CC BY
62
оригинальные статьи двухцветный анализ клеточных популяций... 17 1
УДК 616-097.3:576.3.08:535.37 E.H. Захарова, П.К. Иванов, Т.Н. Заботина, Н.В. Голубцова, И.В. Чинарева, A.C. Гриневич, Д.Ю. Блохин ДВУХЦВЕТНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МКА СЕРИИ ICO, КОНЪЮГИРОВАННЫХ С ЦИАНИНОВЫМ КРАСИТЕЛЕМ IMD-306
ФГБУ «РОНЦим. H.H. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Захарова Елена Николаевна, научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел: +7(499)612-96-16 e-mail: [email protected]
Статья поступила 05.02.2014, принята к печати 07.02.2014.
Резюме
В данной работе нами были получены конъюгаты МКА серии ICO к антигенам Т- и B-лимфоцитов человека (CD4, CD8 и CD20) c цианиновым красителем Imd-306. Определены оптимальные характеристики полученных флуоресцентных зондов, в том числе - ПМ и рабочая концентрация антител, как для одноцветного, так и для двухцветного окрашивания лимфоцитов. Для двухцветного анализа клеточных популяций рекомендованы следующие комбинации: CD3FITC в сочетании с CD8Imd-306 (ПМ 6:1, концентрация 10 мкг/мл), с CD4-Imd-306 (ПМ 9:1, концентрация 5-10 мкг/мл), с CD20-Imd-306 (ПМ 5:1, концентрация 10-20 мкг/мл).
Ключевые слова: моноклональные антитела, проточная цитометрия, флуоресцентные красители.
E.N. Zakharova, P.K. Ivanov, T.N. Zabotina, N.V. Golubtsova, I.V. Chinareva, A.S. Grinevich, D.Yu. Blokhin THE TWO-COLOR ANALYSIS OF CELL POPULATIONS BY FLOW CYTOMETRY METHOD WITH USE MAB ICO SERIES CONJUGATED WITH IMD-306 DYE
FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
In this work, we have obtained the conjugates of MAb ICO series to antigens of human lvmohocvtes (CD4, CD8 and CD20) with Imd-306 dve. The optimal characteristics of fluorescent probes, including dye/protein ration (D/P) and the working concentration of antibodies as for one-color and two-colour analyses of lymphocytes. For a two-colour analysis of cell populations recommended the combinations: CD3 FITC in combination with CD8Imd-306 (PM 6:1, the concentration 10 mcg/ml), with CD4-Imd-306 (PM 9:1, the concentration 5-10 mcg/ml), with CD20-Imd-306 (PM 5:1, the concentration 10-20 mcg/ml).
Key words: monoclonal antibody, flow cytometry, fluorescent dye, two-colour analyses.
Введение
Проточная цитометрия - один из наиболее современных и информативных методов анализа клеточных субпопуляций, применяемых как в научно-исследовательской работе, так и в клинической практике.
Анализ субпопуляционного состава периферической крови и костного мозга, иммунофенотипа составляющих их клеток позволяет судить о клеточных механизмах возникновения и особенностях течения многих физиологических и патологических процессов, происходящих в организме. В последнем случае такой анализ является важным критерием для дифференциальной диагностики отдельных заболеваний, в первую очередь гемобластозов. Метод проточной цитометрии позволяет оценивать пролиферативную активность клеток, анализировать параметры клеточного цикла, количественные соотношения отдельных клеточных субпопуляций, состояние специфического или противоопухолевого иммунитета.
Опенка иммунного статуса организма пациента - одна из важнейших задач современной клинической иммунологии. Она включает в себя проведение комплексного исследования, включающего, чаше всего, иммуноФенотипирование субпопуляций лейкоцитов, анализ их функциональнальной
активности и активности фагоцитоза, опенку гуморального иммунитета и системы комплемента, ин-терферонового статуса, а также учет ряда иных параметров, определяемого конкретной исследовательской задачей. В минимальную панель для анализа клеточного иммунитета входит определение общих Т-лимФопитов (клетки, несущие поверхностные антигены СБ3), Т-хелперов (антигены СБ4), Т-цитотоксических лимфоцитов (СБ8), В-лимфопитов (антигены СБ19, СБ20 и СБ22) и естественных киллеров (ЫК-клетки, антигены СБ16, СБ56 и СБ57) [5].
По мере расширения технических и методических возможностей для выполнения подобных исследований, усложняются и аналитические задачи. Так, если еще недавно для количественного определения Т-цитотоксических лимфоцитов считалось достаточным использовать монохромный анализ клеточной популяции по единственному маркеру СБ8, то сейчас, согласно современным представлениям, следует выполнять комплексное исследование популяции одновременно по четырем антигенам: СБ8, СБ4, СБ3 и СБ45 с использованием многоцветного (мультипараметрического) ци-тометрического анализа, который позволяет получать информацию о наличии и сочетании нескольких антигенов на поверхности отдельных клеток, проводить оценку популяционного и субпопуляци-
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
1 2014.¡ndd 17
03.03.2014 15:10:55
18 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДВУХЦВЕТНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ...
онного состава многокомпонентных клеточных лазера с X 488 нм, а эмиссия регистрируется про-систем. Для выполнения таких анализов применя- точным цитометром в канале FL2 (585 нм). ются смеси нескольких флуоресцентных зондов - В качестве «второй» метки использовали каждый из них обладает собственной антигенной коммерческие конъюгаты CD3FITC (BD специфичностью и индивидуальными спектраль- Biosciences, США), флуоресценция которых также ными характеристиками. возбуждается лучом аргонового лазера 488 нм, а Ранее нами разработана оригинальная мето- эмиссия регистрируется проточным цитометром в дика конъюгирования МКА серии ICO к антигенам канале FL1 (525 нм). дифференцировки лейкоцитов человека [1; 3; 4] с сукцинимидными эфирами цианиновых красителей Реактивы серии Imd, синтезированных в ИМБ им. Фосфатно-солевой буфер (ООО «ПанЭко», В.А.Энгельгардта РАН (Москва) [2]. Россия) готовили по инструкции производителя, pH Показано, что разработанная методика готового раствора составляет 7,4. конъюгирования МКА с флуорофором не меняет Азид натрия (Sigma, США): 10 %-ный вод-иммунологической специфичности антител в со- ный раствор. ставе иммунофлуоресцентных конъюгатов, а полу- Лизирующий раствор FACS Lysing Solution ченные конъюгаты могут применяться для выпол- (BD Biosciences, США) нения прямой РИФ и последующего монохромного Сорбент Сефадекс - SephadexTM G-25 Su-анализа клеточных популяций методом проточной perfine - (Amersham Biosciences, Швеция). цитометрии [2]. Целью настоящей работы явилась оценка Получение конъюгатов МКА пригодности конъюгатов МКА серии ICO к антиге- с флуоресцентными красителями нам Т- и В-лимфоцитов человека с активной флуо- Получение и очистка МКА ресцентной меткой Imd-306 (ИМБ им. В.А. Энгель- МКА выделяли из асцитной жидкости мы-гардта РАН) для двухцветного цитометрического шей BALB/c с инокулированными внутрибрюшин-анализа. но клетками гибридом клонов ICO-31, ICO-180 и ICO-86. Материалы и методы Для получения препаратов очищенных антител применяли комбинированную очистку с ис-Биологический материал пользованием каприловой кислоты и высаливания В качестве исследуемого биологического иммуноглобулиновой фракции сульфатом аммония, материала использовали образцы венозной крови описанную ранее [2]. практически здоровых доноров. Кровь забирали из Концентрацию белка С IgG рассчитывали по локтевой вены натощак, в качестве антикоагулянта формуле: добавляли ЭДТА. Моноклоналъные антитела CigC — В качестве специфичного лиганда в работе 1,4 использовали МКА к поверхностным антигенам Т- лимфоцитов Склоны ЮО-31 и ICO-86 к антигенам Получение конъюгатов МКА CD8 и CD4, cooтвeтcтвeннo), а так же В- с цианиновым красителем Imd-306 лимфоцитов (клон ICO-180 к антигену CD20) чело- для получения конъюгатов МКА с цианино-века производства ООО «НПЦ «МедБиоСпектр» выми красителями серии Imd (Imd-306 и Imd-506) (Россия). ранее нами были подобраны оптимальные условия проведения реакции [2]. Флуоресцентные красители Для этого к раствору белка (1 мг/мл) в би-Цианиновыи краситель Imd-306 (производ- , , , Л „ ~ ство ИМБ им. Энгельгардта РАН) - аналог коммер- карбонатном буфере с РН 9,3 добавляли водный ческого препарата Cy3. Характеристики флуорофо- раствор моносукцинимидного эфира флуорофора pa Imd-306: MM 777,88 Да; максимум оптического Imd-306 в молярных соотношениях от 10:1 до 100:1 поглощения его водного раствора - 548 нм; макси- dye D мум эмиссии флуоресценции - 563 нм; содержание (-;— = —), смесь перемешивали и инкубиро- активного компонента в виде моносукцинимидного protein P эфира - 80-85 %; содержание нереакционноспособ- вали в течение 30 мин в темноте при комнатной ной кислоты Imd-306-COOH - 15-20 %. температуре Для Imd-306, как и для Cy3, оптимальным ^ ^ источником возбуждения флуоресценции является По окончании инкубации реакционную луч аргонового лазера с X 488 нм [6], а эмиссия ре- смесь разделяли на колонке Sephadex G-25. Спек-гистрируется проточным цитометром в канале FL2 трофотометрический анализ фракции элюата, со-(585 нм). держащей иммунофлуоресцентные конъюгаты, В работе использовали Imd-3°6 в виде моно- проводили при двух длинах волн, соответствующих сукцинимидного эфира в лиофилизированной фор- максимумам оптической плотности белка (1=280 ме, готового для мечения молекул, содержащих ч п ч J г нм) и красителя (л=548 нм), и рассчитывали плот-первичные аминогруппы. /г v »г ность метки - количество молекул флуорофора, Препараты сравнения - связавшихся с одной молекулой иммуноглобулина иммунофлуоресцентные реагенты (D/P), исходя из коэффициентов молярной экс-В качестве препаратов сравнения использо- тинкции (е) флуорофора и иммуноглобулина при вали коммерческие конъюгаты МКА СЮ8^ этих х ^ Imd-306=128000 М-1см-1; в IgG=224000 М-1см-1), CD4PE, CD20PE (BD Biosciences, США), флуорес- п0 фор'7е IgG ценция которых возбуждается лучом аргонового
№ 1/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1_2014.indd 18 {g} 03.03.2014 15:10:55
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДВУХЦВЕТНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ... 19 |
D 17 х ОП НЬ1Х популяций в прямой РИФ флуоресцентные — =---—-, где зонды должны иметь оптимальные аналитические P [ОО280 — (0,08 х ОЯ548)] характеристики, в том числе плотность метки и ОП28о и ОП548 - величина оптической плотности раствора рабочую концепцию раствора зонда. При этом конъюгата при 280 и 548 нм соответственно, следует учитывать что. , , , _ ,, 1. Оптимальная плотность метки (ПМ) коэффициент 1,7 - величина отношения коэффициентов , v ' „ , „ должна обеспечивать достаточную ин-молярнои экстинкции белка и красителя, а поправочный i n по , тенсивность флуоресцентного сигнала, коэффициент 0,08 отражает тот факт, что при 280 нм ^ J г „ ' , , т , получаемого от каждой молекулы зонда, поглощение водного раствора флуорофора lmd-306 со- J J an, л сю но не приводить к заметному снижению ставляет около 8% от его поглощения при а=548 нм. д - специфической активности зонда, свя- т-г - занной с химической модификацией мо-По такой технологии, изменяя лишь молярное ™ соотношение внесенного в раствор белка флуорофо- лекУлы иммуноглобулина. Известно, что ра, были получены конъюгаты CD4lmd-306 с плотно- интенсивность флуоресценции цианино- ziS/r, ттл/гч л 11 г^от jm/: i вых флуорофоров не обладает линеинои стью метки (D/P илиПМ) от 4 до 11, CD8lmd-306 от 1 ^ J F ^ F м n пт-»опт а чп/с 1 о зависимостью от количества молекул до 12 и CD20lmd-306 от 1 до 8, которые исследова- „ \ г - красителя, связанных с одной молекулой лись далее на предмет их специфической активности к ' j. r ^ лиганда. 1ак, оптимальная флуоресцен-и пригодности для цитометрического анализа в пря- , ' ^ о « 4, ция наблюдается при связывании 6-8 мои реакции иммунофлуоресценции. ^ " r J ^ ■> г молекул красителеи Cy3 и Cy3.5, 4-5 мо- Прямая РИФ лекул ФлУ0Р0ф0Ра Cy55 и лишь 2-3 м0-тт пттлч лекул Cy5 на одну молекулу иммуногло-Прямая РИФ использовалась для оценки при- , лина [8] В т й вяи птимальная годности (специфической активности) конъюгатов т^ллгл . этои связи оптимальная -мпг\ л. j, TJTA/T/.1, ПМ МКА красителем lmd-306 должна МКА с флуорофором lmd-306 (флуоресцентных зон- к дов) для анализа клеточных популяций лимфоцитов , определяться экспериментально. ' J тт 2. Оптимальная концентрация зондов в человека методом проточной цитометрии. Для поста- „ „т-^ К- птт^ч к 4, - прямой РИФ должна обеспечивать на-новки прямой РИФ к образцам периферической крови F м /inn \it сыщение зондом всех молекул иссле-здоровых доноров (100 мкл) добавляли раствор одного J г с дуемого антигена на поверхности кле-из конъюгатов в дробно-пони-жающихся количествах J к - диапазон конечных концентраций МКА от 100 до 0,1 ^ н0 не приводить к заметному неспе-мкг/мл («титрование» раствора зондов), инкубировали цифическому связыванию зонда с кле-образцы в течение 20 мин ^ри 18-25 °С в темноте. л точноиповерхностью. Эритроциты разрушали последующим осмотическим Для определения рабочей концентрации по-r r * гдлс т г( 1 / ^тэтх лученных конъюгатов использовали методику тит-гемолизом в растворе FACS Lysmg Solution (BD J c. . ^ A r-n Т-,- • г^тттлч u " " рования антител, предложенную Stewart C.C. 171. Biosciences, США). He связавшийся с лейкоцитами £ ' F 2 J L J c- - « Она основана на дробном понижении концентра-избыток зондов удаляли двукратной отмывкой клеточ- t. „т-^ г ного осадка цен^ифугироважем/ресуспендированием ции зон.дов в ПРЯМ0И РИФ д0 Достижения их мини-в фосфатно-солевом буфере (pH 7Д). Отмытое клетки мальнои концентрации, при которой еще сохраня-суспендировали в 0,3 мытого же буфера с добавлением ется максимальная интенсивность флуоресценции J 4, - антигенпозитивных клеток. к нему раствора формальдегида до конечной концен- ^ J пл о/ Дальнейшее понижение концентрации зон-трации последнего 0,4 %. ^ ^ F ^ г дов приводит к смещению антигенпозитивного пи- Проточная цитометрия ка на гистограмме влево и уменьшению соотноше-клеточных суспензий ния «еигнал»/«шум» (S/N). Изучали долю (%) анти-В работе использован проточный цитометр ген-позитивных событии, выявляемых различными FACSCalibur (BD Biosciences, США) с программ- конъюгатами в одно1м и toim же образце перифери- п пел о с. 4, ческой крови, и отношение интенсивности флуо-ным пакетом CellQuest. Возбуждение флуоресцен- F ^ ■> ^ J " д. ресценции антигенпозитивных клеток к «шуму» ЦИИ ПРОИСХОДИЛО ПРИ ПрОХОЖДеНИИ КЛеТКОИ фО- /с/Сгч д. тт г кального пятна аргонового (для FITC) и красного <S/N) аутофлуоресценции. На1гболылие 3Ha4i;HHa диодного (для lmd-306) лазеров (мощность 15 mW, S JiaPaKTePIibI Д™ конъюгатов т ,ioo ч л ттт 1 CD20lmd-306 с ПМ в диапазоне (4,5-8). 1, для ^=488 нм). Флуоресценцию учитывали в Fbb КОНъюгатов CD4lmd-306 с ПМ (8-11)-Г лля конъю-канале для FlTC и в FL2-кaнaлe для PE и lmd-306. конъюгатов CD^lmaJ06 с ПМ (8 11):1, для конъю тт -4, гатов CD8lmd-306 с ПМ 6.1. Для выделения гейта лимфоцитов, а также дискри- ^ ¡t - Для каждого полученного в настоящем ис-минации иных субпопуляции учитывали показате- ^ ^ л ,т/. 4 /ссАч а следовании конъюгата МКА определены опти-ли прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) F r A z мальные рабочие концентрации в исследованном светорассеяния. В каждом образце анализировали п с i n„ , «пап к 4, диапазоне от 0,5 до 100 мкг/мл. 5000 событии в гейте лимфоцитов. м „ ' м ^с- г- 4, - Экспериментально показано, что для моноОбработку файлов первичных цитометриче- г , ' „ r J ^ ^ г хромного анализа клеток периферической крови ских данных проводили с использованием про- F 4. ^т^о wt л/гт^т -> о могут использоваться флуоресцентные зонды. CD8 граммного пакета WinMDl 2.8, находящегося в т / ттл,г^1 -cm свободном доступе в сети Интепнет lmd-306 с ПМ 6:1 и рабочей концентрацией 5-10 свооодном доступе в сети Интернет. мкг/мл ^ 1; см. вклейку). CD20lmd-306 с ПМ 5.1 Pe^v^bTaTH И рабочей концентрацией 10-20 мкг/мл (рис. 2); ^ CD4lmd-306 с ПМ 9.1 и рабочей концентрацией 5- Оптимальные 10 мкг/мл (Рис. 3). ПРИ этом процентная доля антианалитические характеристики генпозитивных клеток, выявляемая в образцах крови конъюгатов МКА доноров полученными нами зондами в указанной с цианиновым флуорофором Imd-306 Рабочей концентрации, соответствует доле клеток, Для получения корректных и воспроизводи- выявляемой коммерческими реагентами производ- " J ^ г ства BD Biosciences, использованными в качестве мых результатов количественного анализа клеточ- ' , ч r J препаратов сравнения (данные не представлены).
№ 1/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1_2014.indd 19 {g} 03.03.2014 15:10:55
20 оригинальные статьи двухцветный анализ клеточных популяций.
Определение составили: CD3 - 72,8%; CD4 - 50,5%; CD8 -оптимальной рабочей концентрации 26,9%, что соответствует результату анализа с ис-полученных флуоресцентных зондов пользованием нового зонда. для применения их в двухцветном анализе На рис. 5 представлены «наложенные» гис-В отличие от монохромной РИФ, при поста- тограммы по каналу FL2 для монохромного (серое новке реакции для многоцветного анализа в реак- заполнение) и двухцветного (черный контур) ана-ционной смеси с клетками крови одновременно лиза, следовательно, конъюгат CD8Imd-306 с ПМ присутствуют два и более флуоресцентных зондов, 6:1 и конечной концентрацией зонда 10 мкг/мл мо-в связи с чем должно учитываться их возможное жет использоваться как в монохромном анализе, взаимное влияние на конечные результаты анализа. так и в двухцветной реакции с CD3FITC (BD Bio-Так, выявляемые разными зондами антигенные sciences). эпитопы могут располагаться на клеточной поверх- Однако при снижении концентрации того же ности в непосредственной близости друг к другу конъюгата до 5 мкг/мл (рис. 6), доля дважды пози-таким образом, что связывание одного зонда со тивных (CD3CD8) клеток составляет в двухцвет-«своим» антигеном создает стерическое препятст- ной реакции лишь 23,3% популяции, тогда как в вие для связывания с клеткой другого зонда, в ре- монохромной реакции определяется 26,2% положи-зультате чего полученный результат анализа ока- тельных событий, а «наложение» гистограмм по жется не адекватным сумме отдельных монохром- каналу FL2 выявляет их не полную идентичность ных реакций. Для оценки возможности применения (рис. 7). Следовательно, концентрация данного различных зондов в одной двухцветной РИФ ис- зонда в 5 мкг/мл является недостаточной для двух-пользуется простой методический прием: в три цветного анализа, но может применяться для моноразличные пробирки вносятся аликвоты одного хромного. образца исследуемой крови, в первую пробирку добавляется раствор первого зонда (в оптимальной CD4Imd-306 в комбинации с CD3FITC конечной концентрации), во вторую пробирку - Аналогично описанному тестировали в мо-раствор второго зонда, а в третью - смесь обоих нохромной и двухцветной реакциях флуоресцент-зондов в той же конечной концентрации каждого. ный зонд CD4Imd-306. Контрольные значения, по-После выполнения прямой РИФ все три образца лученные для образца крови донора ВВ с примене-анализируются на проточном цитометре. По ре- нием препаратов сравнения, составили: суммарно зультатам анализа строятся гистограммы распреде- CD3+ - 71,7%; CD3+CD4+ - 49,8%; CD3+CD8+ -ления зарегистрированных событий по первому 21,9%. Двухцветный анализ Т-лимфоцитов донора калану флуоресценции (FL1) для содержимого про- с применением комбинации CD3FITC/CD4Imd-306 бирок №№ 1 и 3 и по второму каналу (FL2) - для с ПМ 9:1 и конечной концентрацией 10 мкг/мл пробирок №№ 2 и 3. Гистограммы, построенные по представлен на рис. 8. Получены результаты: результатам монохромного анализа (пробирки №№ CD3+CD4+ - 50,6%; CD3+ - 71,9%. Практически 1 и 2) должны с точностью совпадать с соответст- идентичные результаты получены при снижении вующими гистограммами двухцветного анализа вдвое (до 5 мкг/мл) конечной концентрации этого (пробирка № 3). Если на гистограммах по результа- зонда: CD3+CD4+ - 50,6 %; CD3+ - 72,9 %) (рис. 9). там анализа содержимого пробирки № 3 положение Таким образом, для конъюгата CD4Imd-306 с ПМ пика специфической флуоресценции смещается 9:1 обе концентрации (5 и 10 мкг/мл) являются ра-влево относительно того же пика для пробирок бочими, так как гистограммы по каналу FL2, полу-№№ 1 и/или 2, в реакционной смеси для двухцвет- ченные при монохромном и двухцветном анализе ной РИФ следует увеличить конечную концентра- полностью совпадают (рис. 10 для концентрации 10 цию соответствующего зонда для достижения тре- мкг/мл и рис. 11 для концентрации 5 мкг/мл). буемого соответствия. Если это не приводит к положительному результату - данная пара зондов не Комбинация конъюгата CD20Imd-306 может использоваться для двухцветного окрашива- с CD3FITC ния в одной реакции. «Двухцветка» CD3FITC/CD20Imd-306 по-В настоящей работе в качестве зонда, выяв- зволяет в одной реакции определить суммарное ляющего антигены по каналу флуоресценции FL1, количество всех Т-клеток (CD3CD20) и всех B-использовали коммерческий продукт CD3FITC (BD клеток (CD3 CD20+) в образце. Biosciences, США), а в качестве зонда по каналу Двухцветный анализ образца крови донора FL2 - каждый из полученных нами конъюгатов СС с применением препаратов сравнения показал МКА серии ICO с красителем Imd-306. Построение следующие значения: CD3+CD20- - 70,2% ; CD3-и анализ гистограмм по результатам цитометриче- CD20+ - 9,5%. На рис. 12 и рис. 13 представлены ского анализа проводили с использованием про- результаты двухцветного (CD3FITC/CD20Imd-306, граммного пакета WinMDI 2.8. ПМ 5:1) окрашивания клеток периферической крови донора СС (рис. 12 - концентрация зонда 20 CD8Imd-306 в комбинации с CD3FITC мкг/мл; рис. 13 - концентрация 10 мкг/мл). Оче-На рис. 4 представлена двумерная дот-плот видно, что результаты, представленные на обоих диаграмма распределения лимфоцитов крови при рисунках, совпадают с контрольными значениями. их двухцветном анализе с использованием зондов Гистограммы, полученные при одно- и двух-CD3FITC (FL1) и CD8Imd-306 (FL2) с ПМ 6:1 и цветном анализе, полностью идентичны (рис. 14 -концентрацией последнего 10 мкг/мл. На диаграмме 20 мкг/мл; рис. 15 - 10 мкг/мл), следовательно, для четко выделяется субпопуляции цитотоксических конъюгата CD20Imd-306 с ПМ 5:1 концентрации 20 Т-клеток с фенотипом CD3 CD8+ (24,7%) и прочих и 10 мкг/мл являются рабочими. Т-лимфоцитов CD3+CD8- (48,7%); суммарное содержание Т-лимфоцитов в популяции, таким обра- Заключение зом, составляет 73,4%. Контрольные значения, полученные для того же образца крови донора АА с Нами получены конъюгаты МКА серии ICO применением коммерческих препаратов сравнения, к антигенам Т- и В-лимфоцитов человека (CD4,
№ 1/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1_2014.indd 20 {g} 03.03.2014 15:10:56
оригинальные статьи
двухцветный анализ клеточных популяции...
СБ8 и СБ20) с цианиновым красителем Imd-306, которые могут применяться для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии как в режиме монохромного мечения клеток, так и для двухцветной реакции поверхностной иммунофлуо-ресценции. Оптимальными аналитическими характеристиками данных зондов (плотность мечения и конечная рабочая концентрация) являются: для CD8Imd-306 ПМ= 6:1, концентрация 5-10 мкг/мл; для CD20Imd-306 ПМ= 5:1, концентрация 10-20
мкг/мл; для CD4Imd-306 ПМ= 9:1, концентрация 510 мкг/мл. Эти зонды в указанных концентрациях могут применяться для монохромного мечения лимфоцитов, а также использоваться в комбинации с иммунофлуоресцентным реагентом CD3FITC (BD Biosciences) для выполнения двухцветного окрашивания клеток, за исключением зонда CD8Imd-306, ПМ= 6:1, минимальная конечная концентрация которого в двухцветной реакции составляет 10 мкг/мл.
Литература
1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. - М.: Медицина, 1997. - 212 с.
2. Захарова E.H., Иванов П.К., Заботина Т.Н. и др. Иммунофлуоресцентные зонды на основе монокло-нальных антител ICO-31 и цианинового красителя Imd-506 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 4. - С. 27-
3. Иванов П.К. Моноклональные антитела в онкологии: Автореф. дис... д-ра наук. - М., 2001.
4. Кадагидзе З.Г., Заботина Т.Н., Короткова О.В. Современные возможностииспользования иммунологических показателей при иммунотерапии онкологических больных // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина. - 1996. - № 1. - С. 50-5.
5. Хайдуков С.В. Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медико-биологических исследований. - Дисс. ... д.б.н. - Санкт-Петербург. - 2008.
6. Ernst L.A., Gupta R.K., Mujumdar R.B., Waggoner A.S. Cyanine dye labeling reagents for sulfhydryl groups // Cytometry. - 1989. - 10(1). - P. 3-10.
7. Stewart C.C, Stewart S.J. Titering Antibodies. - Current Protocols in Cytometry, (J.P.Robinson, Z. Darzynkiewicz, P. Dean. L. Dressler, P.Rabinovitch, C. Stewart, H. Tanke, L. Wheeless, eds.) J.Wiley & Sons, Inc., New York, 4.1.1 - 4.1.13, 1997.
8. Gruber H. J., Hahn C.D., Kada G., Riener C.K. et. al. Anomalous fluorescence enhancement of Cy3 and Cy3.5 versus anomalous fluorescence loss of Cy5 and Cy7 upon covalent linking to IgG and noncovalent binding to avidin // Bioconjug. Chem. - 2002. - 11. - P. 696-704.
32.
Ф
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Ф
пм
РИФ МКА ЭДТА
- плотность мечения
- реакция иммунофлуоресценции
- моноклональные антитела
- этилендиаминтетрауксусная кислота
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. H.H. БЛОХИНА РАМН
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
1_2014.indd 21
Ф
03.03.2014 15:10:56
ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ СТАТЕЙ ДЛЯ ПУБЛИКАЦИИ В «РОССИЙСКОМ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ ЖУРНАЛЕ»
Работа может быть статьей экспериментального или клинического характера, теоретической или концептуальной, обзором по материалам литературы, рецензией, сообщением дискуссионного, исторического пли хроникального характера, рефератом зарубежных работ.
Статьи экспериментального пли клинического характера имеют разделы: Резюме; Введение; Материалы и методы; Результаты и обсуждение; Выводы (Заключение); Литература.
Обзоры литературы, статьи теоретического и концептуального характера имеют разделы: Резюме; Введение; Разделы по отдельным обсуждаемым вопросам; Выводы; Литература.
Статья должна быть представлена в виде файла формата RTF на дискете пли CD и распечатана в 2 экземплярах. На внешней стороне дискеты пли коробке CD должны быть указаны фамилия первого автора, названия статьи и файлов.
В основном файле должен содержаться текст статьи, таблицы, подписи и надписи к рисункам, список литературы. Кроме того, на дискете пли CD должны быть записаны рисунки (каждый в виде отдельного файла).
Штриховые и тоновые рисунки (фотографии, рентгенограммы и т.д.), то есть растровая графика, должны быть сохранены в виде файлов формата TIF пли JPEG, графики и диаграммы (векторная графика) - в виде файлов формата EPS. Если автор не работает с современными программными пакетами для создания векторной графики, можно прислать график в виде файла Microsoft Excel 5.0/95 с обязательным приложением в виде таблицы, по которой данный график построен.
Обзорные статьи не должны превышать 17 страниц, оригинальные статьи - 12 страниц.
Весь текст должен быть набран шрифтом Times New Roman 12 через полуторный интервал. Текст должен быть выровнен по левому краю.
Все страницы должны быть пронумерованы. Номер страницы должен быть расположен внизу справа, начина со второй. Каждый абзац должен начинаться с красной строки, которая устанавливается меню «Абзац».
Не следует использовать для красной строки клавишу Tab. Десятичные дроби следует писать через запятую. При наборе текста следует различать дефис и тире. Последнее вводится одновременным нажатием клавиш Ctrl+Alt+дефис с дополнительной клавиатуры при горящем указателе Num Lock.
Набирая заголовки, названия разделов, таблиц, подписи и надписи на рисунках, точку в конце ставить не нужно. Выравнивать по центру и устанавливать красную строку для всего перечисленного также не нужно.
В начале статьи следует указать имя, отчество и фамилии авторов полностью, НАЗВАНИЕ СТАТЬИ, место работы в именительном падеже (если авторы работают в разных учреждениях, уточнить это дополнительно), должность и контактную информацию для каждого автора (почтовый адрес, e-mail). Авторы несут ответственность за точность предоставляемой ими информации о себе и месте своей работы.
В начале статьи должно быть приведено Резюме. В нем должны быть кратко без рубрикации указаны цель исследования, материалы и методы, полученные автором результаты и основные выводы. В конце резюме автор приводит Ключевые слова работы (не более 5). Рекомендуемый объем реферата - 500-1000 печатных знаков. Отступление от этой схемы допустимо только в отношении обзорных статей.
Далее необходимо на английском языке дать фамилии авторов и их инициалы, название статьи, название учреждений, резюме (Abstract) и ключевые слова (Key words).
Статья должна быть написана ясно, четко, лаконично, тщательно выверена авторами, не содержать повторов и исправлений. Сокращения допустимы только в отношении часто встречающихся в статье терминов. Сокращение вводится при первом вхождении в круглых скобках и в дальнейшем используется по всему тексту.
1 2014.indd 22
03.03.2014 15:10:56
Рисунки к статье E.H. Захаровой и соавт. ДВУХЦВЕТНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИП С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МКА СЕРИИ ICO, КОНЪЮГИРОВАННЫХ С ЦИАНИНОВЫМ КРАСИТЕЛЕМ IMD-306
Рис. 1. Экспрессия антигена CD8 на лимфоцитах донора, выявляемая с помощью конъюгата CD8Imd-306 с ПМ 6:1 и коннентпанией 10 мкг/мл.
CD20 Imd 306 dfc 5 10 mcgrtnl
Рис. 2. Экспрессия антигена CD20 на лимфоцитах донора, выявляемая с помощью конъюгата CD20Imd-306 с ПМ 5:1 и концентрацией 10 мкг/мл.
10° 10' 10" 10' 10* СР4 1тй 306 10 тсдЛл!
Рис. 3. Экспрессия антигена Ой4 на лимфоцитах донора, выявляемая с помощью конъюгата 0й4!тЬ-306 с ПМ 9:1 и концентрацией 10 мкг/мл.
Рис. 4. Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата 0й8!тЬ-306 с ПМ 6:1 и рабочей концентрацией 10 мкг/мл.
Рис. 5. Одно- и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата 0й8-!тЬ-306 с ПМ 6:1 и рабочей концентрацией 10 мкг/мл. Серым цветом выделена гистограмма для монометрического анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа.
Рис. 6. Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата 0й8!тЬ-306 с ПМ 6:1 и рабочей концентрацией 5 мкг/мл.
Í-
is.
10* ю1 1Í- 10' to +
Рис. 7. Одно- и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата 0й8!тЬ-306 с ПМ 6:1 и рабочей концентрацией 5 мкг/мл. Серым цветом выделена гистограмма для монометрического анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа.
0,24% JO Ф
Рис. 8. Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD20 Imd-306 с ПМ 5:1 и рабочей концентрацией 20 мкг/мл.
1D"
Рис. 9. Одно- и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD20Imd-306 с ПМ 5:1 и рабочей концентрацией 20 мкг/мл. Серым цветом выделена гистограмма для монометрического анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа.
Рис. 10. Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD20Imd-306 с ПМ 5:1 и рабочей концентрацией 10 мкг/мл.
Й
50 Л%
Н1
aJ
1о5 То1 Та1 То» 7а "
Рис.11. Одно- и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD20Imd-306 с ПМ 5:1 и рабочей концентрацией 10 мкг/мл. Серым цветом выделена гистограмма для монометрического анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа.
Рис. 12. Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата С04!тЬ-306 с ПМ 9:1 и рабочей концентрацией 10 мкг/мл.
ES q
•j
й Ч
9jÜ4% 33%
Щ 70,11%
CBtFUC
1UJ
Рис. 13. Одно- и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата Сй4!т<^-306 с ПМ 9:1 и рабочей концентрацией 10 мкг/мл. Серым цветом выделена гистограмма для монометрического анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа.
Рис. 14. Двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата Сй4!т<^-306 с ПМ 9:1 и рабочей концентрацией 5 мкг/мл.
Рис. 15. Одно- и двухцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата Сй4!тЬ-306 с ПМ 9:1 и рабочей концентрацией 5 мкг/мл. Серым цветом выделена гистограмма для монометрического анализа, черным контуром-гистограмма для двухцветного анализа.
