CC BY
157
ЛИТЕРАТУРА
1. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. Атлас цитологической и им-муноцитохимической диагностики опухолей. М.: Репроцентр М, 2010.
2. Назарова И.В., Родионова О.М., Волков М.В., Богатырев В.Н. Первый опыт использования аппарата Е PREP для жидкостной цитологии в России. Новости клинической цитологии России. 2012; 16(1-2): 3-5.
3. Шабалова И.П., Касоян К.Т., Савостикова М.В. Жидкостная цитология в клинической практике (лекция). Клиническая лабораторная диагностика. М., 2011; 12: 25-35.
4. Al-Khafaji B.M., Afify A.M. Salivary gland fine needle aspiration using the ThinPrep technique: diagnostic accuracy, cytologic artifacts and pitfalls. Acta Cytologica. 2001; 45(4): 567-74.
5. Esquivias Lopes-Cuervo J., Montalban Beltran E., Cuadros Lopez J.L., Alonso Castillo A., Nieto Sanchez T. Preliminary Study of a New, Fully Automated System for Liquid-Based Cytology: The NovaPrep® Processor System. Acta Cytologica 2011; 55: 281-6.
6. Geers C., Bourgain C. Liquid-based FNAC of the thyroid: a 4-year survey with SurePath.Cancer Cytopathology. 2011; 119(1): 58-67.
7. Jae Soo Koh M.D., Cytology Evaluation of Cell prep LBC in Cytology specimens. The Korean Journal of Cytopathology. 2007; 18(1).
8. Jung C.K., Lee A., Jung E.S., Choi Y.J., Jung S.L/, Lee K.Y. Split sample comparison of a liquid-based method and conventional smears in thyroid fine needle aspiration. Acta Cytologyca. 2008; 52(3): 313-9.
9. Konofaos P., Kontzoglou K., Georgoulakis J. et al. The role ThinPrep cytology in the evaluation of estrogen and progesterone receptor content of breast tumors. Surg. Oncol. 2006; 15: 257-66.
10. Lukas Burendorf. Multiprobe fluorescence in situ Hybridization (UroVysion) for the detection of urothelial carcinoma - FISHing for the right catch. Acta Cytologica. 2011; 55: 113-9.
11. Malapelle U., de Rosa N., Rocco D., Bellevicine C., Crispino C., Illiano A. et al. EGFR and KRAS mutations detection on lung cancer liquid-based cytology: a pilot study. J. Clin. Pathol. 2011; 65(1): 87-91.
12. Michael C.W., McConnel J., Pecott J., AfifyA.M., Al-Khafaji B. Comparison of ThinPrep and TriPath PREP liquid-based preparations in nongynecologic spesimens: a pilot study. Diagnostic Cytopathology. 2001; 25(3): 177-84.
13. Rana S., HodaM.D. Non-gynecologic cytology on liquid-based preparations: a morphologic review of facts and artifacts. Diagnostic Cytopathology. 2007; 35: 621-34.
14. Rieko Nishimura, Kenjiro Aogi, Tamami Yamamoto, DaisukeTakabat-ake, Seiki Takashima, Norihiro Teramoto et al. Usefulness of liquid-based cytology in hormone receptor analysis of breast cancer spesim-ens. Virchows Arch. 2011; 458: 153-8.
15. Rossi E.D., Mule A., Russo R.M., Pierconti F., Fadda G. Application of liquid-based preparation to non-gynaecologic exfoliative cytology. Pathologica. 2008; 100(6): 461-5.
16. Seung-Myoung Son, Ji Hae Koo, Song-Yi Choi, Ho-Chang Lee, Yong-Moon Lee, Hyung Geun Song et al. Evaluation of urine cytology in urothelial carcinoma patients: a comparison of CellprepPlus® Liquid-Based Cytology and conventional smear. The Korean Journal of Pathology. 2012; 46: 68-74.
17. Yi-Bo Fan, Qing-Shan Wang, Lin Ye, Tian-Yu Wang, Guang-Ping Wu. Clinical application of the SurePath liquid-based Pap test in cytological screening of bronchial brushing for the diagnosis of lung cancer. Cyto-technology. 2010; 62: 53-9.
Поступила 07.02.13
микробиология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.835.12.083.134
Г.Ш. Исаева1, В.А. Алешкин2, Е.п. Селькова2, м.С. Герасимова3, п.И. мороз3
двухфазная питательная среда Для сУБКУльтивировАния HELiCOBACTER PYLORi
1ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии Республики Татарстан" Казань; Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора; Республиканский клинический онкологический диспансер минздрава Республики Татарстан, Казань
H. pylori - очень прихотливый микроорганизм, нуждающийся в создании комплекса условий, включающих определенную атмосферу, температуру культивирования и состав питательной среды. Рекомендована двухфазная среда для субкультивирования на чашках Петри диаметром 90 мм, состоящая из шоколадного агара с добавлением бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, субкультивирование, двухфазная питательная среда G.Sh. Isayeva, V.A. Aleshkin, Ye.P. Selkova, M.S. Gerasimova, P.I. Moroz
THE TWO-PHASE GROWTH MEDIUM FOR SUB-CULTURING OF HELICOBACTER PYLORI
A.Pylori is a very undemanding microorganism needing the in support of complex of conditions including particular atmosphere, temperature of culturing and composition of growth medium. The two-phase growth medium is recommended to sub-culturing in Petri dishes with diameter of 90 mm. The growth medium consists of chocolate agar with addition ofS^edler broth and enriched with 10% serum of cattle.
Key words: Helicobacter pylori, sub-culturing, two-phase growth medium Инфекция
Для корреспонденции:
Исаева Гузель Шавхатовна, канд. мед. наук, доц. каф. микробиологии
Адрес: 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49 Телефон: (843) 236-06-52 E-mail: guisaeva@rambler.ru
Helicobacter pylori - одна из самых распространенных в мире. Для диагностики хеликобактериоза разработано множество методов, одним из которых является бактериологическое исследование. Трудоемкость и сложность выделения H. pylori ограничивает применение этого метода в рутинной практике практического здравоохранения, но он остается единственным для фенотипического определения чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам. Мониторинг за
МИКРОБИОЛОГИЯ
растущей резистентностью H.pylori, коррекция схем эради-кационной терапии с учетом чувствительности выделенных штаммов к химиотерапевтическим препаратам, испытания новых лекарственных препаратов делают бактериологический метод незаменимым для практических и научных целей.
Для культивирования H. pylori предложены различные питательные среды, обязательными компонентами которых являются базовый агар, ростовые добавки, а для селективных - ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры. Большинство базовых агаров удовлетворяют требованиям, предъявляемым для культивирования H.pylori, например, колумбийский агар, эритрит агар, сердечно-мозговой агар. H.pylori очень прихотливый микроорганизм, требующий дополнительных факторов роста (витаминов, микроэлементов) [3]. Обязательным компонентом среды должна быть добавка 5-10% крови или сыворотки животных (лошади, барана). При этом эритроциты могут быть лизированы, чтобы ростовые вещества могли быть использованы быстрее, что достигается при применении шоколадного агара. Недостатком способов культивирования на плотных питательных средах является невысокая эффективность высеваемости хеликобактеров при первичной изоляции, также при дальнейших пересевах для получения чистых культур штаммы теряются, всхожесть ослабевает и утрачивается, а скудность роста чистых культур приводит к невозможности определения чувствительности выделенного штамма к антибиотикам и химиопрепаратам.
Проблему накопления культуры можно решить с помощью использования жидких сред, имеющих сходный состав с плотными средами. При росте на жидких питательных средах хеликобактеры имеют типичную извитую форму, подвижны и биохимически активны, полноценны в антигенном отношении [5]. При культивировании в жидкой среде сложность может представлять создание и поддержание микроаэрофиль-ных условий. Эта задача может быть решена постоянным контролированием микроаэробной атмосферы в пробирках путем перемешивания на специальных платформах под углом 20° со скоростью вращения 120 об/мин [8] или культивирования во флаконах с отверстиями для доступа газов [6]. Предложены методы двухфазного культивирования во флаконах для клеточных культур [7] и тонкослойного культивирования [4]. Разработаны мини-биореакторы для принудительного введения в атмосферу культивирования углекислого газа через трубки, погруженные во флаконы с жидкой питательной средой. Выведение газовой смеси из флакона осуществляется через газоотводную трубку, не погруженной в среду [2]. Но к недостаткам методов культивирования на жидких питательных средах можно отнести сложность создания и поддержания микро-аэрофильных условий в жидких питательных средах и необходимость использования дополнительного оборудования для принудительного введения углекислого газа.
Некоторые микроорганизмы с трудом удается выращивать на плотных или жидких питательных средах, но они гораздо боле активно растут и размножаются в двухфазных питательных средах, состоящих из комбинации плотной и жидкой фаз. Возможным объяснением может быть то, что подобные питательные среды создают условия роста и размножения, приближенные к естественным, когда часть жизненного цикла микроба требует плотной питательной среды, а другие стадии жизненного цикла проходят в жидкой питательной среде. Это в частности свойственно микроорганизмам, которые частично размножаются в клетках слизистых оболочек, а частично на поверхности слизистой в просвете органа, например в кишечнике. При этом состав компонентов жидкой и твердой фазы питательной среды определяется особенностями биологии конкретного микроорганизма.
Цель нашего исследования - разработка двухфазной среды для накопления культуры H. pylori.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили биоптаты слизистой оболочки желудка, взятые у 17 больных с различной гастродуоденальной патологией во время
проведения диагностической фиброгастродуоденоскопии. Био-птаты (2 образца) помещали в пробирки с 5 мл транспортной тиогликолевой средой и в течение 4-6 ч с момента взятия материала доставляли в лабораторию. Из одного биоптата готовили мазки и окрашивали по Граму, а другой биоптат использовали для посева. Посев материала производили следующим образом. Перед посевом биоптаты бактериологической петлей переносили в стерильные фарфоровые ступки и растирали в 1 мл физиологического раствора до гомогенного состояния. Затем гомо-генат высевали на плотные питательные среды: колумбийский агар с добавлением 5% крови барана и на среду для культивирования пневмококков, предложенную Л.К. Катосовой [1]. В качестве основы данной среды использовали колумбийский агар с добавлением 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота и 5% дефибринированной крови барана. Засеянные чашки инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 5 дней. При наличии подозрительных колоний для выделения чистой культуры производили пересев на шоколадный агар, инкубировали в СО2-инкубаторе при 37° С в течение 3-5 дней. В 4-х случаях наблюдался рост единичных колоний диаметром 1-2 мм сходных с "капельками росы". Для накопления культуры колонии рассеивали петлей по поверхности среды и заливали жидкой питательной средой, приготовленной на основе бульона Шедлера (триптазо-соевый бульон, bio-Polytone, декстроза, дрожжевой экстракт, трис, гемин, а-цистин), обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота. Экспериментальным путем установлено оптимальное количество жидкой среды, вносимой в чашку, при этом жидкая среда тонким слоем распределяется по поверхности плотной питательной среды. Засеянные чашки Петри с двухфазной средой помещали в СО2-инкубатор и инкубировали при 37°С в течение 3 дней. После инкубирования из культуральной жидкости готовили мазки и окрашивали по Граму, а также готовили препараты "раздавленная" капля для изучения подвижности. При наличии типичных изогнутых в виде "рогов вола" палочек, совершающих стремительные движения, культуральную жидкость пипеткой (несколько капель) пересевали на шоколадный агар, осторожно наклоняя чашку для равномерного распределения жидкости, и рассеивали петлей. Оставшуюся часть культуральной жидкости при этом можно использовать для посева методом "газона" на среду Мюллера-Хинтона с 5% крови барана для постановки ориентировочной антибиотикограммы. После второго инкубирования на шоколадном агаре культура вырастала в виде сплошного "газона", которую в дальнейшем использовали для биохимической идентификации (тесты на каталазу, оксидазу, уреазу). После окончательной идентификации и определения принадлежности к H. pylori, оставшуюся культуру суспензировали в физиологическом растворе в нескольких пробирках с целью сохранения культуры для дальнейших молекулярно-генетических исследований и постановки антибиотикограммы.
Результаты и обсуждение. В результате двухфазного субкультивирования на шоколадном агаре с добавлением бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой КРС, происходило накопление культуры H.pylori, рост наблюдался в виде сплошного "газона", при этом бактерии сохраняли типичные морфологические, культуральные и биохимические свойства. Предложенный способ двухфазного субкультивирования H.pylori имеет ряд преимуществ:
1) отсутствие необходимости использования дополнительного оборудования для поддержания микроаэрофильных условий в жидкой фазе среды;
2) использование стандартных питательных сред (Колумбия агара и бульона Шедлера);
3) накопление чистой культуры H.pylori в количестве, достаточном для морфологической, биохимической идентификации и определения антибиотикограммы.
Вывод. Для накопления культуры H.pylori рекомендована двухфазная среда для субкультивирования на чашках Петри диаметром 90 мм, состоящая из шоколадного агара с добавлением бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота.
ЛИТЕРАТУРА
1. Катосова Л.К. Клинико-биологическая оценка пневмотропной флоры при острых и хронических бронхолегочных болезнях у детей // Автореф. дис. д-ра биол. наук. 1990.
2. Duque -Jamaica R., Arevalo-Galvis A., Poutou-Pinales P.A., . Sequential statistical improvement of the liquid cultivation of Helicobacter pylori. Helicobacter. 2010; 15: 303-12.
3. JiangX., DoyleM.P. Growth supplements for Helicobacter pylori. // J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 1984-7.
4. Joo J.-S., Park K.- C., Song J.-Y. et al. A thin-layer liquid culture technique for the growth of Helicobacter pylori. Helicobacter. 2010; 15: 295-302.
5. Lin Y.L., LeeN., ChanE.C. Determination of optimal liquid medium for enzyme expression by Helicobacter pylori. J. Clin. Pathology. 1996; 49: 818-20.
6. Secker D.A., Tompkins D.S., Alderson G. Gas-permeable life cell tissue culture flasks give improved growth of Helicobacter pylori in a liquid medium. J. Clin. Microbiology. 1991; 29: 1060-1.
7. Shadowen R.D., Sciortino C.V. Improved growth of Campylobacter pylori in a biphasic system. J. Clin. Microbiology. 1989; 27: 1744-7.
8. Xia H.X, English L., Keane C.T. et al. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media. J. Clin. Pathology. 1993; 46(8): 750-3.
Поступила 21.11.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.862.1:579.252.55].083.18
Т.С. Скачкова, О.Ю. Шипулина, Э.А. Домонова, А.И. Субботовская*, В.С. Козырева*, В.Н. Ильина*, Г.А. Шипулин
разработка и апробация набора реагентов для выявления и количественного определения днк метициллинчувствительного и метициллинрезистентного sтAPHYLococcus AUREUS, а так же метициллинрезистентных коагулазонегативных sтAPHYLococcus spp. методом полимеразной цепной реакции в режиме "реального времени"
ФБУН ЦНИИ эпидемиологиии Роспотребнадзора, 111123, москва, ФГБУ "ННИИпК им. акад. Е.Н. мешалкина" минздрава России, 630055, Новосибирск*
Разработан набор реагентов для выявления и количественного определения ДНК метициллинчувствительных и метициллинрезистентных S.aureus, метициллинрезистентных коагулазонегативных Staphylococcus spp. в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией, обладающий высокими аналитическими и диагностическими характеристиками. Использование данного набора реагентов позволит оптимизировать эпидемиологический надзор за распространением метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus spp., значительно снизив длительность и трудоемкость исследования.
Ключевые слова: метициллинчувствительный Staphylococcus aureus, метициллинрезистентный Staphylococcus aureus, метициллинрезистентные коагулазонегативные Staphylococcus spp., диагностика, ПЦР в режиме реального времени
T.S. Skatchkova, O.Yu. Shipulina, E.A. Domonova, A.I. Subbotovskaya, V.S. Kozyreva, V.N. Ilyina, G.A. Shipulin THE DEVELOPMENT AND TESTING OF REAGENTS KIT FOR DETECTION AND QUALITATIVE EVALUATION OF DNA OF METHICILLIN SENSITIVE AND METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND ALSO METHICILLIN RESISTANT COAGULASE NEGATIVE STAPHYLOCOCCUS SPP. APPLYING TECHNIQUE OF POLYMERASE CHAIN REACTION IN "REAL TIME" MODE
FBIS "Central Research Institute for Epidemiology" of Rospotrebnadzor, 111123, Moscow, Russian Federation, FSBU "E.N. Meshalkin Novosibirsk Research Institute for Blood Circulation Pathology" of Ministry of Health of the Russian Federation, 630055, Novosibirsk, Russian Federation*
The reagents kit is developed to identify and quantitatively detect DNA of methicillin sensitive and methicillin resistant Staphylococcus aureus, methicillin resistant coagulase negative Staphylococcus spp. in biological material using technique of polymerase chain reaction with hybridizationalfluorescent detection and having higher analytical and diagnostic characteristics. The application of the given reagents kit makes it possible to optimize the epidemiologic monitoring ofpropagation of methicillin resistant strains of Staphylococcus spp. Significantly decreasing duration and laboriousness of study.
Key words: methicillin sensitive Staphylococcus aureus, methicillin resistant Staphylococcus aureus, methicillin resistant coagulase negative Staphylococcus spp., diagnostics, polymerase chain reaction in "real time " mode
Для корреспонденции:
Скачкова Татьяна Сергеевна, мл. науч. сотр. отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН ЦНИИ эпидемиологиии Роспотребнадзора
Адрес: 111123, Москва, Новогиреевская ул., 3а Телефон: (8495)-974-96-46 E-mail: skachkova@pcr.ms
В Российской Федерации по данным официальной статистики ежегодно регистрируется примерно 30 тыс. случаев инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи 0,8 на 1000 пациентов), однако эксперты считают, что их истинное число составляет не менее 2-2,5 млн [1]. В настоящее время бактерии рода Staphylococcus являются одними из ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций.
