CC BY
51
ДВИГАТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕМОЦИТОВ GROMPHADORHINA PORTENTOSA
Гребцова Елена Александровна
аспирант Федерального государственного автономного образовательного
учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский
университет», РФ, г. Белгород E-mail: shtirlitz009@mail. ru
MOTION ACTIVITY OF GROMPHADORHINA PORTENTOSA HEMOCYTES Grebtsova Elena
Post-graduate student of Belgorod National Research University,
Belgorod, Russia
АННОТАЦИЯ
Исследована подвижность гемоцитов Gromphadorhina portentosa при инкубации в различных условиях. Отмечены морфологические изменения форменных элементов гемолимфы при выполнении ими фагоцитарных функций. Показано, что интенсивность флуоресценции гемоцитов при наличии инородных объектов в среде увеличивается. Усиление флуоресценции гемоцитов позволяет говорить о высокой потребности в энергии для распознавания инородных объектов и участия в фагоцитозе.
ABSTRACT
Gromphadorhinaportentosa hemocytes motility has been studied in the presence of incubation in various conditions. Morphological changes of hemolymph formed elements are distinguished in performing phagocytic functions. It is testified that
Гребцова Е.А. Исследование подвижности гемоцитов Gromphadorhina portentosa // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2014. № 4 (5) .
URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1198
fluorescence intensity of hemocytes increase having heterogeneous objects in the environment. The fluorescence intensity allows us to speak about high energy requirements to recognize heterogeneous objects and to participate in phagocytosis.
Ключевые слова: гемоцитарная подвижность, фагоцитоз,
митохондриальный потенциал.
Keywords: hemocyte motility, phagocytosis, mitochondrial potential.
Комплекс флуоресцентных красителей используется в качестве оптического индикатора возможных различий мембранного потенциала в клетках и изолированных органеллах, которые слишком малы, чтобы проводить микроэлектродные измерения. Проникающие катионные флуоресцентные зонды избирательно накапливаются в митохондриях живых клеток. Митохондриально-специфическое взаимодействие таких молекул, по-видимому, зависит от высокого трансмембранного потенциала, поддерживаемого функционирующими митохондриями [4, с. 530]. Применение таких потенциалзависимых зондов в сочетании с флуоресцентной микроскопией позволяет проводить мониторинг митохондриального мембранного потенциала в индивидуальных живых клетках [6, c. 111]. Повышение флуоресценции митохондриально-связанных зондов наблюдается в клетках, участвующих в активном движении. Такой подход к анализу митохондриального мембранного потенциала имеет значение в исследованиях контроля энергетического метаболизма и энергетических требований конкретных биологических функций на клеточном уровне [2].
В последние годы флуоресцентные красители для измерения митохондриального мембранного потенциала (Aym) стали часто используемыми инструментами для мониторинга изменений этого важного физиологического параметра и того, как он соотносится со способностью клеток генерировать АТФ путем окислительного фосфорилирования. Рост интенсивности флуоресценции находится в прямой зависимости от повышения
значений митохондриального потенциала [5, c. 244]. Таким образом, Aym является ключевым показателем нормального или поврежденного состояния клеток и показателем физиологической активности клеток [7, c. 471].
Гемоциты составляют основу клеточного иммунитета насекомых. Плазмоциты, предполагаемые гомологи макрофагов млекопитающих, и гранулоциты Gromphadorhina portentosa представляют 70 % мигрирующей популяции циркулирующих гемоцитов [1, с. 51]. Они ответственны за апоптоз тканей, возникающих во время метаморфоза, и за фагоцитоз бактерий. До сих пор точно не известен механизм активации форменных элементов гемолимфы в ответ на инфекцию или сигналы развития.
Гемоциты G. portentosa являются подвижными, фагоциты представлены на всех этапах жизненного цикла и составляют клеточный компонент врожденной иммунной системы насекомых на постэмбриональном этапе жизни [3, с. 58]. Наиболее распространенным типом клеток являются гранулоциты и плазмоциты. Соответственно, основная функция постэмбриональных гемоцитов состоит в уничтожении вторгающихся микроорганизмов, а также фрагментов апоптотических клеток [5, c. 246].
Целью работы стало изучение влияния различной осмолярности среды на морфологические показатели, двигательную активность и уровень энергетического метаболизма гемоцитов Gromphadorhina portentosa.
Материалы и методы
Для изучения особенностей поведения гемоцитов полученную из насекомого гемолимфу инкубировали отдельно в физиологическом растворе, а также с добавлением клеток Saccharomyces cerevisiae, в гипо-и гипертонической средах.
Для оценки уровня энергетического метаболизма в гемоцитах использовали краситель родамин B. Для приготовления рабочего раствора родамин В разводили 0,15М фосфатным буфером в соотношении 1:1500, затем в 10 раз 0,9 % раствором NaCl. Инкубированные в различных средах клетки окрашивали и наблюдали за изменением интенсивности флуоресценции
с помощью конфокального инвертированного микроскопа Nikon Digital Eclipse Ti-E.
Результаты и их обсуждение
Наиболее распространенная морфология нативных гемоцитов, инкубированных в физиологическом растворе, обозначена как «нормальное распластывание» (НР), представляет полностью адгезировавшую клетку с клеточной мембраной, имеющей равномерные выпячивания и углубления. Данный тип характеризует неподвижное сидячее поведение этих гемоцитов. Два активных морфологических класса, «неполяризованный» (Не/П) и «поляризованный» (П), характерны для гемоцитов, инкубированных в среде с добавлением дрожжевых клеток. Оба класса представляют полностью адгезировавшую клетку, которая демонстрирует чрезвычайно активную клеточную мембрану, образующую выступы и углубления под различными углами по отношению к области средней точки клетки, формируя раффлы. Существенное различие между этими двумя классами то, что поляризованные клетки производят ламеллоподии.
В естественных условиях (инкубация в физиологическом растворе) среди фагоцитов состоянием нормального распластывания характеризовались 100 % клеток (рис. 1, рис. 2). При этом на поверхности гранулоцитов ризоподии были распределены равномерно, и их длина не превышала 1,5 мкм. Интенсивность флуоресценции составила 249±51 для гранулоцитов и 212±51 для плазмоцитов.
Рисунок 1. Гранулоцит (инкубация в физиологическом растворе)
Рисунок 2. Плазмоциты (инкубация в физиологическом растворе)
В гипотонической среде активность и гранулоцитов, и плазмоцитов снизилась. По истечении периода инкубации плазмоциты оказались сильно распластаны (рис. 3). Однако затраты энергии на поддержание целостности мембраны в условиях пониженного осмотического давления способствовали росту интенсивности флуоресценции, которая составила для плазмоцитов 314±28 и 387±40 для гранулоцитов.
Рисунок 3. Плазмоцит (инкубация в гипотонической среде)
В условиях повышенного осмотического давления длина ризоподий уменьшилась до 0,9 мкм. Скорость распластывания плазмоцитов значительно
снизилась (рис. 4). Интенсивность флуоресценции максимальна и достигает 554±48 для гранулоцитов и 420±36 для плазмоцитов. Изменений в подвижности по сравнению с гемоцитами, инкубированными в физиологическом растворе, не наблюдали.
Рисунок 4. Плазмоцит (инкубация в гипертонической среде)
При добавлении дрожжевых клеток к гемоцитам, находившимся в естественных условиях, доля гранулоцитов с нормальным распластыванием составила 34 %, численность поляризованных и неполяризованных гемоцитов достигала 40 % и 26 % соответственно. Среди плазмоцитов поляризованные гемоциты отсутствуют, обнаружено 92 % неполяризованных и 8 % гемоцитов с нормальным распластыванием (рис. 5). На поверхности гранулоцитов помимо ризоподий (ветвистость которых усилилась и длина увеличилась до 1,9 мкм), появились длинные филоподии длиной до 3,5 микрометров (рис. 6). Оба типа псевдоподий располагались неравномерно, чаще на одном из полюсов клеток и были направлены в сторону дрожжей.
Рисунок 5. Плазмоцит (инкубация в среде с добавлением S. cerevisiae)
Рисунок 6. Гранулоцит (инкубация в среде с добавлением S. cerevisiae)
На интенсивность флуоресценции фагоцитов сходное влияние оказывают повышенное осмотическое давление и появление в среде инородных объектов. Кроме того, интенсивность флуоресценции фагоцитов с нормальным распластыванием выше в среде с добавлением дрожжевых клеток и максимальна для гемоцитов неполярных и поляризованных (таблица 1). Усиление флуоресценции гемоцитов позволяет говорить о высокой потребности в энергии для распознавания инородных объектов и участия в фагоцитозе.
Таблица 1.
Интенсивность флуоресценции гемоцитов различной морфологии
Г ранулоциты Плазмоциты
НР Не/П П НР Не/П
346±60 581±67 596±82 245±48 425±54
Выводы:
1. В ходе исследования было установлено наличие трех морфологических форм гемоцитов, отличающихся типом псевдоподий и характером их расположения.
2. Два активных морфологических типа гемоцитов — «неполяризованный» и «поляризованный» — формировались при попадании в среду инородных биологических объектов.
3. Инкубация форменных элементов гемолимфы в средах, отличных от физиологического раствора, приводит к росту интенсивности флуоресценции гемоцитов, что говорит о повышении уровня их энергетического метаболизма.
Список литературы:
1. Гребцова Е.А., Присный А.А. Определение мембранного резерва гемоцитов Periplaneta americana и Blaberus craniifer и изучение влияния гипоосмотической нагрузки на объем клеток // Научные достижения биологии, химии, физики: тезисы докл. межд. заочной науч.-практ. конференции. (г. Новосибирск, 7 ноября 2012 г.). — Новосибирск, 2012. — с. 51—56.
2. Метод морфофункциональной оценки клеточного компонента биотрансплантатов: пат. 2484472 Рос. Федерация; опубл. 10.06.2013.
3. Holz A., Bossinger B., Strasser T., Janning W., Klapper R. The two origins
of hemocytes in Drosophila // Development. 2003. V. 130. P. 55—62.
4. Johnson L.V., Walsh M.L., Bockus B.J., Lan Bo Chen. Monitoring of relative
mitochondrial membrane potential in living cells by fluorescence microscopy//
The journal of cell biology. 1981. V. 88. P. 526—535.
5. Lanot R., Zachary D., Holder F., Meister M. Postembryonic hematopoesis
in Drosophila // Dev. Biol.2001. V. 230. P. 243—257.
6. Perry S.W., Norman J.P., Barbieri J., Brown E.B., Gelbard H.A. Mitochondrial
membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide // Biotechniques. 2011.V. 50(2). P. 98—115.
7. Russell C., Scaduto Jr., Grotyohann L.W. Measurement of mitochondrial
membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives // Biophysical
Journal. 1999. V. 76. P. 469—477.
