CC BY
62
Биология
ДРОЖЖИ В БОРЬБЕ С ВОЗБУДИТЕЛЕМ ЗАБОЛЕВАНИЯ СЕРАЯ ГНИЛЬ BOTRYTIS CINEREA
О.Л. ХРАБРЫХ,
аспирант
Г.Б. БАРАЙЩУК,
кандидат биологических наук, доцент, Омский ГАУ, г. Омск, Россия ANDREAS KOLLAR, доктор
WILHELM JELKMANN
доктор, профессор, Федеральный биологический исследовательский центр сельского хозяйства и леса, Институт защиты плодовых культур, г. Доззенхайм, Германия
Была выявлена способность изолятов дрожжей подавлять рост и развитие возбудителя серой гнили Botrytis cinerea in vitro при сосуществовании микроорганизмов на агаризованной и жидкой средах. Радиальный рост патогена подавлен присутствием многих изолятов дрожжей на агаризованной среде. В жидкой среде Aureobasidium pullulans, Cryptococcus laurentii, Candida sake, Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia pulcherrima, Pichia guilliermondii, Yeastisolate 5, Yeastisolate 6, 1T2 и 2T1a оказывают негативное действие на
Серая гниль - наиболее распространенное и вредоносное заболевание, вызываемое грибом Botrytis cinerea.
Вид Botrytis cinerea на сегодняшний день - наиболее важный представитель из 22 существующих видов Botrytis. Он характеризуется огромным ареалом распространения и высокой вирулентностью в инфицировании более 200 видов растений [1], включая землянику садовую, принося огромные экономические потери хозяйствам и странам-производителям этой культуры. Использование фунгицидов позволяет сохранить урожай, но только на начальных этапах применения. Причина тому - появление устойчивых штаммов B.cinerea к применяемым химическим средствам [2]. Биологическая защита культур от действия B.cinerea возможна благодаря применению биологических агентов. Известностью в борьбе с серой гнилью пользуются бактерии рода Pseudomonas и Bacillus, грибы рода Trichoderma, на основе этих микроорганизмов созданы коммерческие препараты. Дрожжи также рассматриваются как потенциальные биологические объекты, и в последнее время привлекают к себе огромное внимание в силу того, что действуя, в основном через конкуренцию за питательные вещества и нишу, они не синтезируют токсические вещества, которые каким-либо образом могут оказать негативное влияние на здоровье человека, животных и окружающую среду [3]. Однако не так много работ посвя-
щено взаимоотношениям B. cinerea и дрожжей in vitro, что явилось побудительной причиной для осуществления наших экспериментов.
Цель и методика исследования
Цель работы - выявление способности различных изолятов дрожжей подавлять рост и развитие возбудителя серой гнили Botrytis cinerea в лабораторных условиях in vitro с целью их дальнейшей апробации в качестве биологических агентов в полевых условиях для защиты сельскохозяйственных культур от серой гнили. Положительный момент работы - тот факт, что разнообразие дрожжей, используемых в экспериментах, находятся в Банке микроорганизмов и клеточных культур Германии и в университете Heidelberg (Германия), которые могут быть приобретены для дальнейших научных исследований с целью практического применения.
Для постановки экспериментов использовался штамм B. cinerea 63375. Чашки Петри размером 80 мм с карто-фельно-декстрозным агаром, содержащие мицелий B. cinerea, выращивались в термостате при температуре 23°С до момента образования обильного спо-роношения. Сбор спор B. cinerea осуществлялся добавлением в чашку Петри 5 мл дистиллированной воды с содержанием 0,05 % раствора Tween 80, по методике, использованной Сансоне и коллегами. [4]. Для этого 100 % раствор Tween 80 пропускался через
фильтр диаметром 0,02 |jm (Minisart, Single use filter unit, SARTORIUS), разбавлялся дистиллированной водой для получения нужной концентрации. Собранные споры отделялись от мицелия при помощи сепаратора Sterile Cell Strainer “FALCON” (40 mm Nylon). Дву-
The ability of yeasts to inhibit the growth and development of the fungus Botrytis cinerea causes grey mould was detected in vitro during co-culturing the micro organisms on agar plates and in liquid conditions. The radial growth of the pathogen was inhibited in the presence of many tested yeasts on agar plates. in liquid, Aureobasidium pullulans, Cryptococcus laurentii, Candida sake,
Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia pulcherrima, Pichia guilliermondii, Yeastisolate 5, Yeastisolate 6, 1T2 and 2T1a showed a negative influence on spores of B. cinerea and reduced the germ tube length of the fungus.
кратным центрифугированием в течение 5 минут при 6000 об/мин был получен чистый споровый осадок, в который добавлялся очищенный через фильтр глюцерол с целью длительного хранения. В таком виде споры B. cinerea хранились в морозильной камере при -80°С в течение всего экспериментального периода. Для инокуляции концентрация спор в рабочем растворе доводилась до 3*106 спор/мл добавлением стерильной деонизиро-ванной воды. Количество спор в растворе определялось гемоцитомет-ром.
Изоляты дрожжей. В эксперименте по выявлению способности дрожжей подавлять рост и развитие Botrytis cinerea использовались 14 изолятов дрожжей, любезно предоставленных доктором A. Lindner, университет Heidelberg, Германия (таблица 1).
Дрожжи культивировались на дрожжевом солодовом агаре (21 г дрожжевой солодовый бульон (SIGMA, Steinheim, Germany), 15 г агара (Agar Agar SERVA highgel-strength) на 1 л де-онизированной воды) в течение двух дней при температуре 270С. В течение месяца изоляты хранились в холодильнике при +20С, запаянные парафиновой лентой. После месячного хранения, инокулюм переносился на свежеприготовленную среду. Для приготовления рабочей суспензии дрожжей использовались 100 мл колбы, на 1/5 заполненные дрожжевым солодовым бульоном (20 мл). Инокуляции жидкой среды осуществлялась петлей, после чего кол-
бы помещались на ротационный шей-кер для культивирования в течение 12 часов при 200 об/мин и 270С [5]. Количество клеток дрожжевых изолятов в суспензии определялось гемацитомет-ром. Для этого суспензия после культивирования центрифугировалась при 6000 об/мин в течение 10 мин. Образовавшийся осадок промывался дважды водой и отмывался от остатков культуральной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок разбавлялся стерильной дистиллированной водой. Концентрация рабочей суспензии стерильной дистиллированной водой доводилась до 1 *107 клеток/мл.
Инокуляция агаризованной среды дрожжами и B. cinerea. ля анализа сосуществования изолятов дрожжей и B. cinerea агаризованная дрожжевая солодовая среда
инокулировалась 0,02 мл рабочей суспензией дрожжей. Рядом с дрожжевой суспензией был нанесен инокулюм гриба - патогена B. cinerea. в объеме 0.02 мл в концентрации 3*106 спор/мл. В качестве контроля применялась стерильная деонизированная вода. Ино-кулированные чашки помещались в термостат при температуре 230С на экспериментальный период. Наблюдения за ростом и развитием B. cinerea в присутствии дрожжей проводились после шести дней инкубации. Опыт повторялся три раза, в двукратной повторности.
Обнаружение антагонистических отношений между дрожжами и B.
Биология
cinerea проводилась также при условии предварительной инокуляции ага-ризованной среды дрожжами [6]. Для этого агаризованная картофельно -декстрозная среда (39 г на 1 л деони-зированной воды) в чашках Петри размером 80 мм инокулировалась рабочей суспензией дрожжей в объеме 0.1 мл и концентрации 1*107 клеток/мл. Стерильным стеклянным шпателем указанный объем рабочего раствора аккуратно, без повреждения агаризо-ванной среды, распределялся по всей поверхности чашки Петри. Через 15 мин. инокулюм B. cinerea в объеме 0,01 мл в концентрации 3*106 спор/мл помещался в центр чашки Петри с содержанием дрожжей. В качестве контроля применялась стерильная део-низированная вода. Инокулированные чашки помещались в термостат на двухнедельный период, где хранились при температуре 230С. Радиальный рост B. cinerea измерялся после шести, 12-ти дней инкубации. Рост измерялся в мм, опыт повторялся три раза, в двукратной повторности.
Инокуляция жидкой среды. Стерильные стеклянные пробирки объемом 10 мл наполнялись картофельно-декст-розным бульоном (24 г на 1 л деонизи-рованной воды) в объеме 5 мл. Среда в пробирках инокулировалась 0.1 мл B. cinerea в концентрации 3*106 спор/мл. После чего следовала инокуляция жидкой среды в объеме 0,1 мл изолятами дрожжей в концентрации 1 *107 клеток/ мл. Колбы помещались на ротационный шейкер на 20 час при температуре 250С и 50 об/мин [5]. По истечении временного периода наличие антагонизма между B. cinerea и дрожжами определялось микроскопически, используя микроскоп марки Leika DM4000B. Содержимое пробирок перед началом микроскопического анализа взбалтывалось для получения однородной массы без осадка. 0,01 мл суспензии наносилось на предметное стекло и анализировалось под микроскопом, сравнивая с контрольным вариантом, где вместо дрожжей использовалась деонизированная вода.
Результаты. Выводы
Сосуществование дрожжей и B. cinerea на агаризованной среде. Цель эксперимента заключалась в выявлении способности изолятов дрожжей ингибировать рост и развитие B. cinerea при одновременной инокуляции агари-зованной среды микроорганизмами. Визуальный обзор чашек Петри на наличие признаков роста B. cinerea в присутствии различных изолятов дрожжей после шестидневного культивирования показал, что во всех вариантах присутствует одинаковый характер роста патогена, без признаков ингибирования, сравнимый с контрольным вариантом. При данных условиях и концентрациях инокулюма B.cinerea и дрожжей, равных 3*106 спор/мл и 1*107 клеток/мл соответственно, дрожжи не оказывают негативного влияния на рост и разви-
Табл. 1
Изоляты дрожжей
Иг Изылят Источник
1. Aureobasidiwn pulhiiam CF 10 Bio-Protcct GmbH;. Konslanz, Германия
2. Aursobctsidiwn puí/uíújíí Cï'40 Rio-Protect GmbH.. Konslanz, Германия
3. Cryvtococcus laureiïfti DKM 70766 DSMZ (Банк микроорганизмов и клеточных культур Германии)
4. (Janàida sake DKM 70763 D3MZ (Банк микроорганизмов и клеточных культур Германии)
5. Gferomyces matriUmii DSM 70187 D3MZ (Банк микроорганизмов и клеточных куш.тур Гермаїии)
б. Hananienpora uvarufii DSM 2760 D3MS (Банк микроорганизмов и клеточных культур Германии)
7. Pichia anómala DSM 6766 DSMZ (Банк микроорганизмов и клеточных культур Германии)
8. Pichia gii.HHermondn DSM £381 DSM2 (Байк микроорганизмов и клеточных культур Гермаиии)
9. Meisdniikowia pulcherrifna 3 университет Heidelbeig, Гермакия
10. Meischfiikuwia pukherrifna 4 университет Heidelberg, Германия
11 Meischfiibuwia pukherrima MSK і университет Heidelberg, Г ермания
12. Yeasfisolate 5 университет НеісіеІЬещ, Г ермания
13. Yeasfisolate 6 университет Heiaclberg, Г ермания
14. 1T2* униве рс ите т Н eicie ib erg, Германия
15. 2Tla* университет Heidelberg, Г ермания
изоляты дрожжей, выделенных с поверхности яолок сорта lopas їм
Рис. 1. Радиальный рост B.cinerea при культивировании на среде, предварительно инокулированной изолятами дрожжей в объеме 0,1 мл и концентрации 1 * 107 клеток/мл после шести и 12 дней культивирования. Концентрация B. cinerea равна 3 * 106 спор/мл. Границы показывают стандартную ошибку средней
Рис. 2. Радиальный рост B. cinerea при культивировании на среде, предварительно инокулированной изолятами дрожжей в объеме 0,1 мл и концентрации 1 * 107 клеток/мл после шести и 12 дней культивирования. Концентрация B. cinerea равна 3 * 106 спор/мл. Границы показывают стандартную ошибку средней
тие патогена. При данной концентрации дрожжи не выдерживают конкуренцию за питательные вещества и нишу, которая, по мнению многих авторов, является основным механизмом действия многих используемых дрожжей [7,8].
Параллельно эксперименту по выявлению способности дрожжей ингибировать рост и развитие B. cinerea при одновременной инокуляции агаризован-ной среды микроорганизмами был рассмотрен эксперимент по обнаружению антагонистических свойств дрожжей по отношению к возбудителю серой гнили при условии предварительной инокуляции агаризованной среды дрожжами.
Влияние изолятов дрожжей на радиальный рост B. cinerea. Цель данного эксперимента заключалась в обнаружении способности изолятов дрожжей ингибировать рост B. cinerea при условии предварительной инокуляции агаризованной среды потенциальными биологическими агентами. Для этого дрожжевая солодовая среда инокули-ровалась изолятами дрожжей в концентрации 1*107 клеток/мл в объеме 0,1 мл. После распределения данного объема по поверхности чашек Петри центральная часть инокулировалась споровой
суспензией B. cinerea в концентрации 3*106 спор/мл и объеме 0,01 мл. Радиальный рост гриба-патогена измерялся после шести и 12 дней культивирования.
Радиальный рост B. cinerea в контрольном варианте отличался ритмичным характером, составляя 29,67 мм после шестидневного культивирования, и достигая 38.67 мм после 12 дней культивирования, охватив всю среду (см. рис.1).
Максимальный рост B. cinerea после шести дней культивирования на агаризованной среде с содержанием изолятов дрожжей отмечен в вариантах с применением Citeromyces matritensis DSM 70187, Metschnikowia pulcherrima MSK 1 и Pichia anomala DSM 6766, который составил 16,17 мм, 5,5 мм и 4,17 мм соответственно (См. рис.1, рис.2).
Однако после 12 дней культивирования рост патогена увеличился значительно только в присутствии Citeromyces matritensis DSM 70187 и Pichia anomala DSM 6766, достигая 36,33 мм и 20,67 мм соответственно, свидетельствуя о неспособности данных изолятов ингибировать рост патогена при условии предварительной инокуляции агаризованной среды.
Биология
Дрожжи Cryptococcus laurentii DSM 70766, Candida sake DSM 70763, Hanseniaspora uvarum DSM 2768, Pichia guilliermondii DSM 6381, Metschnikowia pulcherrima 3, Metschnikowia pulcherrima 4, Yeastisolate 5, Yeastisolate 6, 1T2, 2T1a способны ингибировать рост и развитие патогена, так как во всех вариантах B. cinerea характеризовался слабым ростом после шести и после 12 дней культивирования. Полное отсутствие роста патогена наблюдалось в присутствии дрожжей Aureobasidium pullulans CF10 и Aureobasidium pullulans CF40, что говорит о способности данного вида дрожжей ингибировать рост и развитие B. cinerea при условии предварительной инокуляции среды.
Помимо экспериментов по выявлению антагонистических свойств дрожжей по отношению к B. cinerea на агари-зованной среде было интересным проанализировать характер
взаимоотношений микроорганизмов в жидкой среде.
Ингибирование роста и развития B. cinerea в жидкой среде. Цель эксперимента заключалась в обнаружении способности изолятов дрожжей ингибировать рост и развитие B. cinerea в жидкой среде при условии одновременной инокуляции среды микроорганизмами. При анализе существенным являлось имеет ли анализируемый раствор споры гриба - патогена B. cinerea и в каком состоянии они находятся.
В контрольном варианте, где вместо антагониста использовалась стерильная деонизированная вода, после 20 часов культивирования отмечено скопление проросших спор с образованием больших кластеров (рис. 3).
Подобное количество проросших спор B. cinerea с образованием длинного мицелия характерно для варианта с применением Citeromyces matritensis DSM 70187 в качестве антагониста, что еще раз опровергает научную гипотезу о способности данного дрожжевого изо-лята выступать в роли биологического агента в борьбе с B. cinerea.
Что касается Pichia anomala DSM 6766, в присутствии которого в предыдущем эксперименте был отмечен значительный рост B. cinerea после 12 дней культивирования на агаризованной среде, то и в жидкой среде в присутствии данного изолята обнаружено небольшое количество проросших спор патогена, которые в единичных случаях образуют малые кластеры. Средняя длина зародышевой трубки при этом составляет 0,033 мм. Подобный характер роста патогена замечен в вариантах при использовании 2T1a и Aureobasidium pullulans CF10, где единично проросшие споры формируют небольшие кластеры с длиной зародышевой трубки 0,0236 в случае с изолятом 2T1a и длинный мицелий, составляющий 0,1427 мм, в случае с Aureobasidium pullulans CF10. Тем не менее в обоих вариантах после 20 часов культивирования количество
Биология
Щ w. Г I
• !.
Контроль Сryptococcus laurentii Candida sake Citeromyces matritensis Yeastisolate 5 Yeastisolate 6
Is
Контроль .-1 ureobasidium pullulans CF10 A ureobasidium pullulans CF40 Metschnikowia pulcherrima 3 Metschnikowia pulcherrima 4 Metschnikowia pulcherrima MSK
Контроль Hanseniaspora uvanim Pichia Pichia 1T2 2Т1а
anómala guiUiermondii
Рис. 3. Рост и развитие B. cinerea при культивировании в жидкой среде в присутствии изолятов дрожжей. Микрофотографирование осуществлялось при помощи микроскопа марки Leika DM4000B, при пятикратном
увеличении
проросших спор B. cinerea было существенно ниже, сравнивая с контролем. Основываясь на данном наблюдении и принимая во внимание результат предыдущего опыта, из которых следует, что данные изоляты ингибируют рост патогена на агаризованной среде, можно сделать вывод, что 2T1a и Aureobasidium pullulans CF10 эффективны в борьбе с B. cinerea.
При использовании Aureobasidium pullulans CF40, Cryptococcus laurentii DSM 70766, Metschnikowia pulcherrima 4, Metschnikowia pulcherrima MSK 1, Pichia guilliermondii DSM 6381, Yeastisolate 5, Yeastisolate 6 в качестве антагониста в анализируемых растворах присутствовали только единичные проросшие споры патогена, свидетельствуя об антагонистических свойствах перечисленных штаммов дрожжей по отношению к B. cinerea.
Анализируемые растворы в вариантах с применением Hanseniaspora uvarum DSM 2768, Metschnikowia pulcherrima 3 и 1T2 были насыщены клетками дрожжей, среди которых едва распознаваемы были единичные непроросшие и проросшие споры B. cinerea, составляя среднюю длину зародышевой трубки 0,0002, 0,0018 мм и 0,0015 мм соответственно. При использовании же Candida sake DSM 70763 замечено полное отсутствие спор патогена. Данные изоляты дрожжей, как показывают результаты, во-первых, негативно действуют на споры B. cinerea, о чем свидетельствует их ничтожно малое количество при анализе, а, во-вторых, ингибируют рост зародышевой трубки.
Предположительно, причина положительного эффекта многих используемых дрожжей против B. cinerea зак-
лючается в способности дрожжей конкурировать за питательные вещества или же синтезе литических энзимов, деградирующих клеточную стенку Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что дрожжи Aureobasidium pullulans CF10, Aureobasidium pullulans CF40, Cryptococcus laurentii DSM 70766, Candida sake DSM 70763, Hanseniaspora uvarum DSM 2768, Metschnikowia pulcherrima 3, Metschnikowia pulcherrima
4, Metschnikowia pulcherrima MSK 1, Pichia guilliermondii DSM 6381, Yeastisolate 5, Yeastisolate 6, 1T2 и 2T1a проявляют антагонистическую активность по отношению к B. cinerea. Существует возможность для апробации данных изолятов in vivo с целью рассмотрения их в качестве биологических агентов в экологически чистой борьбе с серой гнилью.
Литература
1. Wubben J.P., Mulder W., Ten Have A., van Kan J.A.L., Visser J. Cloning and characterisation of endopolygalacturonase genes from Botrytis cinerea // Applied and Environmental Microbiology.- 1999. - Vol. 65 (4).- P. 1596-1602
2. Brent, K.J., Hollomon, D.W. Fungicide resistance: the assessment of risk // FRAC Monograph. - 1998. - N. 2, Brussels
3. Smilanick, J.L. Strategies for the isolation and testing of biocontrol agents. In: Wilson, C.L., Wisniewski, M.E. (Eds.), Biological Control
of Postharvest Diseases: Theory and Practice // CRC Press, Boca Raton. - 1994.- P. 25-42
4. Sansone, G., Rezza, I., Calvente, V., Benuzzi, D., Sanz de Tosetti, M. I. Control of Botrytis cinerea strains resistant to iprodione in apple with rhodotorulic acid and yeasts // Postharvest Biology and Technology.- 2005. - Vol. 35.- P. 245-251
5. Xiaodong Zheng, Hongyin Zhang, and Yufang Xi. Effects of Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner on biocontrol of postharvest decay of arbutus berries // Bot.Bull. Acad. Sin. - 2004. - Vol. 45.- P. 55-60
6. Reyes, M. E. Q., Rohrbach, K. G., Paull, R. E. Microbial antagonists control postharvest black rot of pineapple fruit // Postharvest Biology and Technology. - 2004. - Vol. 33.- P. 193-203
7. Spadaro, D., Vola, R., Piano, S., Gullino, M. L. Mechanisms of action, efficacy and possibility of integration with chemicals of four isolates of the yeast Metschnikowia pulcherrima active against postharvest pathogens on apples // Postharvest Biol. Technol. - 2002. - Vol. 24. P. 123-134
8.Chand - Goyal, T. and Spotts, R. A. Control of postharvest pear diseases using natural saprophytic yeast colonists and their combination with low dosage of thiabendazole // Postharvest Biol. Technol. - 1996a. - Vol. 7.- P. 51-64.
