППР (%)
0 год
ПР 54,7±4,3a 39,8±4,3
Tris 48,6±3,2b 36,4±1,4
1 год
ПР 36,9±3,9 34,5±1,6
Tris 39,1±3,0 33,8±1,2
2 год
ПР 33,6±3,5 32,8±1,2
Tris 37,2±3,9 33,3±1,2
3 год
ПР 28,1±2,5 31,4±0,6
Tris 31,9±3,0 32,2±0,9
4 год
ПР 4,5±1,1 30,1±0,1
Tris 30,8±3,7 31,6±0,8
118
Ом'яна плазма не продовжуе виживання спермив теля розморожування. Рухлив1сть спермив знизилась до менш, тж 5 % впродовж 4 год шкубування теля розморожування в зразках розбавлених з Ым'яною плазмою.
Деяю з показниюв отриманих з допомогою Sperm Vision (табл. 2) в1рогщно вщр1знялись при використанш р1зних розбавниюв, а саме: загальна рухлив1сть (P < 0,05), VSL, VCL, ALH, STR i LIN (P < 0,01).Б1льше того, шдивщуальт р1знищ завжди були статистично в1рогщними (P < 0,01).
Таблиця 2
Кшематичш показники спермив шеля розмороження та ¡нкубацн з Tris
VAP (мм/с) VSL (мм/с) VCL (мм/с) ALH (мм) BCF (Гц) STR (%) LIN (%)
0 год
ПР 84,2±4,2 77,9±3,9* 114,0±4,9 4,6±0,1' 25,3±1,2 90,8±0,4 67,5±1,2'
Tris 77,7±5,0 70,8±5,0" 111,5±5,3 5,1±0,2' ' 25,7±1,3 85,1±5,0 63,4±2,0' '
1 ГОД
ПР 82,2±5,1 75,7±4,9" 115,4±5,6* 5,0±0,2' ' 26,3±1,0 91,0±0,7' 65,8±2,2'
Tris 74,4±4,8 63,7±4,7" 125,3±7,1* 6,5±0,4* 24,1±1,2 85,0±1,6" 54,1±2,8"
2 год
ПР 85,2±5,0 77,4±5,1 120,1±8,2 5,5±0,4 20,1±1,9 88,7±1,4' ' 65,9±3,3
Tris 74,7±5,0 72,3±4,7 127,4±6,0 6,3±0,4 22,5±2,5 83,3±1,7 ' 51,3±3,1
3 год
ПР 72,2±6,8 64,1±6,8 108,2±7,2" 6,3±0,5' ' 20,4±1,9 87,6±1,1 60,2±3,4' '
Tris 75,9±5,3 64,2±5,0 130,6 ±7,5' 7,2±0,4' 20,8±2,5 83,9±1,1 50,7±2,6' '
Примита - в1ропднар1зниця при р < 0,05, - в1ропдно при р < 0,01,
Розглядаючи шдивщуальт часов! вщр1зки, загальна рухливкть зразюв розбавлених Í3 простатною фракщею була вищою одразу теля розбавлення (р < 0,05). iHmi параметри рухливост1 отримат за допомогою комп'ютерного анал1затора показали pÍ3HÍ залежност1 м1ж розбавленням простатною фракщею i Tris-середовищем: VSL було в1рогщно вищим у зразку сперми розбавлено! простатною фракщею при розморожуванн1 i теля 1 год шкубацп (р < 0,05). Також, STR i LIN були вищ1 в зразках, розбавлених СП на 1 i 2 год та на 0, 1 i 3 год, вщповщно. У свою чергу, VCL i ALH були в1рогщно вищ1 в зразках розбавлених Tris середовищем на 1 i 3 год (P < 0,01) i на 0 1 год (P < 0,01) i на 3 год (P < 0,05), вщповщно.
Сперми, розбавлет з ПР мали нижчий VCL (1 i 3 год), ALH (0, 1 i 3 год) i вищу кшьккть спермй'в з прямолшшним рухом (0, 1 i 3 год) у пор1внянш Í3 зразками, яю розбавлен1 з Tris-середовищем у процеа iHKy6au;iï, вказуючи на нижчий р1вень спермив з г1перактивним рухом [12]. Причиною цього може бути те, що СП заблоковуе чи вщвертае 3míhh в плазматичних мембранах схожих на капацитацш, спричинених р1зкими температурними перепадами, що виникають в процес1 кр1оконсервацй [13], але це може бути можливим т1льки в тому випадку, якщо в cnepMi ще не в1дбулось акросомно! peaKqiï [14], ця г1потеза заперечить нашим дослщженням.
119
Загальна рухливють 1 VSL були вищ1 в зразках розбавлених простатичною рщиною теля розмороження (0 I 1 год, вщповщно) I знизилось до р1вня зразюв спермив розбавлених з Tris-cepeдoвищeм. Цд результата частково не узгоджуються з результатами отриманими попередшми дослщженнями деяких автор1в [10], де не спостеркшюсь р1знищ м1ж зразками розбавленими з СП, ф1зичним розчином чи середовищем TALP без альбумшу аж до 210 хв шкубацн теля розморожування.
Додавання СП до сперми собак в1рогщно вплинуло на окрем1 параметри якост1 сперми теля розморожування, хоча I не мало впливу на виживашсть сперми I цшсшсть акросомальних мембран (рис 1). [12] показали схож1 результата, але припустили, що с1м'яна плазма може термшувати акросомш реакцп. Однак у наших дослщженнях середовище для деконсервацн не впливало на стутнь ушкодження акросом I при використанш простатно! рщини 1 трю-буфера для розбавлення отримано приблизно однаковий результат.
Рис 1. Збережешсть акросом спермй'в ¡нкубованих з Tris-буфером чи им'яною плазмою протягом 2 годин (М±ш)
Висновки.
За вщсотком рухливих спермпв та спермпв з прямолшшним поступальним рухом не встановлено шяких в1рогщних р1зниць м1ж р1зними розбавниками. С1м'яна плазма не продовжуе виживашсть спермив теля розморожування. Спермп, розбавлеш з ПР мали нижч1 VCL (1 i 3 год), ALH (0, 1 i 3 год) i бшьшу кшьккть спермпв з прямолшшно-поступальним рухом (0, 1 i 3 год) у пор1внянш i3 зразками, яю розбавлеш з Tris-середовищем у процес1 шкубацн, вказуючи на нижчий р1вень спермив з гшерактивним рухом. Середовище для деконсервацн не впливало на стутнь ушкодження акросом при
120
використанш простатно! рщини i трю-буферу для розбавлення отрмано приблизно однаков1 результати.
Л1тература
1. Ескин Г. В. Теория и практика искусственного осеменения свиней свежевзятой и замороженной спермой / Г. В. Ескин., А. Г.Нарижный., Г. С. Походня // Монография. - Белгород : Везелица, —2007. —253 с.
2. Наук В. А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации / В. А. Наук // Кишинев, —1991. —198с.
3. Антонюк В. Биохимический контроль за качеством спермы / В. Антонюк // Доклады ВАСХНИЛ. —1980. —№ 1. —С. 27-30.
4. Курбатов А. Д. Криоконсервация сперми сельскохозяйственных животных / А.Д.Курбатов., Е.В.Платов., Н.В.Корбан., Л.Г.Мороз., В.А. Наук. и др. // Л.: Агропромиздат Ленингр. отд-ние, —1988. — 256с.
5. Nothling JO, Shuttleworth R, de Haas K, Thompson PN. Homologous prostatic fluid added to frozen-thawed dog spermatozoa prior to intravaginal insemination of bitches resulted in better fertility than albumin-free TALP. Theriogenology 2005;64:975- 91.
6. Doak RL, Hall A, Dale HE. Longevity of spermatozoa in the reproductive tract of the bitch. J Reprod Fertil 1967;13: 51-8.
7. Ellington JE, Meyers-Wallen VN, Ball BA. Establishment of a coculture system for canine sperm and uterine tube epithelial cells. Vet Rec 1995;136:543-4.
8. Eilts BE. Theoretical aspects of canine cryopreserved semen evaluation. Theriogenology 2005;64:685-91.
9. Troedsson MHT, Desvousges A, Alghamdi AS, Dahms B, Dow CA, Hayna J, Valesco R, Collahan PT, Macpherson ML, Pozor M, Buhi WC. Components in seminal plasma regulating sperm transport and elimination. Anim Reprod Sci 2005;89:171-86.
10. Strzemienski PJ. Effect of bovine seminal plasma on neutrophil phagocytosis of bull spermatozoa. J Reprod Fertil 1989;87:519- 28.
11. Rozeboom KJ, Rocha-Chavez G, Troedsson MHT. Inhibition of neutrophil chemotaxis by pig seminal plasma in vitro: a potential method for modulating post-breeding inflammation in sows. Reproduction 2001;121:567-72.
12. Linde-Forsberg C. Hints on dog semen freezing, cryoextenders, and frozen semen artificial insemination. In: Proceedings from the society for theriogenology meeting. Colorado, Springs; August 2002. p. 303-20.
13. Seager SJ, Fletcher WS. Collection, storage, and insemination of canine semen. Lab Anim Sci 1972;22:177-82.
14. England GCW, Burgess CM, Freeman SL, Smith SC, Pacey AA. Relationship between the fertile period and sperm transport in the bitch. Theriogenology 2006;66:1410-8.
121
Summary A. R. Korbetsyy
EFFECT OF SEMINAL PLASMA ADDITION AFTER DOG SEMEN THAWING ON THE KINEMATIC INDEXES AND INTACTNESS OF
SPERM ACROSOME
In this article are given the study results of impact of plasma added to thawed dog semen on the sperm motility, progressive activity, kinematic parameters and sperm acrosome intactness. The percentage of motile spermatozoa and spermatozoa with a straight forward movement did not show any significant difference between diluents by these terms. The motility decreased to less than 5 % within 4 h of incubation after thawing in samples diluted with seminal plasma. Some of the parameters obtained using Sperm Vision differed significantly when using different diluents, such as: total motility (P < 0,05), VSL, VCL, ALH, STR and LIN (P <0,01). Moreover, individual differences were always statistically significant (P < 0,01). Spermatozoa diluted with seminal plasma had lower VCL (1 and 3 h), ALH (0, 1, and 3 h) and a higher number of sperm with a straight motion (0, 1, and 3 h) compared with samples that are diluted with Tris-buffer during incubation, indicating a lower sperm hyperactive movement. According to our research thawing has no effect on the extent of damage and the acrosome when used as prostatic fluid and tris-buffer for dilution showed approximately the same results.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Федорович £.1.
122
