CC BY
22
УДК 636.32/38:591.16.612.063
Корбецька О.О., астрант © 1нститут бюлогптваринНААН Украти, м. Лъвгв
ВПЛИВ ТРИВАЛОСТ1ПРЕ1НКУБАЦП СПЕРМИ КНУР1В ПЕРЕД ЗАМОРОЖУВАННЯМ НА ÏX МОРФО-БЮХ1М1ЧН1 ТА К1НЕМАТИЧН1 ПОКАЗНИКИ ЯКОСТ1 П1СЛЯ ДЕКОНСЕРВАЦН
У cmammi наведено результаты вивчення вплыву часу витримування спермы i типу середовища при 15 °C з 3 до 24 год. Збыъшення часу витримки сперми при 15 °C в середовищ1 "Екосперм" з 3 до 24 год не вплинуло на цтсшстъ плазматичних мембран перед заморожуванням (80,9 i 83,4 %о eidnoeidno) та теля деконсервацп (43,4 i 42,7 %, eidnoeidno). На вгдмгну, eid середовищаЕкосперм, збыъшення часу витримкиу середовищ1 "BTS" з 3 год до 24 год показало docmoeipno нижчу цтсшстъ плазматичних мембран перед заморожуванням з 76,4 % до 70,5 %, шж теля розморожування з 41,6 % до 30,3 %. Збыъшення часу витримки з 3 до 24 год призвело до зниження (р<0,05) тръох з п'яти napaMempie руху теля розморожування (VCL, LIN, i BCF). Тип розбавника не чинив eipozidnozo впливу на iurni юнематичш показники.
Ключов1 слова: сперма, кнур, деконсерващя, Екосперм, BTS.
Застосування ЗС у свинарств1 оправдовуе себе в широкому д1апазош, починаючи i3 генетичних банюв, що гарантують отримання потомства вщ втрачених ссавщв у випадках, коли здшснюеться вимушений забш тварин, при будь-яких шфекцшних спалахах захворювання, або неспод1вано1 загибел1 ц1нних кнур1в. У зв'язку з цим, продаж заморожено! сперми, заметь звичайного продажу живих пл1дник1в, забезпечуе кращий сан1тарний захист господарства. Однак, е проблеми, як1 пов'язан1 з процедурами кр1оконсервац11 i ïx результатами, як1 лежать в ochobî обмеженого використання ЗС у кнур1в. Сперми, як1 розбавлеи1 середовищем, пор1вияио i3 сперм1ями п1сля декоисервац11, показують нижчу виживашеть [1, 2]. Очевидно, що ШО такою спермою спричиняе низький р1вень запл1днюваност1 в межах ~ 40-60 %, що е значно нижче, у пор1внянн1 з використанням розбавлено! сперми >80 % [3, 5]. Сперма кнура волод1е зниженою ст1йк1стю до KpioreHHoi' обробки. Це негативно впливае, як на виживання cnepMiÏB п1сля розморожування, так i на ïx заплщнюючу здатн1сть. При технолопчнш обробц1 сперми, розбавленн1 ïï синтетичними середовищами, охолодженн1 та збер1ганш в замороженому стан1 в1дбуваються значш структурн1, ф1з1олог1чн1 i 6ioxiMÎ4Hi змши, ушкодження cnepMiÏB, що значно знижуе ïx фертильн1сть.
На ochobî багатьох досл1джень було встановлено [5, 6, 7], що сперми кнура дуже чутлив1 до холодового шоку. На початку процедури заморожування, nepmi кл1тинш ушкодження виникають у результат! швидкого охолодження з
©Корбецька О.О., 2013
109
температури сперми при еякуляци до температури нижче 15 °C. В результат! чого втрачаеться життездатшсть значно! кшькост1 спермпв, особливо коли охолодження продовжуеться до 1-2 °C, виникають морфолопчт змши. Коли розбавлену сперму, витримувати при температур! вище 15 °C кшька год, сперми набувають стшкост1 до холодового шоку. Швидке охолодження з 35 °C до 15 °C св1жорозбавлено! сперми призводить до значних втрат рухливост1 тод1 як, при охолодженш великих об'ем1в (100 мл) стшкють спермив до охолодження зростае повшьно. Прешкубащя протягом щонайменше 24 год перед зниженням температури нижче 15 °C пщвищуе стшккть спермпв до холодового шоку, що заслуговуе уваги у повсякденнш робот1 [6, 7].
Змши в сперм1ях, як1 пщвищують стшккть до холодового шоку до сих nip до юнця не з'ясоваш. Як було показано холодовий шок може бути пов'язаний з лшщним складом 6imapy плазматичних мембран, а саме текучють плазматичних мембран. При зниженш температури обмеження латерального руху фосфолшвдв мембран можуть призвести до переходу з рщини до гелево! фази. В результат! того, що pi3Hi мембранн1 л1п!ди мають р1зну температуру переходу може виникати роздшення фаз з одночасною незворотньою кластеризацию проте!н1в мембран. Ц1 автори [8, 10], стверджували, що в1дпов1дь певних кл1тинних мембран на вплив низьких температур т1сно пов'язан1 з мембранним складом цих кл1тин.
При вивчеш можливост1 транспортування сперми кнур1в на велик1 в1дстан1 в лаборатор1ю, щоб провести И заморожування дуже важливим е те, що в процес1 тривалого транспортування як1сть сперми може знижуватись i бути не придатною для заморожування. Як правило, сперма кнура заморожуеться через 3 год теля И взяття [9, 11]. При дослщженш б1льш тривалого часу витримування п1сля взяття (24 год) та температури И витримування повинш бути врахован1 ключов1 параметри якосп сперми, що найб1льше корелюють з фактичною запл1днюючою здатн1стю сперми, а саме: загальна рухлив1сть, к1нематичн1 показники (характеристика швидкост1 i траектор11 руху), цшешеть плазматичних мембран та акросом cnepMiiB.
Враховуючи вищесказане, досл1дження були скерован1 на вивчення впливу тривалшого витримування (24 год) сперми кнура перед заморожуванням в середовищах «Екосперм» та «BTS» на як1сть сперми теля деконсерваци.
Матер1ал i методи. У досл1дах використовували сперму шютьох кл1н1чно-здорових статевозр1лих кнур1в в1ком 2-5 р., живою масою 200 - 340 кг, порщ - велика бша (2), п'етрен (1), ландрас (2), гемпшир (1), що утримувались в ТзОВ НВЦ "31х1дплемресурси" на сухому збалансованому рац1он1. Для дослщжень використовували т1льки 1-шу та 2-гу фракц11 еякуляту.
Сперма була роздшена на 4 частини; 2 частини були розбавлен1 в середовищ1 «BTS», iHmi дв1 частини були розбавлеш в середовищ1 «Екосперм». Розбавлена сперма була повшьно охолоджена до 15 °С протягом 3 год i утримувалась додаткових 21 год для симуляцп тривалого транспортування. Плазма сперми i середовище були в1дд1лен1 шляхом центрифугування.
110
Рухливють, цшсшсть плазматичних мембран та акросом визначались одразу перед заморожуванням i через 30 хв теля розморожування.
Визначення рухливоси, активное^ та юнематичних показниюв якост1 спермив кнура проводився на систем! Sperm Vision (Minitube, Шмеччина). За допомогою дано! системи проводили автоматичне визначення рухливоси спермив, обективну i оптимальну за часом можливкть визначення якост1 сперми. Дослщження рухливост1 деконсервованих спермив проводили пщ мАкроскопом Оlympus (Япотя), методом позитивного фазового контрасту, при збшьшенш х 200. П'ять пол1в зору були вибраш на поверхш камери, i вираховували середнш результат. Швидккть камери налаштовувалась на 20 кадр1в в секунду. Об'екти, розмщеш в камер^ розтзнавались, як сперми за розм1рами i яскравктю.
Стутнь ушкодження акросомальних мембран спермив вим1рювали за зростанням активное^ маркерного ферменту акрозина в середовищ1 при зростант кшькост1 ушкоджених спермив. Метод визначення акрозину базуеться на його взаемодп з БАЕЕ (Na-öemoiln-L-apriHiH етиловий еф1р). Вим1рювання проводили фотометричним методом, фжсуючи зростання екстинцп Na-öemoiln-L-aprimHy на спектрофотометр! СФ 26 (Ломо, СРСР) при довжиш хвил1 259 нм за одну хвилину (АА259нм/хв) проти холосто! проби (замкть зразкадодавали 100 мкл Tpic буферу).
Цшсшсть плазматичних мембран спермив визначали за зростанням активност1 маркерного фермента лактатдегщрогенази (ЛДГ) в середовищг Актив Hi сть ЛДГ в плазм1/середовищ1 визначали юнетичним методом за допомогою набору Liquick Cor-LDH® (PZ Cormay S.A., Польша). Метод базуеться на змш коефшдента поглинання при довжиш хвил1 340 нм, прямо пропорцшнш активное^ лактатдегщрогенази у середовищг
Вим1рювання проводили на спектрофотометр! СФ-26 (Ломо, СРСР) з термостатуванням кювет (37 °С), яю з кварцового скла i з оптичним шляхом 10 мм та комп'ютерною системою «СФ-Комплект» (Акромюн, Украша). Змшу оптично! густини фжсували протягом трьох хвилин.
Збережешсть акросом (ЗА %) та цшсшсть плазматичних мембран (ЦПМ) вираховували за формулою:
ЗА%, ЦПМ % = 100* ( max - sample) / max
де:
max - актившеть акрозину або ЛДГ в середовищ1 при примусовому ушкодженш акросом i цшсшсть плазматичних мембран в суспензп св1жоотриманих спермив з концентращею 100 х 106 спермпв/мл за допомогою Triton X-100, вважалось що ушкодилось 100 % акросом;
sample - актившеть акрозину або ЛДГ в дослщному зразку.
Статистичну обробку даних здшенювали за допомогою пакету програм Statistica 8 (StatSoft, США).
111
Результата дослщження. Вплив крюконсервацп, часу витримки сперми при 15 °С перед концентруванням I типу середовища на рухливють, цшстсть плазматичних мембран та акросом спермпв показан! у (табл.1). Процес крюконсервацп в1рогщно вплинув на щ показники, а саме цшстсть плазматичних мембран знизилась (р<0,05) з 78 % до 39 % теля розморожування. Тип середовища I час витримування сперми при 15 °С були едиш фактори, яю суттево вплинули на цшстсть плазматичних мембран. Збшьшення часу витримки при 15 °С в середовищ1 Екосперм з 3 до 24 год не вплинуло т на цшстсть плазматичних мембран перед заморожуванням (80,9 I 83,4 % вщповщно), н1 на ц1л1сн1сть плазматичних мембран теля розморожування (43,4 I 42,7 %, вщповщно).
Таблиця 1
Вплив часу витримки при 15 °С, типу середовища на цшкшеть плазматичних мембран 1 акросом та рухливкть спермй'в (п=6, М±т)_
Технолопчний етап Час витримки при 15 °С, год Тип середо вища Ц1л1сн1сть плазматичних мембран, % Ц1л1сн1сть акросом, % Рухлив1сть, %
Перед заморожуван ням 3 Екосперм 81,6±4,1 76,2±3,8 67,1±3,4
24 82,3±4,3 75,8±3,9 56,3±3,6
3 ВТ8 78,5±3,9 75,8±4,5 66,7±4,1
24 70,5±3,5 72,2±5,2 58,9±3,2
П1сля розморожування 3 Екосперм 43,4±2,2 43,2±2,6 25,8±1,7
24 42,7±2,3 44,8±2,5 25,9±3,2
3 ВТ8 41,6±2,1 37,9±2,1 29,2±1,7
24 30,3±1,6 39,7±2,6 26,0±1,8
На вщм1ну в1д середовища Екосперм, збшьшення часу витримки у середовищ1 ВТ8 з 3 год до 24 год було отримано достов1рно нижчу ц1л1сн1сть плазматичних мембран перед заморожуванням з 76,4 % до 75,8 %, шж п1сля розморожування з 41,6 % до 29,2 %. Тшьки заморожування зразк1в (р<0,05) мала достов1рний вплив на зниження ц1л1сност1 акросом (р<0,05) з 80,5 % перед заморожуванням до 41,4 % теля розморожування. Також крюконсерващя чинила значний вплив на рухливкть сперм11в (р<0,05), I знизилось з 62 % перед заморожуванням до 27 % теля розморожування.
112
Таблиця 2
Вплив часу витримки при 15 °С, типу середовища на параметри руху ___спермив (п=6, М±т) ___
Технолопч ний етап Час витримки при 15 °С (год) Тип середовища УСЬ У8Ь ЬШ ВСБ АЬН
Перед заморожу ванням 3 Екосперм 106,9±14,2 23,2±3,1 19,7±3,2 12,3±0,6 6,7±0,5
24 96,0±9,8 16,8±6,2 15,3±5,7 9,0±0,7 6,4±0,9
3 ВТ8 106,1±16,1 25,7±3,5 21,6±5,3 13,0±0,9 6,3±1,1
24 95,2±12,4 20,0±4,6 18,7±3,1 10,1±1,2 5,7±0,6
Шсля розморожу вання 3 Екосперм 74,3±9,8 11,0±3,7 12,1±2,8 5,6±0,1 4,4±0,9
24 68,4±6,8 6,9±4,8 9,0±2,1 3,5±0,7 3,9±0,8
3 ВТ8 77,2±9,1 10,2±6,4 11,3±1,9 5,2±1,8 4,3±1,3
24 57,3±5,1 13,0±5,3 8,9±2,6 3,2±1,9 5,5±1,4
Вплив крюконсерваци, розбавниюв та часу витримки перед заморожуванням, юнематичш показиики спермив показан! у (табл. 2). Замороження чинило основний вплив на вс1 параметри руху, спричиняючи зниження цих показниюв теля розморожування у пор1внянш до параметр1в руху перед заморожуванням на 28-60 %, (р<0,05). Збшьшення часу витримки з 3 до 24 год призвело до зниження (р<0,05) трьох з п'яти параметр1в руху теля розморожування (УСЬ, ЬШ, I ВСБ). Тип розбавника не чинив достов1рного впливу на шш1 кшематичш показники.
Цшешеть плазматичних мембран I цшешеть акросом перед заморожуванням I теля деконсерваци не корелювали (р<0,05) м1ж собою, з рухлив1стю спермив, ш з параметрами руху в трупах до заморожування I теля деконсерваци. Але рухливкть перед заморожуванням мала позитивну корелящю (р<0,05) з УСЬ, У8Ь, ЬШ, 1 ВСБ (г=0,84, 0,68, 0,53 1 0,78, вщповщно). Однак, рухливкть теля розморожування не корелювала (р>0,05) з юнематичними показниками.
Вщсутшсть в1рогщного впливу часу витримки на цшешеть плазматичних мембран I цшешеть акросом в сперм1 перед заморожуванням не узгоджуеться з попередшми доелщженнями по вивченню часу витримки у середовищ1 ВТ8 3, 10, I 20 год [7, 8]. У наш ому дослад, збшьшення часу витримки суттево знизило 3 з 5 юнематичних показниюв спермив. Зниження штенсивност1 чи швидкост1 руху спермив в результат! 24 год витримки може вказувати про зниження рухливост1 в яйцепроводах I е важливим для спермив здшенювати устшне заплщнення яйцекл1тини [9,11].
Висновки.
Тип середовища I час витримування сперми при 15 °С були едиш фактори, яю суттево вплинули на цшешеть плазматичних мембран. Збшьшення часу витримки при 15 °С в середовищ1 Екосперм з 3 до 24 год не вплинуло ш на
113
цшсшсть плазматичних мембран перед заморожуванням (80,9 i 83,4 % вщповщно), Hi на цшсшсть плазматичних мембран теля розморожування (43,4 i 42,7 %, вщповщно). На вщмшу вщ середовища Екосперм, збшьшення часу витримки у середовищ1 BTS з 3 год до 24 год було отримано в1рог1дно нижчу цшсшсть плазматичних мембран перед заморожуванням з 76,4 % до 70,5 %, теля розморожування з 41,6 % до 30,3 %. Збшьшення часу витримки з 3 до 24 год призвело до зниження (P<0,05) трьох з п'яти параметр1в руху теля розморожування (VCL, LIN, i BCF). Тип розбавника не чинив в1рогщного впливу на rnmi юнематичш показники. Отже, розбавлення св1жоотримано! сперми в середовищ1 Екосперм та збер1гання чи транспортування при 15 °C протягом 24 год, в1рог1дно не вплинуло на результатившеть технолог!! крюконсервацп, i може бути запропоновано господарствам, яю знаходяться на великш вщеташ вщ лабораторп, де заморожуеться сперма кнур1в.
Л1тература
1. Наук В. А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации / В. А. Наук. — Кишинев, 1991. — 198 с.
2. Hernandez M, Roca J, Gil MA, Vazquez JM, Martinez EA. Adjustments on the cryopreservation conditions reduce the incidence of boar ejaculates with poor sperm freezability. Ther- iogenology 2007;67:1436-45.
3. Medrano A. The importance of individual variation in boar semen cryopreservation. Ph.D. Thesis, University of London, London, UK; 1998.
4. Roca J, Hernandez M, Carvajal G, Vazquez JM, Martinez EA. Factors influencing boar sperm cryosurvival. J Anim Sci 2006;84:2692-9.
5. He L, Bailey JL, Buhr MM. Incorporating lipids into boar sperm decreases chilling sensitivity but not capacitation potential. Biol Reprod 2001;64:69-79.
6. Saravia F, Wallgren M, Nagy S, Jahannisson A, Rodriguez- Mart'inez H. Deep freezing of concentrated boar semen for intra- uterine insemination: effects on sperm viability. Theriogenology 2005;63:1320-33.
7. Maldjian A, Pizzi F, Gliozzi T, Cerolini S, Penny P, Noble R. Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen. Theriogenology 2005;63: 411-21.
8. Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Anim Reprod Sci 2000;62:3-22.
9. Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci 2000;60:481-92.
10. He L, Bailey JL, Buhr MM. Incorporating lipids into boar sperm decreases chilling sensitivity but not capacitation potential. Biol Reprod 2001;64:69-79.
11. Vazquez JM, Martinez EA, Roca J, Matas C, Blanco O. The fertilizing ability assessment of fresh and stored boar semen. Reprod Dom Anim 1998;33:267-70.
114
Summary Korbetska O.O.
EFFECT OF DURATION OF EXPOSURE TO THE FREEZING OF BOAR SEMEN IN THEIR MORPHO-BIOCHEMICAL AND KINEMATIC PARAMETERS OF SPERM QUALITY AFTER THAWING
In this article are given the study results of the effect of sperm preincubation time and the type of environment at 15 °C from 3 to 24 h. Increasing the preincubation time of semen at 15 ° C in a medium "Ekosperm" from 3 to 24 h did not affect the integrity of the plasma membrane before freezing (80,9 and 83,4 %, respectively), and after thawing (43,4 and 42,7 %o, respectively). In contrast, the medium "Ekosperm", increasing the exposure time among the VTSfrom 3 h to 24 h showed significantly lower plasma membrane integrity before freezing from 76,4 % to 70,5 %, than after thawing from 41,6 % to 30,3 %. Increasing the exposure time from 3 to 24 h resulted in a decrease (p <0,05), three of the five motion parameters after thawing (VCL, LIN, and BCF). Type diluent did not likely impact on other kinematic indicators.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Федорович £.1.
115
